全 文 ：核 农 学 报 2012，26(3) :0615 ～ 0622
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2011-07-08 接受日期:2012-03-01
基金项目:青藏高原甘肃甘南社区生态畜牧业关键技术集成与模式示范(201203010) ，甘肃牧区优质饲草生产技术研究与示范(201003023) ，牧
草种质资源保护与利用(NB2130135) ，国家牧草产业技术体系专项(CARS-35)
作者简介:李玉珠(1979-) ，女，陕西宁强人，博士研究生，主要从事牧草和草坪草种质资源保护与育种的研究。E-mail:liyz@ gsau． edu． cn
通讯作者:师尚礼(1962-) ，男，甘肃会宁人，教授，主要从事牧草种质资源保护与育种的研究。E-mail:shishl@ gsau． edu． cn
文章编号:1000-8551(2012)03-0615-09
代谢互补抑制剂碘乙酰胺和罗丹明对 3 种豆科
牧草原生质体活力和再长的影响
李玉珠 师尚礼 陶 茸
(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，
中美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)
摘 要:研究了不同浓度代谢互补抑制剂碘乙酰胺(IOA)和罗丹明 6G(R-6G)处理与里奥百脉根(Lotus
corniculatus L． cv． Leon)、扁蓿豆(Melilotoides ruthenica (L．)Sojak)及清水紫花苜蓿(Medicago sativa L．
cv． Qingshui)3 种豆科牧草愈伤组织原生质体活力和再生力之间的相关性。结果表明，3 ～ 10mmol /L 的
IOA 和 40 ～ 70μg /ml 的 R-6G 分别处理 10min，可使 3 种豆科牧草原生质体的活力及植板率明显下降，
各处理浓度与原生质体活力和植板率之间均存在极显著的负相关(p ＜ 0. 01)。培养第 7 天，所有处理
均可见再生的小细胞团;培养 30 ～ 40d，抑制剂临界浓度下原生质体丧失形成愈伤组织的能力。IOA 对
原生质活力的抑制作用更明显，R-6G 对植板率的影响更显著，并可使原生质体发出红色荧光，有利于细
胞融合时亲本原生质体的标识。适宜 3 种豆科牧草的抑制剂及临界浓度分别是:百脉根 5mmol /L IOA
或 50μg /ml R-6G;扁蓿豆 7mmol /L IOA 或 70μg /ml R-6G;清水紫花苜蓿 3mmol /L IOA 或 40μg /mL R-
6G。
关键词:原生质体;代谢互补抑制剂;原生质体活力;植板率;荧光
EFFECT OF IOA AND R-6G ON VIABILITY AND REGENERATIVE
CAPACITY OF PROTOPLASTS FROM THREE LEGUME FORAGES
LI Yu-zhu SHI Shang-li TAO Rong
(Key Laboratory of Grassland Ecosystem，Ministry of Education，College of Pratacultural Science，Gansu Agricultural University，
Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province，Sino-U． S． Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability，Lanzhou，Gansu 730070)
Abstract:A study was conducted to investigate correlations among the viability，regenerative capacity of protoplasts
isolated from three legume forages (Lotus corniculatus L． cv． Leon，Melilotoides ruthenica (L．)Sojak and Medicago
sativa L． cv． Qingshui)after treated with metabolic complement inhibitors of IOA and R-6G． Results showed that the
viability and plate rate of protoplasts from three species were obviously reduced under treatments of IOA (3 ～ 10mmol /
