全 文 ：影响禾本科草坪草愈伤组织分化频率的因素
余如刚1 , 2 ,李阳春1 ,夏　阳2 ,梁慧敏2 ,王太明2
(1.甘肃农业大学 草业学院 , 甘肃 兰州　730070)
(2.山东省林业科学研究院 , 济南　250014)
　　摘要:通过参阅大量的文献及研究 ,着重从外植体类型 、激素 、营养条件以及培养环境等方面 ,分析
了禾本科草坪草愈伤组织分化频率的影响因素 ,其中内在因素包括不同基因型 ,外植体类型 ,同种外植
体的不同发育状态 ,而外在因素主要包括激素的选择 ,营养及光照条件 ,胚性愈伤组织的挑选 。
　　关键词:草坪草;愈伤组织;植株再生
　　中图分类号:Q 343;S 688.4　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5500(2004)02-0020-04
　　草坪草一般指用于建植草坪的禾本科和少量的莎
草科植物。随着生物技术的发展 ,运用基因工程手段
对草坪草进行品种改良越来越受到重视 。利用植物组
织培养技术 ,诱导草坪草产生突变体 ,或建立转基因的
受体系统的研究已取得了一定的成就 ,但草坪草的外
植体离体再生频率低 。这是由于不同基因型之间存在
一定的差异 ,有些基因型再生比较困难 ,严重阻碍了草
坪草基因工程研究工作的顺利开展 ,因此研究草坪草
组织培养条件和植株再生频率的影响因素依然是一个
亟待研究的重要课题 。本文对影响禾本科草坪草愈伤
组织分化频率的因素进行了探讨 ,其中主要包括外植
体的来源 、激素 、营养条件与环境条件等因素 。
1　影响愈伤组织分化频率的因素
1.1　不同的外植体来源
　　禾本科的草坪草多数从成熟的种子 、成熟或未成
熟的胚 、茎尖分生组织和花序幼穗作外植体获得了再
生植株 ,见表 1。
　　由诸多的研究得出 ,对于同一种最佳培养基 ,不同
外植体类型有不同的再生效果 。同时 ,在同一种最佳
培养基中对于同种外植体的不同部位 、不同的生理状
态及成熟度都有不同的再生频率。如种子一般要选择
成熟度高的 ,这是因为不同成熟度的种子处于不同的
　　收稿日期:2003-05-14;修回日期:2003-09-23
　　基金项目:山东省科技发展计划(011100104)资助项目和
国家“863”计划(2001AA244082)
　　作者简介:余如刚(1976-), 男 ,宁夏盐池人 , 在读硕士。
生理生长状态 ,具有不同的生理生化特性及不同的内
源激素水平 ,从而具有不同的适应能力 ,对激素有不同
的反应特性;相反成熟度越高的叶片 、花序由于细胞的
分裂能力越差 ,生长越慢 ,所以分化不定芽的难度越
大 ,因此一般选择幼嫩的材料进行离体培养来提高再
生频率。
表 1　已建立植株再生体系的草坪草
草坪草品种 外植体类型 作者
草地早熟禾 幼穗 朱根发等[ 1]
(Poa pratensis)
多花黑麦草(Loli- 未成熟胚 Dalep 等[ 2 〗
(um m ultif lorum)
狗牙根 成熟的胚 、种子 胡张华等[ 3]
(Cynodon dacty lon)
紫羊茅 根尖 、芽尖 Vasilv 等[ 4]
(Festuca rubra) 分生组织
多年生黑麦草 未成熟的花序 Greemers Mo-
(Lolium perenne) Vasilv 等[ 5]
1.2　激素对草坪草愈伤组织分化频率的影响
　　激素对于草坪草愈伤组织再生体系的建立起着关
键的作用 ,并且是非常难掌握的因素 ,因为植物激素在
相互作用中 ,有重叠和互补效应[ 6] 。
1.2.1　生长素和细胞分裂素的作用　生长素在组织
培养中的主要作用在于诱导愈伤组织的形成胚状体的
产生以及试管苗的生根。生长素的主要物质有 2 , 4-二
硝基苯酚(2 ,4-D)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、吲
