全 文 ：第37卷 第2期 林 业 科 技 Vol. 37 No. 2
2 0 1 2 年 3 月 FORESTRY SCIENCE ＆ TECHNOLOGY Mar． 2 0 1 2
文章编号:1001 － 9499 (2012)02 － 0057 － 03
中科院北京植物园壳斗科植物鉴定
*
刘 牧1，2 周世良2 王 玲1＊＊
(1. 东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2. 中国科学院植物所，北京 100093)
摘要:利用 DNA条形码技术对中科院北京植物园壳斗科专类园的 23 份植物材料进行鉴定，从 Genebank 中获得
相关数据，选择 matK、rbcL、trnH-psbA序列引物对样本材料进行 PCR 扩增和测序，通过比较各序列的扩增效
率、有效片段获得率，用 PAUP4. 0 b10 建物种关系树评价不同序列的鉴定能力。本研究认为，matK 序列物种鉴
别能力最高，种间变异差异最大的为 trnH-psbA序列，rbcL相对保守。
关键词:DNA条形码;壳斗科;植物园
中图分类号:Q 94 － 339，S 792. 18 文献标识码:A
中科院北京植物园位于海淀区香山公园和玉
泉山，现有土地面积 74 hm2。园内引种栽培植
物10 000余种(含品种) ，近 150 万株，以引种栽
培珍稀濒危植物和有重要经济价值的植物为主。
鉴于植物园中的植物种类丰富，不仅有国内的物
种，也有从国外引进的物种，因此，对植物园中
的物种进行科学、准确的鉴定就显得尤为必要。
栎属是壳斗科中最大的属，在北半球有着广
泛的自然分布，具有重要的经济价值［1］。依据
不同的分类系统，该属在全世界共有 300 种［2 － 3］
到 531 种［4］。因其分布广、种类多、形态变异复
杂，导致分类困难。因此，以北京植物园中栎属
植物为研究对象，采用 DNA 条形码［5］的方法对
其进行鉴定，以期找到一种可以准确鉴定物种的
方法。
1 材料与方法
1. 1 取样
在中国科学院北京植物园壳斗科区，采集挂
牌或没有挂牌，但有中科院植物园 CVBG 码，以
及在形态上有差别的 23 份壳斗科植物物种样本材
料(表 1 和表 2)。
表 1 园中挂牌样本
中文种名 拉丁名 CVBG码 凭证标本编号
槲树 Quercus dentata BOP010271
板栗 Castanea mollissima 01161175 BOP010328
夏栎 Quercus robur 01080466 BOP010417
夏栎 Quercus robur 01080444 BOP010418
白栎 Quercus fabri 01080567 BOP010426
短柄枹
Quercus glandulifera var．
brevipetiolata
BOP010427
沼生栎 Quercus palustris 01080304 BOP010429
红槲栎 Quercus rubra 01080150 BOP010433
槲栎 Quercus aliena 01080153 BOP010439
枹栎 Quercus serrata 01080155 BOP010440
橿子栎 Quercus baronii 01080557 BOP010441
锐齿槲栎
Quercus aliena var．
acuteserrata
01080164 BOP010442
大果栎 Quercus macrocarpa 01080183 BOP010443
栓皮栎 Quercus variabilis BOP010445
表 2 园中未挂牌样本
采样编号 CVBG提供名称 CVBG码 凭证标本编号
栎属 1 种 A BOP010419
栎属 1 种 B BOP010420
栎属 1 种 C BOP010421
栎属 1 种 D BOP010422
栎属 1 种 E 槲栎 01080377 BOP010423
栎属 1 种 F BOP010424
栎属 1 种 G 白栎 01080364 BOP010425
栎属 1 种 H 星毛栎变种 01080385 BOP010428
栎属 1 种 I 夏栎 01080310 BOP010430
* 哈尔滨市科技攻关项目 (2008AA6CN090) ;中央高校基本科研业务费专项资金项目 (DL09CA10) ;东北林业大学研究生科技创新
项目
林 业 科 技 第 37 卷
在采集样本材料的当天，直接提取 23 份材料
的 DNA，每份取材0. 1 g，放入2. 0 mL离心管中，
并在管内放入磁珠和适量石英砂后，将离心管放
入液氮中浸泡10 min，取出后用 MiniBeadBeater －
96 研磨仪研磨20 s，至材料成粉末状。
1. 2 DNA检测方法
用改良的 CTAB［6］法提取 DNA。
PCR 扩增反应在 PCR仪上进行。3 个 DNA 片
段扩增反应程序均为:94℃预变性4 min，94℃ 变
性1 min，52℃退火1 min，72℃ 延伸1 min。35 个
循环后，72℃延伸10 min。扩增反应采用20 μL的
反应体系。
PCR产物纯化:将 PCR 产物用 ddH2O 补充至
100 μL，转移至1. 5 mL离心管中，向离心管中加入
40% PEG 8 000和 5MNaCl 等体积混合的溶液
110 μL，37℃ 放置 15 min;12 000 r /min 4℃ 离心
15 min;去除上清液，吸出多余液体;加入 500 μL
80%乙醇，12 000r /min4℃离心15 min，重复上一
步，将离心管放在 37℃温箱中干燥多余乙醇，加
20 μL水溶解，电泳检测纯化产物是否丢失。
PCR测序扩增反应:采用10 μL体系，96℃预
变性1 min，96℃变性15 s，50℃退火15 s，60℃
延伸4 min，29 个循环后，60℃延伸30 min，10℃
延伸10 min。
测序纯化:将测序产物用 ddH2O 补充至
100 μL，转移至1. 5 mL离心管中;加400 μL醋酸钠
和乙醇的混合液，室温放置15 min;12 000r /min离
心30 min，吸除上清液;加 700 μL 75% 酒精，
12 000r /min4℃离心15 min吸除上清;重复上一步;
让乙醇挥发干，提交测序。
1. 3 DNA 序列统计分析方法
将所获得的序列先用 SEQUENCHER 4. 7 校对
拼接后，用 ClustalX 2. 0 软件进行序列比对［7］，
再用 SE － AL version 2. 0a11 手工调整［8］，利用
