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甘蔗胚性细胞团和愈伤组织某些性质的比较 ,
罗紫娟 唐典禧 梁倩华 石贵玉
( 广西师范大学生物系 )
摘要 在培养24 天的生长周期中 , 胚性细胞团的分裂细胞数共出现三次高峰 . 第一次出现在继代后的第 8
天 , 第二次出现在第 12 天 ; 第三次出现在第 18 天 . 其中以第二次高峰期的细胞分裂数量最多 . 愈伤组织中仅
观察到两次高峰 , 第一次出现在第 12 天 , 第二次出现在第妞天 。 细胞分裂数比胚性细胞团少 . 细胞分裂高峰出
现得迟可能愈伤组织比胚性细胞团生长缓慢的一个重要因素,
不同细施分裂高峰时期胚性细胞团的 0 N A 和蛋白质均比相同时期的愈伤组织含贵高 . 高峰期在第 12 和 第 18
天 , 这与内部的 D N A 和蛋白质含最变化是一致的 . 这说明催社细胞团具有较快分裂能力的原因之一
胚性细胞团的过氧化物酶同工酶带也多于愈伤组织 . 酶带染色较深 , 表示酶活性高 . ,
广西甘蔗组织培养育苗是以胚性细胞团 〔’ 」进行继代繁殖和分化得到绿苗的 。 一般来讲 ,
胚性细胞团生长较快 , 易于形成胚状体 , 因此成苗率高 ; 而愈伤组织生长较慢 , 通过器官发生
的小植株较少 , 因此繁殖率较低 , 所以选择合适的胚性细胞团有利于试管苗的扩大生产和工
厂化。 本文从分裂细胞数 , D N A和蛋白质的含量以及过氧化物酶同工酶电泳谱带来说明胚性
细胞团和愈伤组织间存在的某些差异 , 为说明胚性细胞团生长速度较快和成苗率高提供某些
依据 。 - - - 一
: 材料和方法
1
. 材料: 桂搪 n 号的愈伤组织和胚性细胞团 。
愈伤组织培养在 N 。 + 2 , 4 一 D 3 m g / L + K T l m s / L + L H s o o m g / L + N A A o . s m g / L + 白
搪 4 % + 凉脂。 . 5%的培养基上 , 而胚性细胞团则培养在去除 L H 的相同培养基上 。 培养室温
度为 2万一 28 ℃ , 白天用切瓦的日光灯照射 10 小时 。
2
` 细 胞分裂数的侧定 : 把培养不同天数的胚性细胞团和愈伤组织制成切片 , 进行 孚 尔
根和温纳染色 【2 1 , 一 对各个时期的切片进行仔细的检查 , 然后在显微镜下统计细胞分 裂 数。
切片制成后 , 1从每个材料中选取比较典型的切片 , 霄选取三个细胞分裂数最多的视野 ( 放大
20 0倍 , 染色质开始集缩的前期 、 中、 后期都属细胞分裂期 ) 进行计数 , 用平均数表示 每 个
视野的细胞分裂数。
3
。 核酸含量的测定 : 用二苯胺法测定组织中D N A 的含量 。
根据分裂细胞数的测定 , 我们把测定时间选择在继代培养后的第八 、 十二 、 + 八 、 二十
四天 。
D N A 的提取方法 :
( 1 ) 取鲜材料 0 . 5克加 o . s m l研磨缓冲液 ( 称取 26 . 29 8克氯化钠 , 1 3 . 2 35 克柠檬酸三 钠
盐 , 3 7 . 23克 E D T A 分别溶解 , 一起定容至 1 0 0 0m l , 并用 2 0% N 。 o H调节 p H至 7 . 0 ) 和 1%样品 量
的十二烷基硫酸钠 , 研磨成浆状物为止 。 加等体积的氯仿 一异戊醇 ( 24 : 1 ) 翩烈摇动 30 秒
钟 , 离心 5 分钟 ( 4 0 0 0转 /分 ) 。 ( 3 )取上清液于 72 ℃水浴保温 3 一 4 分钟 , 冰箱冷却至 室
温 。 ( 4 )加入 4 : l 倍 S M高氯酸 L提取液为 4 m l , 高氯酸为 1 m l ) 。 ( 5 )加等体积的氯仿
, 异戊醇 ( 24 : 1 ) , 剧烈摇动 30 秒钟 , 离心 5分钟 ( 4 。。 0转 /分 ) 。 ( 6 )取上清液 , 慢慢
1 期 芝紫娟多二 -甘蔗胚性细胞团和愈伤组织某些性质的比较
加入 2倍体积9 5% 乙醇 , 然后用玻璃棒轻搅至核酸沉淀〔如玻璃棒挑不起核酸的沉淀 物 , 则
