全 文 ：吴正钢，汪 捷，谢薇薇，等． 禾本科内生真菌研究 15:禾本科内生真菌 Epichlo yangzii 原生质体的制备与再生［J］． 江苏农业科学，2011，40
(2) :17 － 20．
禾本科内生真菌研究 15:
禾本科内生真菌 Epichlo yangzii原生质体的制备与再生
吴正钢，汪 捷，谢薇薇，陈永敢，王志伟
(南京农业大学生命科学学院微生物学系，江苏南京 210095)
摘要:为高效获得内生真菌 Epichlo yangzii Rnj5706 菌株的原生质体，分别检测酶系组合、稳渗剂、pH值、酶解温
度等因子对 E． yangzii原生质体制备的影响。结果表明:制备 E． yangzii原生质体的优化条件为液体培养 48 h的鲜菌
丝在 pH值 6． 8 含 0． 7 mol /L NaCl的酶解液(1． 5%崩溃酶、1． 0%蜗牛酶、1． 0%纤维素酶、2． 0%溶菌酶)中 32 ℃酶解
4 h，这时的原生质体得率为 39． 2 × 105 个 /mL酶解液。并比较不同保存时间下的原生质体的再生比率，表明随保存时
间延长，再生比率急剧下降。本研究关于 E． yangzii原生质体的制备和再生方法，为内生真菌遗传操作等后续研究提
供了基础。
关键词:Epichlo yangzii;原生质体;制备;酶系组合;再生
中图分类号:Q813． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)
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02 － 0017 － 04
(上接第 16 页)
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收稿日期:2011 － 03 － 08
基金项目:国家自然科学基金(编号:30670008) ;教育部国家大学生
创新性试验计划(编号:GJ0816)。
作者简介:吴正钢(1987—) ，男，江苏南京人。E － mail:wuzheng-
gang2010@ gmail． com。
通信作者:王志伟，教授，主要从事微生物学资源研究。Tel: (025)
84395531;E － mail:zwwang@ njau． edu． cn。
致谢:南京农业大学纪燕玲老师和彭飞同学参与了部分工作，特
此感谢!
植物内生真菌(fungal endophytes)是指那些在其生活史
的部分或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部，但其
宿主植物不表现出外在病害症状的真菌。现已在 80 多个属
的几百种禾本科植物中发现有 Epichlo 和 Neotyphodium 内生
真菌的存在，这类内生真菌与宿主植物有密切的互利共生关
系，能给植物带来优异的促生长、促分蘖、抗旱、抗病虫、抗食
草动物等特性［1 － 2］。近年有研究表明，我国野生禾本科植物
中也存在着丰富的内生真菌资源。笔者所在的课题组在我国
鹅观草属(Roegneria)、早熟禾属(Poa)等多种禾本科植物中
发现了 Epichlo和 Neotyphodium 内生真菌［1］。鹅观草属(禾
本科小麦族)主要分布于北半球的温带和寒带，中国是鹅观
草属植物最丰富的地区［3 － 4］。E． yangzii 是目前鹅观草属植
物中唯一的 Epichlo真菌，这也是亚洲提出的第 1 个 Epichlo
新种，它和宿主植物的关系十分有趣［5］。原生质体是细胞去
除了坚韧的细胞壁后对渗透压极为敏感的球质体，最外层是
裸露的细胞质膜［6］，是细胞融合、遗传转化等生物遗传分析
和育种中的重要材料。Epichlo 和 Neotyphodium 内生真菌生
长非常缓慢，Murray 等对 Neotyphodium lolii 的研究开启了内