L)and R-6G (40 ～ 70μg /ml)for 10min． The viability and plate rate of three species were significantly (p ＜ 0． 01)
negative correlated with effects of IOA and R-6G of different concentrations． All protoplasts regenerated small aggregated
cell clusters under the influence of IOA and R-6G after culture for 7 days． The development of these protoplasts was
inhibited and they could not form calli after culture for 30 to 40 days under the IOA and R-6G treatments at a critical
concentration． Compared with R-6G，IOA could apparently suppress the viability of protoplasts of the tested materials，
while R-6G could efficiently impact the plate rate of protoplasts． The protoplasts emit red fluorescence，which could be
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核 农 学 报 26 卷
used to identify parent protoplasts in the fusion process． The suitable inhibitor and critical concentrations were 5mmol /L
IOA or 50μg /ml R-6G for L． corniculatus，7mmol /L IOA or 70μg /ml R-6G for M． ruthenica and 3mmol /L IOA or
40μg /ml R-6G for M． sativa． The above results showed that this technique was extremely useful in the screening process
for selection of suitable inhibitor to inactivate protoplasts of three legume forages and R － 6G could mark protoplasts
under fluorescent light．
Key words:protoplasts;metabolic complement inhibitor;protoplasts viability;plate rate;fluorescence
原生质体融合能够在细胞水平上进行种(间)、属
间甚至科间的远缘体细胞杂交［1］，克服有性杂交不亲
和的障碍，促进异源种间遗传物质的交流，是实现作物
品质改良和种质创新的重要育种手段。碘乙酰胺
(Iodoacetomide，IOA)能抑制细胞质糖酵解过程，对细
胞造成不可逆的伤害［2］;罗丹明 6G(Rhodamine 6G)是
线粒体葡糖氧化磷酸化反应的抑制剂，可使线粒体失
活［3］。经二者分别钝化处理的 2 个亲本原生质体均丧
失了再生愈伤组织的能力，只有代谢互补的杂种细胞
才能继续生长［4］。因此，利用这 2 种代谢互补抑制来
筛选核质融合的细胞，可简化杂交融合后代的筛选程
序［5］，是筛选体细胞杂种的常见方法［6 ～ 8］。
豆科牧草是世界各国草地农业生产的重要组成部
分，作为蛋白质饲料来源、生物固氮资源、生态保育的
重要组分，在畜牧业生产、草田轮作、环境保护和建设
方面发挥着极其重要的作用［9］。与水稻、小麦等农作
物相比，豆科牧草体细胞杂交技术起步晚，研究少且多
集中在苜蓿属［10 ～ 13］，而采用碘乙酰胺和罗丹明处理双
亲原生质体进行体细胞杂交的研究，仅见安骥飞对苜
蓿和百脉根原生质体进行钝化处理测定各自分裂率的
报道［14］。
紫花苜蓿被称为“牧草之王”，不仅产量高，营养
丰富，还能形成根瘤进行固氮［15］，是全世界栽培最悠
久、面积最大、利用最广泛的豆科牧草［16］，但其仍有一
些品质尚待改良，如青饲易造成家畜臌胀病，耐寒性不