离心场分钟 ( 4 0 0 0转 /分 ) 〕。 ( 7 )将沉淀物溶于适量 0 . 1 x s C C , 溶解后 , 加入等于溶液的 1210
体积量的 10 x s c c , ( 8 )重复上述步玻 ( 6 ) ( 7 ) , 即得 p N A 粗制品 。 ( 9 )市售酵母 R N A阵。。 2
克溶于 50 毫升 o · 1 5M氯化钠溶液 ( 用 H “ 1调 p H S ) , 并在 80 ℃水浴中保温10 分外 .进行预处
理 。 加预处理的 R N A 酶 ,使溶液含酶约 70 gu /毫升 , 在 37 ℃水浴中保温 3。分钟。 ( 10) 加等体 积
氯仿一异戊醇 ( 2 ` : 1 ) 离心 5 分钟 ( ` 0 0 0转 /分 ) 。 ( x l )重复 ( 6 ) ( 7 )步 霖 , 即得纯D N A
提取液。 ( 注 s C C为氯化钠 一 柠檬酸三钠缓冲液 ) 。
分别取 2 m l胚性细胞团和愈伤组织的纯D N A提取液于试管中 , 加入 4 m l二苯胺溶液 ,
充分混合后在室温 ( 约 20 ℃ ) 下放置 24 小时 , 然后在 7 21 型分光光度计 6 o on m 处测 光 密度
o D 。 。 。值。 另取一试管加入 Z m l 0 . 5N H e l o `和 4 m l二苯胺溶液作对照 。
4
. 蛋自质含量的测定 : 用 F ol in 酚试剂法 〔` ]测定组织中的蛋白质 。
称取样品 l 克 , 放冰箱 1小时后 , 加入提取缓冲液 ( 。 . 1 M F r i卜 H cl 缓冲液 , pH S , 内
含 0 . 5 M蔗搪 , 。 . 6m M抗坏血酸和 0 . 6m M半脆氨酸 ) 10 m l , 在水浴中研成匀浆 , 离心 10 分
钟 ( 3 5。。转 /分 ) , 取上清液再离心 15 分钟 ( 4 0 0。转 /分 ) , 将上清液用水稀释 0J 。倍 。 取。 . 6
m l样品 , 加 3 m l o 。 ZM三经基氨基甲烷溶液 , 10 分钟 , 再加 o . 3m l 0 . 2M cH l , 30 分钟后用 7 21
型分光光度计比色。 以等量蒸馏水加试剂为对照 。
5
。 过氧化物酶同工酶: 用聚丙烯凝胶电泳进行分析 . 称 30 o m g材料中加入 1 m l提取缓冲
液进行提取 。 加 样 最为
3 0微升 。 电泳后 采 用 联
苯胺一 愈伤木酚法染 色。
实脸结果
1
. 愈伤组织 和 胚 性
细饱团中细胞分 裂状 况
翻界献碳尔象举
(培养天数 )
· 图 1胚性细饱团和愈伤组织不同时期分裂细胞数
I
、 胚性细施团: I 、 愈伤组织 _ -
从图 1可以着到 , 细胞分裂数基本上皇周期性变化 , 并且无论是胚性细胞团还是愈伤 组
织 , 每个周期所经历的时间基本上都最攀夭 。 培养“ 4天为一生长期里 , 发现培养一个月左右
而尚未维代的胚性细胞团和愈伤组织 , 细胞分裂 已趋于停止 。 这种胚性细胞团和愈伤组织转
管继代培养的那天为 0 天 , 以后逐渐恢复分裂 。 胚性细胞团继代后 的第六天开始出现通过平
周分翻而形成的胚性细胞团 , 在这些新的细胞团中 , 细胞排列很有规律 , 这与曾吉恕所观察
到的胚性细胞团中的排列是一致的 【” 】。 由于刚从一个细胞分裂形成的两个细胞 , 所 以 形 状
相似 , 排列整齐而紧密 , 体积比周围细胞小 。 胚性细胞团到了继代的第 8 天 , 细胞分裂数达
到第一个高峰 , 第二次出现在继代后豹第12 天 , 第三次在继代后的第18 天 , 胚性细胞团共出
广 植…咚鑫 …… 」二 ~_ _ … 。一二 二 .。 … …酉 …掉 ._煦 ._ 二 二一 、二 二 ~_ _ _ 一_ , 二… 5 眷, … ~现三次高峰期 , 其中以第二次高期的细胞分裂数量最多 。 愈伤组织在最初有一段停滞期 , 到
第 9 天有些细胞才恢复分裂 , 第一个高峰期在第 12 天 , 第二次在第 18 天 , 共观察到两个高峰
