全 文 ：书基于 DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物
系统发生分析
①
张 哲1，2， 孔 艳1，2， 李 岩1，2， 王习勇1， 刘 斌1
(1．中国科学院新疆生态与地理研究所，荒漠与绿洲生态国家重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011;
2．中国科学院大学，北京 100049)
摘 要:以新疆地区 4 属 5 种罂粟科植物为研究对象，利用 DNA测序技术测定植物叶绿体 rbcL基因、核基因 ITS，
并研究将这两种特定基因联合作为 DNA条形码在识别新疆地区罂粟科植物的可行性和有效性。对 15 条新疆罂
粟科植物的 ITS-rbcL序列进行信息分析，发现其基因片段多态性位点较多，种内平均遗传距离小于种间。另外，以
4 种毛茛属植物做外类群对 31 种罂粟科植物进行聚类分析。结果显示:同属植物基本聚在一起，说明这一联合片
段用来鉴定罂粟科植物中属的分类阶元是可行的。所选择的 ITS-rbcL 片段对罂粟科植物的分类鉴定有一定的参
考价值。通过研究还发现，新疆鳞果海罂粟与伊犁秃疮花的亲缘关系较该属其他植物更为接近;新疆重点保护植
物红花疆罂粟与黑环罂粟为近缘种;rbcL基因由于其保守度较高，并不适合作罂粟科植物的进化标记基因。
关键词:罂粟科;DNA条形码;DNA测序技术;rbcL;ITS;系统发生
罂粟科(Papaveraceae)植物中国 19 属 300 余
种，南北均产，以西南为多，其中血水草属和疆堇属
为中国特有属。该科新疆产 11 属 39 种，南北疆均
有。罂粟科分为 3 大亚科:罂粟亚科(Papave-
roideae)、角茴香亚科(Hypecoideae)、荷包牡丹亚科
(Fumarioideae)〔1〕。本文中的罂粟科植物属于罂粟
亚科及荷包牡丹亚科。罂粟科植物分布范围广泛，
适应能力强〔2 － 3〕。表观遗传学提出了不同环境下相
同基因出现不同表达的情况〔4〕以及可能出现的杂
交等，将给罂粟科植物的鉴定带来很大难度。近年
来，DNA条形码技术能有效弥补形态数据分类的不
足，给植物分类提供客观的分子依据。
由不同的基因组序列(核、质体、线粒体)相互
组合，构建系统发生树，是分子系统生物学常见的手
段，rbcL与 ITS这两个 DNA区域在其他植物类群分
类应用中是常用的分子标记。DNA 条形码由 Kress
等〔5〕首次提出，以后又陆续提出了候选的条形码基
因如 rbcL、matK、rpsB、ITS 等，由于单个基因的变异
程度有限，在不同分类阶元内使用条形码组合成为
研究的热点〔6〕。在陆生植物中常用的有 rbcL和 ITS
等标记基因〔7 － 10〕。本文测定了新疆 4 属 5 种 26 份
罂粟科植物的 rbcL 和 ITS 基因序列，并分别用
rbcL、ITS基因及其联合序列作为条形码，验证它在
新疆罂粟科植物鉴定中的有效性。
1 材料和方法
1． 1 实验材料
实验材料来源于春季北疆地区野外采集的植
物，由中国科学院新疆生态与地理研究所王习勇先
生鉴定(表 1)。此外，引用 GenBank 中罂粟科部分
植物的序列与本研究中的植物作比对，并设毛茛科
4 种植物做外类群(表 2)。
1． 2 DNA提取、PCＲ扩增及序列测定
1． 2． 1 DNA的提取 取干燥保存的植物标本组织
5 g，经液氮及 PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)充分研
磨后，采用改良的 CTAB 法〔11〕提取植物的基因组
DNA，经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定总 DNA
的浓度及纯度。
1． 2． 2 PCＲ扩增 rbcL基因的扩增体系:50 μL体
系中含有浓度为 10 μmol 的 rbcL-YF(序列为 5’
GTA AAA TCA AGT CCA CCA CG 3’)和 rbcL-YＲ
(序列为5’ATG TCA CCA CAAACAGAGACT AAA
第 31 卷 第 2 期
2014 年 3 月
干 旱 区 研 究
AＲID ZONE ＲESEAＲCH
Vol． 31 No． 2
Mar． 2014
① 收稿日期:2012 － 12 － 03; 修订日期:2013 － 03 － 11
基金项目:中国科学院新疆生态与地理研究所百人计划支持项目(Y076071001) ;荒漠与绿洲生态国家重点实验室资助
作者简介:张哲(1987 －) ，女，硕士研究生，主要从事系统基因组研究． E-mail:zhangzhe1234562008@ 126． com
通讯作者:刘斌． E-mail:bliu@ ms． xjb． ac． cn
322 － 328 页 http:/ /azr． xjegi． com
DOI:10.13866/j.azr.2014.02.003
表 1 实验材料及信息
Tab． 1 Information of materials in the study
编号 种名 rbcL(登录号) ITS(登录号) 采集地点 纬度(N) 经度(E) 海拔 /m
01 黑环罂粟 Papaver pavoninum KC491753 KC491735 霍城县 44°0403″ 080°5214″ 660