强，耐酸性和耐牧性差等。百脉根耐酸性强，号称“瘠
地苜蓿”［17］，其富含缩合单宁，可防止家畜臌胀病。扁
蓿豆抗寒性强，可在紫花苜蓿不能越冬生长的寒冷地
区良好生长［18］。因此，利用原生质体融合技术，将百
脉根和扁蓿豆的优良种性转移给紫花苜蓿，就有机会
获得抗寒性强、抗臌胀病的新型苜蓿种质。
本研究分别选取新近育成的刈牧兼用型野生栽培
品 种 清 水 紫 花 苜 蓿 (Medicago sativa L． cv．
Qingshui)［19］、抗寒且种子产量高的半匍匐型品种里奥
百脉根(Lotus corniculatus L． cv． Leon)［20］及广布我国
北方 地 区，营 养 价 值 高、适 应 性 强 的 扁 蓿 豆
(Melilotoides ruthenica (L．)Sojak)［18］为试验材料，在
已掌握各自原生质体分离和培养体系的基础上，探索
上述 2 种抑制剂碘乙酰胺和罗丹明对 3 种牧草原生质
体细胞质失活的效应值，以期确定使各自原生质体失
活的最佳抑制剂和适宜的作用浓度，为进一步体细胞
杂交时融合细胞的筛选提供基础数据。
1 材料和方法
1. 1 供试材料的获得
3 种豆科牧草的种子均由甘肃农业大学草业生态
系统教育部重点实验室提供。剪取各供试材料无菌苗
下胚轴(0. 5cm 长)及子叶(0. 5mm 宽)接种于 MS 愈
伤组织诱导培养基上，添加的植物生长调节剂，百脉根
为 2mg /L 2，4-D + 2mg /L KT;扁蓿豆和清水紫花苜蓿
为 0. 5mg /L 2，4-D + 1mg /L NAA + 1mg /L BA。每 15
～ 20d 进行选择继代，继代 5 ～ 6 次后，获得质地疏松、
结构致密的淡黄色或淡绿色愈伤组织，用于原生质体
的酶解。
1. 2 方法
1. 2. 1 原生质体的分离与纯化 按照本课题组所建
立的扁蓿豆、百脉根和清水紫花苜蓿原生质体酶解条
件［18，19，21］，分别从 3 种豆科牧草愈伤组织中游离出原
生质体。酶液组合及酶解时间见表 1。酶溶剂 CPW
包括 27. 2mg /L KH2PO4、101. 0mg /L KNO3、1480. 0mg /
L CaCl2·2H2O、246. 0mg /L MgSO4·7H2O、0. 16mg /L
KI、0. 025mg /L CuSO4·5H2O、5. 0mmol /L MES(2，(N-
moprholino)ethane sulfonic acid)、0. 55mol /L 甘露醇，
pH5. 8，经 0. 22μm 微孔滤膜过滤灭菌。
25℃ ± 1℃、黑暗条件下，在 30 ～ 50r /min 的摇床
上震荡愈伤组织，分离原生质体。酶解完成后将酶解
材料分别经 100、400 目无菌尼龙网筛过滤，除去未酶
解完全的组织和细胞团，滤液经 100 × g 离心 10 ～ 12
min 收集原生质体。用 CPW 酶溶剂悬浮，再离心，重
复 1 ～ 2 次。最后利用各自的原生质体培养液洗涤 1
次，并将原生质体密实细胞体积调整相同。
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3 期 代谢互补抑制剂碘乙酰胺和罗丹明对 3 种豆科牧草原生质体活力和再长的影响
表 1 3 种豆科牧草的酶液组合及酶解时间
Table 1 Combination of enzyme solution and enzymolysis time for 3 legume forages
牧草种类
legume forages
纤维素酶
cellulase onozuka R-10(%)
果胶酶
pectinase Y-23(%)
半纤维素酶
hemicellulose(%)
崩溃酶
driselase (%)
酶解时间
enzymolysis time(h)
里奥百脉根
L． corniculatus L． cv． Leon
2 0. 5 0. 3 0 12
扁蓿豆
M． ruthenica (L．)Sojak
2 0. 5 0. 3 0 12
清水紫花苜蓿
M． sativa L． cv． Qingshui
2 0. 5 0 0. 3 10
1. 2. 2 原生质体的钝化和培养
1. 2. 2. 1 碘乙酰胺处理 将 5 个浓度梯度(0、3、5、7、
10mmol /L)IOA 溶解于 CPW 溶液，pH 值均调至 5. 8，
抽滤灭菌。使用时，将纯化的原生质体悬浮于不同浓
度的 IOA 溶液中，在 25℃左右的室温下处理 5min，然
后离心 5min(100 × g) ，收集原生质体，用 CPW 酶溶剂
洗涤 2 次，再用各自的原生质体培养液洗涤 1 次。
1. 2. 2. 2 罗丹明 6G 处理 将 5 个浓度梯度(0、40、
