全 文 ：广 西 植 物 G仁 i i la主 a1 0( i):45一 45 , 1 9 9 0
原生质体扫描电镜观察研究方法的改进及其效果初报
钟 荣 亮
( 广西农学院 )
摘要 本文介绍了一种原生质体扫描电镜观察研究方法 . 比较了三种不 同 配方的固定剂 . 结
果证明; 用添加甘露醇作渗透压稳定剂和用原生质体培养液作稀释剂配 制 的固定剂效果良好 . 用
常规电镜固定剂则会造成原生质体变形 、 破裂 。 设计了室温下 的快速脱水方案 . 取得 较满意 结
果 . 观察到原生质体表面有许多大小约10 。一 20 0毫微米的微孔结构 .
关键词 原生质体 ; 扫描电子显微镜
用酶解方法除去了细胞壁的植物细胞原生质体经过培养 , 可以再生成完整的植株 。 近年
来发展迅速的遗传工程技术手段之一 , 就是通过原生质体融合 , 进行体细胞 杂交 : 或者将某
种细胞器 、 D N A 、 病毒等外源遗传基因导入原生质体 , 再培养成新的植物 。 它 为广泛地组
合各种基因型 , 培育出具有优良性状的植物新 品种展示了美好前景 t `〕 。
用电子显微镜详细研究各种植物原生质体的超微结构 , 了解它在培养过程和融合杂交中
的变化 , 对于探索体细胞杂交的机理和外源基因导入途径有重要意义 。
由于原生质体仅有一层非常薄的柔性质膜包被 ,十分脆弱而且高度液泡化 。 用常规电镜制
样方法处理 , 原生质体将在处理过程中破裂 、 崩解或者严重 变 形 。 本文介绍笔者参考 L . .C
F o w k
e 的原生质体透射电镜镜检方法 〔名〕 , 加以改进用于扫描电镜样品的制备 , 可以获得较
为满意的结果 。
作了以下改进试验 ,
( 1 ) 比较了三种不同配方的固定剂 。
( 2 ) 将冰浴下脱水 , 改为在常温下脱水 。
( 3 ) 用快速脱水方案代替常规脱水 。 将脱水时间缩短为常规脱水的五分之一 。
材料与方法
I
。 尿生质体的分离 用含有0 。 S M甘露醇的1 . 5%纤维素酶 ( O n oz u k a R 10 ) 和 1 %果
胶酶混合酶液 , 分别从马铃薯和木薯幼叶中分离原生质体 〔么〕 , 用离心沉淀法纯化 。
2
。 固定 要使原生质体超微结构迅速得到固定而不造成损伤 、 破裂 , 前固定选择合适
的固定液十分重要 。 我们比较了三种固定剂的作用结果 。
( 1 ) 常规电镜制样使用的 3 %戊二醛固定剂 ( 用 p H 二 7 . 2的磷酸缓冲液配制 ) 。
( 2 ) 用原生质体培养液为稀释剂 , 配成 3 %的戊二醛固定剂 。
( 3 ) 在磷酸缓冲液中 , 添加 7 %甘露醇 ( 渗透压稳定剂 ) 。 以此为稀释液 , 配制 3 %
戊二醛固定液 。
本文承我院何若天副教授审阅指导 , 特此致谢 。
4 6广 西 植 物 1 0卷
图 1 .马铃薯叶细胞原生质体扫描 吧镜娜片 3忿。。 x
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ro to pl a叭o fpo t atoI eo fe el ls x3 0 0 0
图 2.木薯叶细胞原生质体及其自发融合现象 。
表面可见 20 0一 3 0 0nm 的微孔结构。 3 0 0 0只
F 丈 9. 2.P ro to pl as to fes as av aI e a fe ells \3 0 0 0
子
1期 钟荣亮 : 原生质休扫描电镜观察研究方法的改进及其效果初报
处理方法 : 在 3支离心管中 , 保留较高浓度的原生质体悬液 O。 5毫升 。 分 别 加入上述三
种固定剂各 1 毫升 , 使戊二醛在离心管的最终浓度 为 1 % , 轻 轻 摇 匀 , 在室温下固定 2 小
时 。 中途轻轻摇匀几次 。 ( 以后各步直到脱水完毕均在离心管中进行 ) 。 于 1 0 0 x g下 低速离
心 8 ~ 5 分钟 , 弃去上清液 , 再分别加入上述 3 %的戊二醛 固 定 剂 各 1 毫升 。 室温下放置
i ~ 2 小时 , 离心 ( 1 0 0 x g , 下 同 ) 弃去上清液 。 用磷酸缓冲液 ( p H = 6 . 8 ) 洗涤 3 次 , 以
除净戊二醛 。 最后加入 1 %四氧化饿溶液 , 室温下放置一小时作为 “ 后固定 , , 以进一步提
高原生质体外膜的强度 , 减少脱水 、 干燥过程中的变形和损伤 。
四氧化俄固定后 , 用蒸馏水洗涤两次 , 然后转入脱水过程 。
3
。 脱水 , 按照 F o w k e 介绍的方法 工“ 〕 , 原生质体样品应在冰浴下 进行脱水 。 我们考虑
到原生质体只有一层细胞膜包被 , 个体微小 , 比表面极大 , 通透性好 , 于是试验了在室温下
的快速脱水方案 。 方法是 :
在室温下 , 从 10 %乙醇开始 ( 用丙酮亦可 ) 每 3 分钟递增10 % , 每更换一级脱水剂 , 均
轻轻振荡以促进脱水作用 , 在 10 0% 乙醇中更换两次 , 第二次结束时加人等 量 醋酸异戊醋 ,
使乙醇 : 醋酸异戊醋 = 1 : 1 。 浸洗五分钟后 , 离心 , 转入 1 0 %醋酸 异 戊醋中 , 置 4 ℃冰
箱中过夜 。
4
。 千澡 : 由于原生质体外膜十分脆弱 , 常温空气干燥法会使它产 生 严重收缩变形 。 用
临界点干燥法处理 , 能缓解表面张力的影响而很好地保持样品的真实形貌 。
方法是 : 在垫好滤纸的不锈钢样品篮里 , 放置 1 ~ 2 块 2 x 3 毫米大小 , 事先喷镀有一
层金属膜的盖玻片 。 用吸管将脱水后悬浮于醋酸异戊醋的原生质体滴在此盖玻片上 ( 可避免
样品变形并保证导电良好 ) , 置于 H C P 一 2 临界点干燥仪的样品室中 , 旋紧盖子 。 注意 : 要