哚乙酸(IAA)。不同的草坪草品种的外植体分化有其
最适宜的激素 ,其中 2 ,4-D在大多数草坪草诱导愈伤
组织中是必不可少的 ,其浓度在 1 ～ 5 mg/L ,在分化培
20 Grassland and Turf　　(Quarterly)　　2004　　No.2　　(Sum　No.105)
DOI :10.13817/j.cnki.cyycp.2004.02.005
养基中 2 ,4-D的浓度很低 ,甚至有的品种只有除去它
才可获得再生植株 ,其浓度为 0 ～ 0.5 mg/L 。马忠华
等[ 7]以早熟禾种子成熟胚为外植体 ,进行愈伤组织诱
导和分化 ,发现 3.0 mg/L 和 0.1 mg/L 2 , 4-D是早熟
禾诱导愈伤组织和分化愈伤组织成苗的最佳浓度组
合;Kuo[ 8]用含 1 ～ 5 mg/L 2 ,4-D MS基本培养基诱导
钝叶草 ,用 0.25 mg/L 2 , 4-D+0.50 mg/L 激动素
(KT)的 MS 培养基分化钝叶草获得再生植株 ,也有少
数在 5 ～ 10 mg/L ,如高羊茅再生植株的获得[ 8] 。在草
坪草的愈伤组织诱导中 NAA 、IBA 的作用较弱 ,多用
2 ,4-D ,但 NAA 、IBA 通常用在分化培养基 ,生根及快
繁培养基中 ,它们的浓度范围在 0.1 ～ 1.0 mg/L。
　　细胞分裂素主要是起促进细胞分裂改变顶端优
势 、促进不定芽的分化等作用。外植体的再生主要是
细胞分裂 、分化的结果。细胞分裂的前提是有丝分裂 、
DNA复制和胞质分裂 。生物学表明细胞分裂素对于
有丝分裂 、核分裂及 RNA加倍都是必需的 ,而生长素
对DNA的加倍和有丝分裂有作用[ 10] 。细胞分裂素类
物质一般有 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、KT 、N-苯基 N ,-
1 ,2 , 3-噻二唑 -5-脲(TDZ)。但大多数试验表明 BA的
效果最好 ,其次是 KT ,它们的浓度范围是 0.1 ～ 10.0
mg/L ,最适宜的范围是 0.1 ～ 2.0mg/L。总之 ,激素
(尤其是细胞分裂素和生长素)在外植体的离体再生培
养中起关键的作用 ,最主要的原因是影响植物基因的
表达 ,从而调节特定蛋白质的合成 ,最终影响整个细胞
的分裂和分化过程。
1.2.2　激素的种类及组合　细胞分裂素与生长素的
不同组合及配比 ,对植物的敏感性不同 ,同一植物的不
同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程中对激素的要求
不同 ,所要求的水平取决于其内源激素的水平 。如我
们在对野生型早熟禾和高羊茅诱导愈伤组织时添加了
同一浓度的 2 ,4-D 、NAA 、IBA , 45 d 后统计发现 ,早熟
禾只有在含有 2 ,4-D上可诱导出大量的愈伤组织 ,而
在含有 NAA 、IBA 的培养基上没有诱导出愈伤组织;
高羊茅在添加 2 , 4-D 、NAA 的培养基上都有胚性愈伤
组织出现 。
　　细胞分裂素和生长素对诱导愈伤组织和植株再生
都有重要作用 ,但二者的比例是激素使用的关键 ,根据
培养的目的进行调节 ,原则是生长素浓度明显高于细
胞分裂素就能促进根以及愈伤组织的形成 ,这时生长
素起主导作用;相反生长素与细胞分裂素的比例低时
则促进芽的形成 ,这时细胞分裂素起主导作用。
2.2.3　其他活性物质以及一些天然复合物　其他的
一些激素或具有活性的物质 ,对器官的发生也有一定
的调控作用。如赤霉素类(GA3)可促进草坪草的生长
及生根 ,其浓度不宜过高 ,为 0.1 ～ 1.0 mg/L。提高培
养基中ABA含量 ,有利于增加培养基的渗透势 ,使体
细胞胚处于逐渐脱水状态 ,对于松软无定型 、呈果冻状
或棉絮状的愈伤组织 ,添加 ABA是很必要的 ,从而使