生真菌原生质体制备和利用的先河［7］。然而，生物多样性使
菌株间存在差异，也导致了原生质体制备和再生方法的差
异［8］，特别是稳渗剂、酶和菌龄等因素对原生质体得率的影
响很大［8 － 9］。本研究就崩溃酶及其复合酶系、菌龄和稳渗剂
等因素，探索适合内生真菌原生质体制备和再生的有效方法。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 菌株 内生真菌 E． yangzii Rnj5706 菌株，分离自南
京市月牙湖的鹅观草(R． kamoji) ，现保存于中国微生物菌种
保藏管理委员会普通微生物中心(保存号:AS5． 870)。
1． 1． 2 培养基 YEPD培养基:葡萄糖 20 g，蛋白胨 10 g，酵
母抽提物 10 g，加水定容至 1 L，并用滤纸过滤;用于培养制备
原生质体的菌丝，按 100 μg /mL 加入氨苄青霉素［10］;液体再
生培养基:STC稳渗剂(1． 2 mol /L 山梨醇、10 mmol /L pH 值
7． 5 的 Tris － HCl、50 mmol /L CaCl2)中加入 1 g ∶ 20 mL 酵母
膏、7 g ∶ 100 mL 葡萄糖，用于培养原生质体，使其再生细胞
—71—江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 2 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.02.043
壁［11］;固体再生培养基:CM 培养基中加入 10． 3% 蔗糖
和0． 8%琼脂，pH值自然，用于原生质体再生［10］。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 内生真菌的培养 斜面培养:用接种针挑取小块菌接
种于 PDA斜面上，置于 28 ℃培养箱中暗培养 2 ～ 3 周。液体
培养:首先在长有内生真菌菌落的 PDA 斜面上加入 4 mL 无
菌水，刮取表面菌落，过滤并收集小的菌丝球，将收集到的菌
丝加入到装有 40 mL YEPD 的 100 mL 三角瓶中，于 28 ℃、
165 r /min摇床培养 2 d，得到液体培养的菌丝体。
1． 2． 2 原生质体的制备 制备方法参考宋庆涛等的方
法［12］，并作适当修改。收集 0． 2 g 液体培养得到的菌丝，用
0． 7 mol /L NaCl 洗涤 3 次，加入 1 mL 混合酶液(1． 5%崩溃
酶 + 1%蜗牛酶 + 1%纤维素酶 + 0． 5%溶菌酶，以 0． 7 mol /L
NaCl作为稳渗剂配制) ，置于 32 ℃中水浴 4 h，每隔 15 ～
20 min轻柔颠倒振荡离心管;用 6 层擦镜纸过滤原生质体，
5 000 r /min离心 10 min［12 － 13］，获得原生质体沉淀，弃去上清
液，加入 1 mL STC，再洗涤 2 次，保存备用。
1． 2． 3 原生质体得率统计 酶解相应时间后，取一定量的原
生质体，用 STC缓冲液进行适当稀释，在光学显微镜下通过
血球记数板计数，统计原生质体得率。
1． 2． 4 制备原生质体的影响因素 (1)混合酶系组分的影
响。在 32 ℃下，选取 0． 5%、1． 0%、1． 5% 崩溃酶，0． 5%、
1． 0%、2． 0%蜗牛酶，0． 5%、1． 0%、2． 0%纤维素酶和 0． 5%、
1． 0%、2． 0%溶菌酶，做 L9(3
4)正交试验。(2)酶解液的影
响。用浓度均为 0． 7 mol /L的 NaCl、KCl、MgSO4 和山梨醇(D
－ Sorbitol)分别配制酶溶液，进行酶解试验，最后一次洗涤菌
丝时所用的稳渗剂和酶溶液中的稳渗剂保持一致［8］。(3)菌