缓慢通入液体二氧化碳 , 防止液流冲走样品 。 以后按仪器规程操作 。
临界点干燥结束 , 立即用导 电胶或双面胶将附有干燥样品的盖玻片粘在扫描电镜样品台
上 , 作导电处理 。
与。 导电处理 : 在样 品表面喷镀一层均匀的金属膜进行导电处理 , 可以防 止 观察时出现
放电现象 , 提高二次 电子信号强度从而增强图象的亮度和反差 。 我们用 I B 一 5 型离子溅射镀膜
仪 , 阴极为金一靶合金 ( 6 : 4 ) 。 样品与阴极靶间距 40 毫米 , 溅射电流 6 ~ 7 毫安 , 时间
6 ~ 1 0分钟 。 溅射镀膜金属颗粒细 , 扫描观察时分辨率高 , 图象清晰 〔“ 1 。
镀金属膜后 , 用 J E M 一 1 2 0 0E X 型电子显微镜的扫描系统观察拍照 。
结果与讨论
1
。 在光学显微镜下 , 各种细胞的原生质体大都是 圆球形 , 不易区分 不 同种和不同部位
细胞原生质体的细微差别 , 在扫描电镜下观察则可以分辨 。
图 1 为马铃薯幼叶细胞原生质体 。
图 2 为两个自发融合的木薯幼叶原生质体 。 两个细胞 之间的融合连接带清晰可辨 。
扫描电镜景深大 , 图象富有立体感 , 能从样品表面获得多方面的信息 。 如与透射电镜观
察结合 , 进行细胞融合 、 杂交 、 生长动态等方面的研究 , 将起重要作用 。
2
。 常规电镜制样的戊二醛固定剂不能直接用来固定原 生质体 。 由于溶 液 的渗透压不合
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适 , 会使十分脆弱的原生质体变形 , 破裂甚至崩解 , 结果只能观察到大量破损的细胞 , 如图
3 所示 。 如果在固定剂 中添加 O。 5~ O。 SM的甘露醇作为渗透压稳定剂 , 或者用相应的原生质
体培养液配制固定剂 , 均可获得较好的结果 ( 图 1 、 2 所示 ) 。 从多次试验 观察结果看 , 还
是以培养液为稀释剂配制的戊二醛固定液效果最好 。 其原因可能是 : 对于不 同的原生质体来
说 , 相应的培养液具有最适其存在 的环境条件。 这样的条件下进行固定有利于保持它自然的
形貌和超微结构 。
3
。 对比了室温下的快速脱水 方 案和
冰浴下的常规脱水方案 。 结果表明二者并
无差异 。 由于室温下的快速脱水方案简化
了操作条件 , 脱水时间缩短为常规法的五
分之一 , 不失为一种简便可行的方法 。
4
. 经大量观察 , 在完整 的 原生质体
表面常常见到许多清晰的小孔 ( 见图 2 )
些小孔 多 数 出 现在原生质体 凹 陷 的 部
位 , 大小约为 1 0 0~ 2 0 0 毫 微 米 ( n 二 ) 。
这些小孔可能是原生质膜在脱水剂 ( 乙醇
或丙酮 ) 的作用下 , 局部薄弱位点出现的
孔洞 。 这些位点 , 在原生质体代谢过程中
的作用有待深入研究 。 这将是一个有 意义
的 问题 。
图 3 . 常规固定剂制备的原生质体
整个细胞变形失真 , 外膜破裂 。 1 5 0 0 x
P i g
. 3
.
P
r o t o p l
a s t p r e p a r e d b y
e o n v e n t i o n a l
f i x i n g a g e n t
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T h e e e l l w
a s o u t o f
s
h
a p e a n d
1 t s 口 e m b r a n e h a s b u r s t , x 1 5 0 0
主要参考文献
〔 1 〕 汪德耀主编 . 1 9 8 4 : 细胞生物学实验指导 。 p 1 7 2一 201 , 高等教育出版社 , 北京 。
〔 2 ) L . C . F o w k e , 1 9 8。 , “原生质体的电子显微镜检 ” 嵘植物组织培养方法》 。 p 78 一例 , 科学出版社 .
〔 3 〕 田中敬一 ( 李文镇等译 ) , 1 9 8 4年 : 图解扫描电子显微镜— 生物样品制备 。 不汀学出版社 。
STUDY ON T H E MOD IF IE D M E T HO D F O R S C AN N ING E L E C T R ON
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P r e s e n t e d
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T 五r e e d i f f e r e n t f i x i n g a g e n t s w e r e e o m p a r e d a 且 d r a p i d d e h y d r a t i o n 皿 e t h o d
w a s t e s t e d
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M i e r o h o l e s b e t w e e n 1 0 0一 2 0 0 n m ( d i a m e t e r ) o n s u r f a e e o f p r o t o p l a s t w e r e
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K e y w o r d s P r o t o p l a s t ; s e a n n i n g e l e e t r o n rn i e r o s e o p e