PAUP4. 0 b10［9］根据 UPGMA 法将所得数据与
Genebank中的数据联合建树鉴定试验材料。
2 结果与分析
2. 1 不同片段的 PCR扩增和测序的成功率
测序所得 23 份材料叶绿体 matK、 rbcL、
trnH-psbA编码基因序列，对其 PCR 扩增成功率
(出现明显 PCR条带即判定为成功)、测序成功率
(测序后获得高质量的序列即判定为成功)以及有
效序列的获得率(有效序列比例 = PCR 扩增效率
×测序成功率)进行统计(表 3)发现，23 个样本
的序列使用率都超过了 90%。
表 3 序列 PCR成功率、测序成功率及有效序列获得率
序列 PCR成功率 测序成功率 有效序列获得率
rbcL 100% 96. 15% 96. 15%
matK 100% 96. 15% 96. 15%
trnH-psbA 100% 96. 15% 96. 15%
2. 2 不同片段和联合片段的对应率
由于采集的材料仅有一份非栎属植物，所以
仅从 Genebank 选取栎属植物的 matK， rbcL 和
trnH-psbA 3 组候选条形码序列，分别与试验所得
数据用 PAUP4. 0b10 建 UPGMA树进行了分析。其
结果表明，单片段的建树与园中所给名称相对应
的材料 matK 的对应率最高，rbcL较低;而当有效
对应率乘上 PCR 的成功率后，3 个片段的有效对
应率均降低。不同片段联合建树的效果均没有单
一 matK序列建树效果高(表 4)。
表 4 结果与园中所给名录对应率
序列组合 材料数 对应率 /% 有效对应率 /%
matK 19 82. 61 79. 43
rbcL 13 56. 52 54. 35
trnH 17 73. 91 71. 07
matK + trnH 17 73. 91 68. 34
matK + rbcL 17 73. 91 68. 34
rbcL + trnH 13 56. 52 52. 26
matK + rbcL + trnH 15 65. 22 57. 98
2. 3 正确鉴定物种
通过简单的形态鉴别，结合所得序列与
Genebank中数据联合鉴定，最终确定植物园中的
物种及名称不详物种，并加以修定(表 5)。
表 5 鉴定与修订结果
凭证标本编号 鉴定后中文名 拉丁名
BOP010440 麻栎 Quercus acutissima
BOP010419 夏栎 Quercus robur
BOP010420 白栎 Quercus fabri
BOP010421 锐齿槲栎 Quercus aliena var． acuteserrata
BOP010422 锐齿槲栎 Quercus aliena var． acuteserrata
BOP010424 星毛栎 Quercus stellata
BOP010425 星毛栎 Quercus stellata
BOP010430 大果栎 Quercus macrocarpa
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第 2 期 刘 牧等:中科院北京植物园壳斗科植物鉴定
3 讨 论
本研究尝试用 3 种叶绿体编码基因对栎属及
其近缘属植物进行鉴别，鉴定均超过 50%。由于
单一片段存在不足，不能很好地鉴定所有物种，
因此，一些学者提出植物 DNA 条形码片段组合方
案，如 matK + rbcL 序列可为陆地上大多数植物进
行编码，同时叶绿体 trnH-psbA 片段和核基因 ITS
可作为候选序列［10］，但这些方法在本次鉴定中并
不是很理想的。由于 rbcL 基因过于保守，基因片
段不能达到鉴定目的，故认为 matK基因只能很好
的与形态鉴定数据相对应。由于在 Genebank 中缺
少部分物种相关序列，如 Quercus glandulifera var．
brevipetiolata，Quercus aliena var． acuteserrata 等，
所以也给我们的鉴定增加了困难。
参 考 文 献
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第 1 作者简介:刘牧 (1985 －) ，男，东北林业大学
园林学院硕士研究生。
通讯作者:王玲 (1972 －) ，女，东北林业大学园林
学院副教授。
收稿日期:2011 － 12 － 12
Beijing Botanical Garden Fagaceae Identification
of Chinese Academy of Sciences
LIU Mu
(Northeast Forestry University，Heilongjiang Harbin 150040)
Abstract Identification of 23 plant materials using DNA barcoding to the Chinese academy of sciences
Beijing botanical garden fagaceae special garden，to obtain the relevant data from the Genebank，select
the matK， rbcL， trnH-psbA sequence of primers for PCR amplification and sequencing of sample
material． By comparing the sequence of the amplification efficiency，effective fragment to obtain the
rate，evaluation of the different sequence identification use PAUP4. 0 b10 built species tree． This study
suggests that the matK sequence of species ability to identify the highest in the experiment，Interspecific
variation of the largest difference for the trnH-psbA sequence，rbcl relatively conservative．
Key words DNA barcoding;Fagaceae;Botanical garden
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