龄的影响。供试菌株在 YEPD培养基中分别培养 2、3 d，其他
操作同上。在以上优化条件确定的基础上，依次研究酶解液
pH值、酶解反应温度以及反应时间对原生质体制备的影响，
其他操作同上。
1． 2． 5 原生质体再生及其影响因素的研究 (1)液体再生
法。吸取 0． 9 mL 液体再生培养基于 2 mL 离心管中，加入
0． 1 mL的原生质体悬浮液，混匀，于 28 ℃下培养 12 h;稀释到
合适浓度，吸取 0． 1 mL混合液，涂布到 CM再生培养基上，于
28 ℃下恒温暗培养 8 d;统计再生菌落数，它与涂布原生质体
数目的比值即为原生质体再生比率［14］。(2)双层平板再生
法。底层为 5 mL CM 培养基，加入 5 mL 的 CM 再生培养基
(混有 0． 2 mL稀释的原生质体悬浮液) ，培养 8 d，记录再生
菌落数，计算再生比率。(3)再生比率的计算。原生质体纯
化后，分别用 STC 稳渗剂和无菌水悬浮 2 h，适当调整密度，
每皿加入 0． 2 mL稀释液和再生培养基，混匀，重复 3 皿;培养
8 d，根据菌落数计算原生质体再生比率［15］。(4)保存时间对
原生质体再生的影响。取含有原生质体的 STC 悬浮液，在
4 ℃下保存 0、12、24 h，分别取出一定的体积进行再生，方法
同液体再生方法。
2 结果与分析
2． 1 不同酶体系对原生质体制备的影响
以崩溃酶等复合酶为主要成分，比较 4 种不同酶的正
交组合。从表1可以看出，这4种酶在消解细胞壁时的作用强
表 1 不同酶体系对 E． yangzii Rnj5706 原生质体制备的正交试验
试验号
A:崩溃
酶(%)
B:蜗牛
酶(%)
C:纤维
素酶(%)
D:溶菌
酶(%)
原生质体得
率(万个 /mL)
1 0． 5 0． 5 1． 0 2． 0 1． 6
2 1． 0 0． 5 0． 5 0． 5 4． 0
3 1． 5 0． 5 2． 0 1． 0 14． 0
4 0． 5 1． 0 0． 5 1． 0 1． 7
5 1． 0 1． 0 2． 0 2． 0 8． 0
6 1． 5 1． 0 1． 0 0． 5 29． 0
7 0． 5 2． 0 2． 0 0． 5 2． 6
8 1． 0 2． 0 1． 0 1． 0 9． 0
9 1． 5 2． 0 0． 5 2． 0 27． 0
k1 1． 97 6． 53 13． 20 12． 20
k2 7． 00 12． 90 10． 90 11． 87
k3 23． 33 12． 87 8． 20 8． 23
R 21． 37 6． 37 5． 00 3． 97
度依次是崩溃酶 ＞蜗牛酶 ＞纤维素酶 ＞溶菌酶，优化配比为
1． 5%崩溃酶、1． 0%蜗牛酶、1． 0%纤维素酶、0． 2%溶菌酶。
说明复合酶系中的各酶能够有效互补，从而提高酶解率。
2． 2 稳渗剂对原生质体制备的影响
在 NaCl、KCl、MgSO4 和山梨醇等 4 种常用稳渗剂中，用
0． 7 mol /L无机盐作稳渗剂的效果比有机类化合物山梨醇好，
其中以 NaCl的效果最好，获得的原生质体最多(图 1)。说明
稳渗剂的选择，一方面与使用的酶的组合有关，另一方面与真
菌本身特性也有关。
2． 3 菌龄对原生质体制备的影响
液体培养 48 h的菌丝酶解效果最好，培养时间少于 48 h
或大于 48 h，酶解产生的原生质体数量均明显低于 48 h 时
(图 2)。
2． 4 酶解条件(pH 值、温度、反应时间)对原生质体制备的
影响
在酶解反应中，最适pH值约为6 ． 8，而在pH值为6 ． 5 ～
—81— 江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 2 期
7． 1 范围内影响较小，在此范围外影响较大(表 2)。适宜的
酶解温度是 32 ℃，获得原生质体最多，并且温度升高后得率