愈伤组织转变为结构致密的胚性愈伤组织。于晓红
等[ 11 〗的研究也表明:在愈伤组织诱导和继代过程中
添加 ABA(1.0 mg/L)有利于小麦中晚期幼胚致密愈
伤组织的诱导及再生能力的保持 。同时 ,加入蛋白水
解物有利于促进胚性愈伤组织的启动 ,在有机氮化合
物中 , L-脯氨酸和谷氨酰胺也能促进愈伤组织的诱导。
1.3　营养条件
1.3.1　培养基的选择　培养基的化学组成对草坪草
愈伤组织形成 、细胞培养和植物再生至关重要 。不同
种类的草坪草或者同一种类不同品种草坪草所需要的
培养基不一定相同 ,因此 ,需要通过大量的试验来确定
其最佳培养基 。
　　对于适合草坪草的基本培养基有 MS 、N6 、B5 、MS
+B5等 ,其中高盐的 MS 培养基是最常用于草坪草愈
伤组织的培养 ,现已从多花黑麦草[ 11] 、苇状羊茅[ 11] 、
草地早熟禾[ 12] 、高羊茅[ 13 ,14] 、狗牙根[ 15 ,16] 和结缕
草[ 17]等各种草坪草中获得了再生植株 ,但也有从 N6 、
B5等培养基中获得再生植株 ,高羊茅再生植株的获
得[ 18] ,以 N6培养基中附加 9 mg/L 2 ,4-D和 2 mg/ L
ABA的愈伤组织诱导率最高。
1.3.2　蔗糖和琼脂　在草坪草的组织培养中多采用
食用白砂糖 ,其不影响试验效果 ,但有少量草坪草种类
的蔗糖效果明显 。培养基添加 30 g/ L 蔗糖为宜 。琼
脂可用琼脂粉和琼脂条 ,但琼脂条的纯度和质量不如
琼脂粉 ,所以 ,为了提高再生频率 ,宜采用琼脂粉 ,用量
为7 g/L 。同时 ,通过大量的试验表明提高蔗糖和琼脂
的浓度 , 在一定程度上可抑制非胚性愈伤组织的生
长 ,并促进胚性愈伤的形成[ 15] 。如颜秋生等[ 19]在水
稻组织培养中强调高渗 、高浓度琼脂的作用 。
2.4　培养条件
　　在草坪草的愈伤组织的发生过程中暗培养是必须
的 ,而分化时光照是必须的 ,并认为由脱分化向分化转
变时黑暗是关键 。不同的品种 、不同的外植体类型需
21草原与草坪　　2004年　　第 2期　　总第 105期
要不同的暗培养时间 。在暗培养时间达到最佳时间之
前 ,随着暗时间的增加 ,愈伤组织的发生逐渐增多 。所
以为了得到较高的再生效率 ,一般采用合适的黑暗培
养。
2.5　不同时期的愈伤组织
　　愈伤组织再生系统是指外植体脱分化培养诱导愈
伤组织 , 并通过分化培养获得再生植株的受体系
统[ 19] 。愈伤组织培养的方法与步骤相对较简单 ,都要
经过外植体(种子 、根尖 、茎尖或未成熟的花序)→愈伤
组织诱导 、愈伤组织的分化 、绿色小苗再生 、生根培养 、
再生成完整植株等几个过程。其中再生植株的获得与
愈伤组织的生理壮态有一定的影响 ,非胚性愈伤组织
的细胞群不具有再生能力 ,只有胚性愈伤组织才能获
得再生植株 ,因此 ,对愈伤组织的挑选是十分重要的 。
禾本科植物的愈伤组织较为丰富 ,根据形态主要分为
4种类型:第 1类型生长迅速 ,结构致密 ,颗粒小;第 2
类型生长迅速 ,质地疏松;第 3 类型生长缓慢 ,结构致
密;第 4类型松软无定型 ,呈果冻状或棉絮状[ 20] 。一
般结构致密的胚性愈伤组织(大多数是暗黄色的愈伤
块)具有再生绿色植株的能力 。
3　小结
　　综上所述 ,影响草坪草愈伤组织分化频率的因素
主要有两大类 ,其中内在因素包括不同基因型 、外植体
类型 、同种外植体的不同发育状态 ,而外在因素主要包
括激素的选择 、营养及光照条件 、胚性愈伤组织的挑选
等。基因型和外植体的选择是决定草坪草再生的先决
条件 。目前 ,草坪草品种繁多 ,必须根据自己转化基因
的特征以及各种草坪草的性状特征和生理生化特性确
定出所选品种;同时由于草坪草大多幼胚或幼穗较小 ,
操作难度大 ,且取材受季节限制 ,所以一般用种子经过
一定时间的萌发 ,挑出具有萌发力种子的成熟胚进行
愈伤诱导 。调节激素的种类和组合则是获得高效再生