50、60 和 70μg /ml)R-6G 溶解于含 100. 0g /L 的二甲基
亚砜(DMSO)溶液中，抽滤灭菌。处理方法同 IOA。
利用各自的原生质体培养液将原生质体密度均调
整为 1. 5 × 105 ～ 2. 0 × 105个 / L，吸取 2 ～ 3ml 悬浮于直
径为 60mm 的培养皿中，在 25℃ ± 1℃、黑暗条件下进
行液体浅层静置培养。液体培养基采用 KM8P(Kao
and Michayluk)培养基，附加 100mg /L 水解酪蛋白、
100mg /L 水解乳蛋白、1% 蔗糖、0. 4mol /L 甘露醇，附
加的激素浓度及组合参照 3 种牧草愈伤组织的诱导浓
度，pH 5. 8，抽滤灭菌。
1. 2. 3 指标测定 原生质体经培养后立即采用荧光
素双醋酸酯(Fluorescein Diacetate，FDA)法在荧光显微
镜下进行原生质体染色和活力鉴定。在活细胞内，
FDA 被酯酶裂解即发荧光，由于荧光素不能自由地通
过质膜，因而在完整的活细胞中积累起来，但在死细胞
和损伤细胞中不能积累。因此，有活力的原生质体在
荧光下发出黄绿色荧光，无活力的原生质体不发光。
随机选取 5 个视野分别统计荧光下(暗场)和普光下
(明场)原生质体的数量，原生质体活力计算公式如
下［22］:
原生质体活力 = (有活力的原生质体数 /原生质
体总数)× 100%
培养第 7 天，在倒置显微镜下测定原生质体的植
板率，每个处理观察 10 个视野，计算公式如下［4］:
植板率 =总克隆数 /(总克隆数 + 总原生质体数)
× 100%
培养第 30 ～ 40 天，观察原生质体的再生情况。
1. 3 统计分析
用 SPSS 13. 0 统计软件包中的 Compare Means 法
对试验数据进行单因素方差分析和相关性分析，差异
显著性用 Duncan 法进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 不同浓度 IOA 处理对 3 种豆科牧草愈伤组织原
生质体活力的影响
用 IOA 处理酶解出的原生质体，由图 1 可知，随
着 IOA 处理浓度的升高，3 种豆科牧草原生质体活力
的下降幅度逐渐增大。未经 IOA 处理时，3 种豆科牧
草原生质体活力平均值为 78. 0%，其中，扁蓿豆最高，
为 85. 8%，清水紫花苜蓿最低为 72. 8%。 IOA 浓度增
至 10mmol /L 时，3 种牧草原生质体活力分别降为:百
脉根 52. 0%，扁蓿豆 61. 4%，清水紫花苜蓿 50. 6%，其
中，百脉根的降幅最大，可达 30. 9%。
经相关性分析，百脉根、扁蓿豆及清水紫花苜蓿原
生质体的活力值与 IOA 浓度之间均存在极显著的负
相关，相关系数依次为 － 0. 918，－ 0. 862，－ 0. 940。清
水紫花苜蓿原生质体对 IOA 的钝化作用最敏感，
3mmol /L 的处理浓度下，其原生质体活力降幅最大，与
CK 相比，降幅达 10. 2%，百脉根次之，扁蓿豆原生质
体活力降幅最小为 5. 1%。
2. 2 不同浓度 R-6G 处理对 3 种豆科牧草愈伤组织
原生质体活力的影响
由图 2 可知，随着 R-6G 浓度的升高，3 种豆科牧
草原生质体的活力下降幅度均逐渐增大，与各自 CK
相比，差异均达极显著水平(p ＜ 0. 01)。当 R-6G 浓度
增至 70μg /ml 时，3 种牧草原生质体的活力分别降为:
百脉根 50. 8%，扁蓿豆 55. 6%，清水紫花苜蓿 49. 4%，
其中，清水紫花苜蓿的降幅最大，达 29. 6%。
经 R-6G 钝化处理后，3 种豆科牧草原生质体均被
染成红色(图 3 － A) ，在荧光显微镜下发出红色荧光
(图 4)。相关性分析表明，百脉根、扁蓿豆、清水紫花
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图 1 不同 IOA 浓度处理下 3 种豆科牧草愈伤组织原生质体的活力
Fig． 1 Protoplasts viability of 3 legume forages with different IOA treatments
图中不同小写字母表示 3 种豆科牧草各处理间的差异显著(p ＜ 0. 05) ，下图同。
Bars with different small letters are significantly different at the 0. 05 level under different controls of 3 varieties，the same as following figure．
图 2 不同 R-6G 浓度处理下 3 种豆牧草愈伤组织原生质体的活力