下降较快，说明这时蛋白酶活性增高，导致原生质体得率下降
(表 3)。反应时间也是影响到原生质体得率的重要因素，酶
解前 4 h 的原生质体数随时间呈上升趋势，4 h 时达到最大
值，然后原生质体数量开始缓慢下降。这可能是由于混合酶
含有的蛋白酶等成分对先释放出的原生质体造成损害，并高
于原生质体的生成速率(表 4)。
制备内生真菌原生质体的优化条件:液体培养 48 h的鲜
表 2 pH值对 E． yangzii Rnj5706 原生质体得率的影响
pH值 原生质体产量(105 个 /mL)
5． 8 0． 3
6． 2 1． 2
6． 5 4． 1
6． 8 6． 1
7． 1 4． 5
7． 5 3． 6
表 3 酶解温度对 E． yangzii Rnj5706 原生质体得率的影响
酶解温度(℃) 原生质体产量(105 个 /mL)
28 4． 4
32 4． 9
35 3． 6
表 4 酶解时间对 E． yangzii Rnj5706 原生质体得率的影响
酶解时间(h) 原生质体产量(105 个 /mL)
1 8． 4
2 20． 8
3 27． 6
4 39． 2
5 35． 6
6 16． 0
7 20． 8
菌丝 pH 值 6． 8 含 0． 7 mol /L NaCl 的酶解液(1． 5%崩溃酶、
1． 0%蜗牛酶、1． 0%纤维素酶、2． 0%溶菌酶) (表 1)中 32 ℃
酶解 4 h，这时原生质体得率最高，达 39． 2 × 105 个 /mL。
2． 5 原生质体的再生
E． yangzii Rnj5706 原生质体的再生方式有 2 种:一种是
顶端释放，在原生质体上首先伸出 1 个突起物而使其失去球
形，随后该突起物(或称芽)逐渐增大并延伸成 1 条菌丝，随
着培养时间延长，发育成正常菌丝(图 3) ;另一种为原位释
放，原生质体类酵母状分裂后在酵母状串珠链的 1 端形成芽
管，进而长成菌丝。在试验初期采取 2 种再生方法，但由于双
层固体培养法过于繁琐，融化温度不易控制，再生的菌落数也
少于液体再生涂布平板法，因此后期均采用液体再生涂布平
板法。
2． 6 保存时间对原生质体再生比率的影响
刚制备好的原生质体活力相对最高，再生比率超过 3%。
随着保存时间的延长，原生质体活力下降，再生率急剧下降
(图 4)。说明基于原生质体的试验最好使用现制备的原生质
体，这样才能获得较高的再生菌落。
2． 7 再生菌株的性状稳定性分析
在 PDA培养基上，对 200 个再生菌株的菌落形态、生长
速度以及分生孢子、分生孢子梗等进行调查，发现全部都和原
始菌株类似，没有观察到有明显变异的再生菌株。说明 E．
yangzii Rnj5706 菌株在本研究建立的原生质体制备和再生体
系中具有很好的稳定性。
3 讨论
真菌细胞壁组分复杂，不同的培养条件和不同菌龄细胞
壁的结构和成分也会发生变化，而且在酶解真菌细胞壁的过
程中还涉及到多个影响因素。本研究通过单独分析酶系组
成、菌龄、稳渗剂、酶解时间和酶解液 pH 值等多个因子对原
生质体制备的影响，得到制备内生真菌原生质体的优化条件。
按照该条件进行原生质体的制备，原生质体得率可以达到
—91—吴正钢等:禾本科内生真菌研究 15:禾本科内生真菌 Epichlo yangzii原生质体的制备与再生
39． 2 × 105 个 /mL，获得的原生质体直径约为 5 ～ 10 μm。
真菌细胞壁的主要成分是几丁质、糖原、蛋白质、半纤维
素等。在形成原生质体的过程中，细胞壁被溶解酶酶解出孔
洞，原生质体就从这些孔洞中溢到周围的稳渗剂中。因此，细
胞壁溶解酶是真菌原生质体分离最直接的因素，在菌丝释放
原生质体的反应系统中起直接作用。在真菌原生质体制备
中，参与溶解细胞壁的酶有很多种，常用的酶有 NovozymTM