期 。 细胞分裂高峰的差异可能是愈伤组织比胚性细胞团生长慢的一个重要原因 , 而且同一时
期的细胞分裂数也中胚性细胞团少 ( 见表 ) 。
2
. 蛋白质和核酸含量的比较
不同细胞分裂高峰时期的愈伤组织和胚性细胞团中蛋白质和核酸含量比较结果见表 。
表 不同细胞分裂高峰时期愈伤组织和胚性细胞团 中蛋白质和核酸含量的 比较一爪万
从表中可以看出在继代培养后第 8 天 、 12 天 、 18 天和 24 天的胚性细胞团中的蛋白质和核
酸含量均高于相同时期内具有较高的分裂活动 。 此外 , 从几个细胞分裂高峰活动最旺岛 此
翩渊脚日ǐ B日票阴鑫以目洲曰A
时蛋 白质和核酸含量亦最高 , 无论胚性细
胞团还是愈伤组织均是如此 。
3
. 过氧化物酶同工酶谱带比较
甘蔗胚性细胞团中过氧化物酶同工酶
谱带多于愈伤组织 , 且染色较深
(图 2 ) 。
图 2 胚性细胞团和愈伤组织过氧化物酶
同工酶谱带的比较
A
. 胚性细胞团 ; B . 愈伪组织 。
_讨 论 一 叮红
广西各地甘蔗培养苗的生产单位都一致认为肠性细胞团增殖快 , 分化频率高 ,成苗率高 。
经我们实验分析 , 胚性细胞团中D N A 和蛋白质含量都比愈伤组织高。 D N A 蛋白质都是细 胞
有丝分裂的基础 , 其含量较高可能与胚性细胞团分裂和增殖多有关 et] 。 此外 , D N A 和蛋 白
质含量高 , 表明细胞代谢旺盛 , 所以过氧化物同工酶谱带多 , 活性高。
在培养的 24 天的生长期中 , 愈伤组织继代培养后有一段时间的停滞才开始细胞分裂 。 而
胚性细胞团几乎没有停滞阶段 , 所以胚性细胞团启动快。 从测定D N A 的含量来看 , 胚性细胞
团要比愈伤组织高 , 可以推测胚性细胞团的细胞可能有较多的复制单位 vI] , 因此 D N A 在一
定时间内复制快 , 合成量也较多 。 所以细胞分裂也快 , 细胞增殖快 , 分化后成苗率也高。
无论是胚性细胞团和愈伤组织分裂细胞数基本上呈周期性变化 , 每个界期所经历的时闻
基本都是 6天 。 在 2 4天培养时间内, 高峰期在第 1 2、 第珍天 , 这与内部的 D N A 和蛋白质含
量是一致的。 这为生产上提供了一定的理论依据 , 细胞团最好在生长旺盛尚未衰老的肠天左
右转管较为合适 。
参 考 文 献
〔 1〕 梁倩华 、 罗紫娟等 , 19 32 : 体细胞培养中胚性细胞团的发生和苗形成的细胞学观察 ,
广西师院学院院刊 (1 ) : 2 一 8 。
〔 2〕 丙菊生 、 杜愚琴等 , 1 9 80 : 组织切片技术 , 人民教育出版社 , 2 20 页 。
〔s 〕 北京大学生物化学实验指导 , 1 9 8 0 : 7 3一了4。
〔4〕 上海师范大学生物系 , 197 乳 生物化学实验 , 上海科学出版社 , 1 1 7一 120 0 .
淘 曾吉恕 , 1 979 : 甘蔗体细胞培养中的胚状体发生 。 植物牛理学报 , 5 〔4〕. 4 1 1一 4 1“ 。〔6〕 C · w · 普列斯谷脱〔美〕著 , 张伟成等译 , 1 9 8。: 真核细胞的索殖 , 科学出版社 ,
1 0一 1 0 7 。
〔7〕 朱激主篇 , 19 3 2 : 植物染色体技术 , ( 4 ) : 科学出版社 。
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T il e e e l l d i v i s i o n a n d d i v i s i o n p。吐 o f e a l l u s a P p o a r e d l a t e r t h a n t h e e m b r y o i d s ,
5 l o w g r o w t h o f t h e e a l皿u s i s l i k e l y a n i m P c r t a n t e a u s e 。
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玉气 . , 娜 认