Fig． 2 Protoplasts viability of 3 legume forages with different R-6G treatments
苜蓿的活力值与 R-6G 浓度之间均存在极显著的负相
关，相关系数依次为 － 0. 899，－ 0. 869，－ 0. 938。清水
紫花苜蓿对 R-6G 的钝化作用最敏感，40μg /ml 的处理
浓度下，其原生质体活力降幅最大，达 12. 0%(图 3) ，
扁蓿豆原生质体活力的降幅在各处理下总是最小的。
2. 3 不同浓度 IOA 处理对 3 种豆科牧草愈伤组织原
生质体植板率的影响
由图 5 可知，经 IOA 钝化处理后，3 种豆科牧草原
生质体的植板率均低于各自的对照，且差异极显著(p
＜ 0. 01)。各处理浓度下清水紫花苜蓿原生质体的植
板率均最低。10mol /L IOA 处理下 3 种牧草的植板率
分别为:百脉根 16. 4%，扁蓿豆 25. 4%，清水紫花苜蓿
9. 8%，其中，清水紫花苜蓿原生质体植板率的降幅最
大，达 74. 0%。
3 种牧草原生质体的植板率与 IOA 浓度之间均存
在极显著的负相关，相关系数依次为:百脉根 － 0. 975，
扁蓿豆 － 0. 952，清水紫花苜蓿 － 0. 876。清水紫花苜
蓿对 IOA 的钝化作用最敏感，各处理下，其植板率的
降幅均最大，百脉根次之，扁蓿豆原生质体植板率的降
幅在各处理浓度下总是最小的。
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3 期 代谢互补抑制剂碘乙酰胺和罗丹明对 3 种豆科牧草原生质体活力和再长的影响
图 3 40μg /ml R-6G 钝化处理清水紫花苜蓿原生质体的活力(400 ×)
Fig． 3 Viability of protoplasts with 40μg /ml R-6G of M． sativa L． cv． Qingshui(400 ×)
A:FDA 明场染色;B:同一视野 FDA 暗场染色;箭头所指为钝化失活的原生质体。
A:FDA dyeing in light field;B:FDA dyeing in dark field in the same view;Arrows stand for inactivated protoplasts．
图 4 清水紫花苜蓿苜蓿原生质
体罗丹明 6G 染色(100 ×)
Fig． 4 R-6G dyeing of protoplasts of
M． sativa L． cv． Qingshui(100 ×)
图 5 不同 IOA 浓度处理下 3 种豆科牧草愈伤组织原生质体的植板率
Fig． 5 Protoplasts plate rate of 3 legume forages with different IOA treaments
2. 4 不同浓度 R-6G 处理对 3 种豆科牧草愈伤组织
原生质体植板率的影响
由图 6 可知，随着 R-6G 处理浓度的升高，3 种豆
科牧草原生质体植板率的降幅均逐渐增大，与各自 CK
相比，差异均极显著(p ＜ 0. 01)。70μg /ml R-6G 处理
下，3 种牧草的植板率分别为:百脉根 6. 0%，扁蓿豆
9. 6%，清水紫花苜蓿 5. 0%，其中，百脉根的降幅最
大，达 82. 0%。
相关性分析表明，百脉根、扁蓿豆和清水紫花苜
蓿原生质体的植板率与 R-6G 浓度间均存在极显著的
负相关，相关系数依次为 － 0. 969，－ 0. 843，－ 0. 897。
与各自 CK 相比，百脉根对 R-6G 的钝化处理最敏感，4
个处理浓度下，其植板率的降幅总是最低，清水紫花苜
蓿次之，扁蓿豆植板率的降幅总是最小的。
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图 6 不同 R-6G 浓度处理下 3 种牧草愈伤组织原生质体的植板率
Fig． 6 Protoplasts plate rate of 3 legume forages with different R-6G treaments
2. 5 不同浓度 IOA 处理对 3 种豆科牧草原生质体再
生能力的影响
在 IOA 不同浓度处理下，3 种豆科牧草原生质体
的再生能力见表 2。培养第 7 天，所有处理均可见再
生白色小细胞团，经过 30 ～ 40d 的培养，3 种牧草的对
照原生质体均可再生成愈伤组织。3mmol /L IOA 处理
下，百脉根和扁蓿豆原生质体仍有较高的分裂能力
(表 2，图 7) ，再生的小细胞团经后期培养均可再生愈
伤组织(图 8) ;清水紫花苜蓿不规则原生质体的比例
较高，再生小细胞团稀少，后期培养中不能继续发育，
逐渐褐化死亡。 IOA 钝化浓度≥5mmol /L 时，百脉根