234、溶壁酶、崩溃酶、纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶等。纤维素
酶、溶菌酶等单一酶消解细胞壁不完全，一般只能形成少量原
生质体［16］，而复合酶如崩溃酶内含昆布多糖酶、木聚糖酶和
纤维素酶，消解细胞壁的能力强，原生质体制备效果较好。但
针对不同菌株的原生质体制备，选择合适的酶以及组合可以
明显提高原生质体得率。本研究采用正交试验法，以崩溃酶
作为主要细胞壁溶解酶，选择纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶组
合，原生质体得率达到了国内、外同类研究水平。
在 4 种常用稳渗剂中，0． 7 mol /L NaCl 获得的原生质体
最多，可能由于 NaCl等有助于酶与底物结合，对酶反应起促
进作用［17］。液体培养 48 h 的菌丝酶解效果最好;少于或多
于 48 h，酶解产生的原生质体均低于 48 h时。说明幼嫩的菌
丝易形成原生质体，当菌丝培养时间过长时，菌丝细胞壁开始
老化增厚，成分发生变化，对降解酶产生耐受的结构，不容易
被酶解，所以原生质体释放量减少;但当菌丝培养时间过短
时，未产生足够的幼嫩菌丝，被酶解的大部分是接种的老菌
丝，原生质体释放量少，且长出的菌丝过于幼嫩，释放出的原
生质体大小不一，易被复合酶中的蛋白酶降解［8］。一方面 pH
值以及酶解温度直接影响酶的活性，从而影响原生质体得率，
因为只有在最适 pH值和酶解温度时，酶的活性才最高，酶促
反应速率才最大;另一方面 pH 值和酶解温度还会影响真菌
的生理状态，酶解温度较低，不仅降低酶的活性，也降低细胞
膜的流动性，导致获得的原生质体少且小，但是原生质体的活
力比较高［17］。温度上升导致酶失活速率加快，蛋白酶活性增
加，导致原生质体活力下降。综合多种因素得出，制备内生真
菌 E． yangzii Rnj5706 菌株原生质体的优化条件。
真菌原生质体的释放有顶端释放、侧位释放、菌丝段端位
释放和原位释放等方式，在本研究中观察到顶端释放和原位
释放等 2 种主要释放方式。顶端释放主要是由于菌丝顶端部
位是细胞壁初形成的地方，组成的成分相对比较简单，是整个
菌丝中最薄弱、最幼嫩的部分，因此酶解初期，菌丝顶端壁被
酶解，出现孔洞而释放出 1 个或多个原生质体。而原位释放
是在酶解后期菌丝的细胞壁整个被酶解，原生质体在原位形
成自然的球状。在再生阶段，原生质体的再生有 4 种方式:先
萌发长出芽管，由芽管生长转化为菌丝体，以芽生的方式形成
酵母状的链，或细胞群，再生成菌丝;先萌发为短棒状粗菌丝，
而后转化为菌丝和不规则形状的物质，再生成菌丝［17］，本试
验中主要观察到了前 2 种方式的再生过程。
本研究尝试了 2 种原生质体的再生方法，主要包括:(1)
双层固体培养法。先将原生质体包埋于半固体琼脂中，在还
没有凝固的情况下，倾注于底层的再生培养基上。这种方法
的缺点是操作繁琐，融化温度不易控制，温度过高会影响原生
质体活力，而温度降低会导致其在三角瓶中就开始凝固，不易
倒入培养皿中。(2)液体再生涂布平板法。先把原生质体悬
浮液转移到液体再生培养基中，使其在液相中再生一段时间，
再涂布到固体再生培养基上。该方法克服了双层固体培养法
的缺点，所得原生质体再生比率也能满足后续试验的需求，但
使用这种方法时须要注意液体培养时间，培养时间过长再生
菌株形成菌丝并出现菌丝交织，不能形成单菌落;时间过短则
影响再生比率。此外，涂布的量也须要加以注意，涂布原生质
体悬浮液溶度过高或过低都不利于菌落的计数。本研究成功
地实现了禾本科植物内生真菌原生质体的制备和再生，这套
制备和再生方法具有简便、高产的特点，为今后的遗传法分析
和分子育种等工作奠定了基础。
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