植株的重要手段。不同的品种具有不同的再生特性 ,
需要不同的再生条件 ,所以需要通过实验寻找各自的
最佳激素配比 。目前 ,各种影响因素的研究虽然取得
了较为理想的结果 ,但也有不足之处 。如现在的草坪
草的愈伤组织易诱导 ,但其高频再生品种却很有限 ,这
就限制了高新生物技术在这些品种上的应用。另外某
些影响因素的作用机制还不太一致 ,而且某些因素的
作用机制还不太清楚正处于探索阶段。同时对品种本
身的研究还需深入 ,如草种内源激素的测定等 。总之
还需对草坪草的高频再生进行更深入的研究 ,以求获
得高频再生植株 ,为生物技术在草坪草中应用奠定基
础。
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Factors affecting plant regeneration from callus of turfgrass
YU Ru-gang1 , LI Yang-chun1 ,XIA Yang2 ,WANG T ai-ming2
(1.Pratacultural College , Gansu Agricultural University , Lanzhou 730070 , China;
2.Shandong Provincial Academy of Forestry , Jinan 250014 , China)
　　Abstract:There are many facto rs influencing turfgrass callus induction and plant regeneration.This paper is
aimed to review the effects of different factors on callus differentiation and mainly focused on the follow ing factors:
type of explant , plant ho rmones , nutri tion conditions and environment.
　　Key words:Turfgrass;callus induction;plant regeneration
“用类芦绿化裸露边坡的方法”
发明专利被列入全国重点专利招商引资项目
由深圳市大自然生态园林技术有限公司研究开发的“用类芦绿化裸露边坡的方法”发明专利 ,近日被中国国
际交流促会 、中国专利技术推广中心 、国际投资项目洽谈会组委会列入“全国重点专利招商引资项目” ,专利发明
人孙发政董事长将于 2004年 5月 20 ～ 23 日应邀赴北京人民大会堂参加“第七届中国北京国际科技产业博览
会” 。
近年来 ,由于公路 、铁路 、水利 、房地产 、矿山 、石场等大规模的开发建设 ,形成了大量的裸露边坡 ,造成山体植
被破坏 ,水土流失严重。种草是边坡绿化的一种有效方法 ,但由于采用进口草种 ,如百慕大 、画眉草 、百喜草等 ,当
年绿化效果较好 ,一两年后便退化 、消失 。1993年 ,时任安徽科学院助理研究员 、安徽省农学会理事的孙发政先
生 ,毅然“下海”走向生产第一线 ,到深圳艰苦创业 ,通过研究发现 ,当地野生植物类芦 ,不仅能结子 ,而且产量高 ,
进而研究开发出利用类芦绿化裸露边坡的一整套方法 。利用当地野生草种 ,不仅成本低 ,而且绿化效果持久稳
定 ,创造性地走出了一条草种国产化的新路子 。
该项发明日前被《中国改革报》《经济参考报》《科技日报》《人民日报·海外版》 、上海市高新技术成果转化服务
中心等列为重点专利推荐项目 ,同时被评为“中国上海`经都杯 专利发明金奖” ,发明人的业绩被收入人民日报出
版社出版的《中华名人大典》 。
(深圳市大自然生态园林技术有限公司　供稿)
23草原与草坪　　2004年　　第 2期　　总第 105期