原生质再生的小细胞团停止发育，未能形成愈伤组织。
IOA 钝化浓度≥7mmol /L 时，扁蓿豆原生质不能形成
再生愈伤组织。
表 2 不同 IOA 浓度处理下 3 种豆科牧草原生质体愈伤组织的再生情况
Table 2 Regenerated capability of protoplasts of 3 legume forages in different IOA treatments
牧草种类
legume forages
里奥百脉根
L． corniculatus L． cv． Leon
扁蓿豆
M． ruthenica (L·)Sojak
清水紫花苜蓿
M． sativa L． cv． Qingshui
IOA 浓度
IOA concentration(mmol / L)
0 3 5 7 10 0 3 5 7 10 0 3 5 7 10
培养第 7 天再生细胞团
regenerated cell colonies in 7d of culture
+ + + + + + + + + + + + + + +
培养 30 ～ 40d 再生愈伤组织
regenerated calli in 30 ～ 40d of culture
+ + － － － + + + － － + － － － －
注:“ +”为能形成再生细胞或愈伤组织，“ －”为不能形成再生细胞或愈伤组织。下表同。
Note:“ +”means capable of forming regenerated cell colonies or calli;“ －”means incapable of forming regenerated cell colonies or calli． The same as
following table．
因此，就 IOA 钝化效果而言，使 3 种豆科牧草原
生质体失活的 IOA 临界浓度分别为:百脉根 5mmol /L;
扁蓿豆 7mmol /L;清水紫花苜蓿 3mmol /L。
2. 6 不同浓度 R-6G 处理对 3 种豆科牧草原生质体
再生能力的影响
在不同浓度的 R-6G 处理下，3 种豆科牧草原生质
体的再生能力如表 3 所示。培养第 7 天，所有处理均
可见再生白色小细胞团，经过 30 ～ 40d 的培养，3 种牧
草的对照原生质体均可再生成愈伤组织。40μg /ml R-
6G 处理下，百脉根和扁蓿豆原生质体再生的小细胞
团，经后期的培养可发育成愈伤组织;清水紫花苜蓿再
生的小细胞团在后期培养中，均停止发育，不能形成愈
伤组织。R-6G 钝化浓度≥50μg /ml 时，百脉根原生质
体不能形成愈伤组织。R-6G 钝化浓度为 70μg /ml
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3 期 代谢互补抑制剂碘乙酰胺和罗丹明对 3 种豆科牧草原生质体活力和再长的影响
表 3 不同浓度 R-6G 处理下 3 种豆科牧草原生质体愈伤组织的再生情况
Table 3 Regeneration capability of protoplasts of 3 legume forages in different R-6G treatments
牧草种类
legume forages
里奥百脉根
L． corniculatus L． cv． Leon
扁蓿豆
M． ruthenica (L．)Sojak
清水紫花苜蓿
M． sativa L． cv． Qingshui
R-6G 浓度
R-6G concentration(μg /ml)
0 40 50 60 70 0 40 50 60 70 0 40 50 60 70
培养第 7 天再生细胞团
regenerated cell colonies in 7d of culture
+ + + + + + + + + + + + + + +
培养 30 ～ 40d 再生愈伤组织
regenerated calli in 30 ～ 40d of culture
+ + － － － + + + + － + － － － －
图 7 分裂的扁蓿豆原生质体(400 ×)
Fig． 7 Divided protoplasts of
M． ruthenica (L．)Sojak(400 ×)
箭头所示为处于分裂中的原生质体
arrows stand for protoplasts in division period
图 8 扁蓿豆原生质体
再生的小愈伤组织
Fig． 8 Regenerated calli from protoplasts
of M． ruthenica (L．)Sojak
时，扁蓿豆原生质体不能形成再生愈伤组织。
因此，就 R-6G 钝化效果而言，使 3 种豆科牧草原
生质体失活的临界浓度分别为:百脉根 50μg /ml;扁蓿
豆 70μg /ml;清水紫花苜蓿 40μg /ml。
3 讨论
3. 1 代谢互补抑制剂 IOA 和 R-6G 临界浓度的筛选
和确定
IOA 钝化细胞质，通过阻断细胞能量供应来抑制
细胞生长，有效地简化了细胞杂种的筛选工作［23］，常
用于不对称体细胞杂交［24 ～ 27］。R-6G 可抑制线粒体氧
化磷酸化，与 IOA 配合使用，可对融合细胞进行筛选
而获得体细胞杂种［6 ～ 8］。本研究表明，3 ～ 10mmol /L
IOA 和 40 ～ 70μg /ml R-6G 的浓度处理，可使 3 种豆科
牧草原生质体的细胞质不同程度受损，其中，70μg /ml
的 R-6G 处理可使清水紫花苜蓿的活力值和植板率分
别降至 49. 4%和 5. 0%，为各处理中最低，此时原生质
体仍可分裂形成小细胞团，这是由于未钝化的原生质
体在一定的培养条件下仍具有生长能力的缘故。培养
30 ～ 40d，再生细胞团有的可发育成愈伤组织，有的则
停止生长，最终丧失再生能力。因此，本研究认为在筛
选上述 2 种抑制剂对豆科牧草原生质体钝化效果的临
界浓度时，应以原生质体是否失去再生愈伤组织能力
为最终依据，在活力和植板率均不为 0 的情况下，原生
质体在后期的培养中也可能因存活原生质体密度低于
培养所需的临界密度而不能再生。付莉莉等［24］在筛
选陆地棉品系 YZ － 1 棉花原生质体的 IOA 钝化浓度
时，0. 5mmol /L 的最低失活浓度下原生质体单独培养
不成功，此时植板率为 3. 5%。金红［27］在研究 IOA 对
苜蓿原生质体存活率影响时发现，5. 0mmol /L 的浓度
处理下存活率为 15. 2%，原生质体继续培养不能形成
小细胞团，研究结果均与本文相似。而侯喜林［7］用
1. 0mmol /L 的 IOA 处理白菜子叶原生质体 20min 时，
原生质体植板率为 0，完全失活。这可能是由于原生
质体来源及 IOA 作用时间等不同，造成 IOA 失活效果
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2012，26(3) :0615 ～ 0622
的差异。
3. 2 代谢互补抑制剂 IOA 和 R-6G 对 3 种豆科牧草
原生质体的作用效果评价
本研究中，不同抑制剂对豆科牧草原生质体活力
和生长的影响存在差异。与 R-6G 相比，IOA 对 3 种牧
草原生质体活力的抑制作用更加明显，10mmol /L 的浓
度可使活力降幅的平均值达 29. 9%。R-6G 则对 3 种
牧草植板率的影响更加显著，70μg /ml 的浓度处理，植
板率平均值仅为 6. 9%，降幅平均值达 77. 2%。此外，
R-6G 作为一种常见的荧光染料，在钝化原生质体的同
时，可使其细胞质染成红色，并发出红色荧光，在进行
下一步的融合操作时，可与经其他荧光染料染色的原
生质体明显区分，有利于融合过程的观察和异源融合
率的统计。有研究指出，IOA 钝化细胞质还会引起细
胞核染色体的丢失［24］，因此有关这 2 种抑制剂对植物
原生质体的钝化效果和作用方式仍有待进一步研究。
此外，不同牧草种类对 IOA 和 R-6G 的抑制作用
的敏感程度是不同的。扁蓿豆愈伤组织原生质体表现
出较强的抗抑制能力，不同浓度处理下，其活力总是最
高的，而清水紫花苜蓿总是最低的。就 2 种抑制剂的
临界浓度而言，扁蓿豆总是最高的，清水紫花苜蓿总是
最低的。由于 3 种牧草的原生质体在钝化前的起始密
度相同，采用了相同的处理方法和培养方式，因此在不
同抑制剂作用下它们的活力和再生愈伤组织能力出现
差异的原因可能是由于供试材料的遗传背景和基因组
成不同。
4 结论
4. 1 3 ～ 10mmol /L IOA 和 40 ～ 70μg /ml R-6G 的浓度
处理使 3 种豆科牧草的活力和植板率明显下降，并存在
极显著的负相关(p ＜ 0. 01)。培养 30 ～ 40d，2 种抑制剂
临界浓度下所有处理均失去再生愈伤组织的能力。
4. 2 IOA 对 3 种豆科牧草原生质体活力的抑制作用
更加明显，R-6G 对 3 种牧草植板率的影响更显著并可
使原生质体发出红色荧光，有利于细胞融合时进行亲
本原生质体的标识。
4. 3 综合考虑 2 种抑制剂对原生质体的钝化效果，适
宜 3 种牧草的抑制剂及临界浓度分别是:百脉根
5mmol /L IOA 或 50μg /ml R-6G;扁蓿豆 7mmol /L IOA
或 70μg /ml R-6G;清水紫花苜蓿 3mmol /L IOA 或
40μg /ml R-6G。
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