02 伊犁秃疮花 Dicranostigma iliensis KC491754 － 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
03 KC491755 － 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
04 KC491756 KC491736 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
05 KC491757 KC491737 新源县 43°1341″ 082°2420″ 1 018
06 KC491758 － 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
07 KC491759 KC491738 新源县 43°1341″ 082°2420″ 1 018
08 KC491760 KC491739 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
09 鳞果海罂粟 Glaucium squamigerum KC491761 KC491740 乌鲁木齐 43°4035″ 087°4129″ 1 231
10 KC491762 KC491741 托里—阿拉山口 45°2813″ 082°3427″ 917
11 KC491763 － 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
12 KC491764 － 乌鲁木齐 43°4600″ 087°3429″ 978
13 KC491765 KC491742 托里县 43°1342″ 082°2421″ 1 018
14 KC491766 KC491743 呼图壁县 44°0915″ 086°5141″ 578
15 KC491767 － 托里—阿拉山口 45°2813″ 082°3427″ 917
16 KC491768 KC491744 呼图壁县 44°0915″ 086°5141″ 578
17 － KC491745 巴尔鲁克山 45°5716″ 082°3444″ 1 011
18 KC491769 KC491746 巴尔鲁克山 45°5716″ 082°3444″ 1 011
19 － KC491747 巴尔鲁克山 45°5716″ 082°3444″ 1 011
20 野罂粟 Papaver nudicaule KC491770 KC491748 察布查尔 43°2503″ 081°0246″ 2 954
21 KC491771 － 察布查尔 43°2503″ 081°0246″ 2 954
22 － KC491749 天山 43°2450″ 084°2234″ 2 872
23 KC491772 KC491750 天山 43°2450″ 084°2234″ 2 872
24 对叶元胡 Corydalis ledebouraiana KC491773 KC491751 巴尔鲁克山 46°0245″ 082°4132″ 1 167
25 KC491774 － 巴尔鲁克山 46°0245″ 082°4132″ 1 777
26 KC491775 KC491752 霍城县 44°2817″ 081°0739″ 1 167
“ －”代表没有序列。下同。
表 2 GenBank的引用序列及登录号
Tab． 2 Ｒeference sequences and accession numbers in GenBank
物种中文名 物种拉丁名 rbcL登录号 ITS登录号
蓟罂粟 Argemone mexicana gi |290586469 | gi |37791009 |
紫堇属植物的一种 Corydalis flavula gi |67079091 | gi |67078953 |
刻叶紫堇 Corydalis incisa gi |115490367 | gi |115520952 |
患秃疮花 Dicranostigma franchetiana gi |2687472 | gi |37791011 |
花菱草 Eschscholzia californica gi |115490351 | gi |115520946 |
花菱草亚种 Eschscholzia californica sp． gi |115490353 | gi |384039004 |
黄海罂粟 Glaucium flavum gi |379036126 | gi |327312289 |
黄海罂粟 Glaucium flavum gi |2687478 | gi |327312289 |
五脉绿绒蒿 Meconopsis quintuplinervia gi |229464445 | gi |402545382 |
小果博落回 Macleaya microcarpa gi |229464443 | －
西欧绿绒蒿 Meconopsis cambrica gi |379031692 | gi |402545371 |
加州宽丝罂粟 Platystemon californicus gi |2687486 | －
刺圆头罂粟 Papaver hybridum gi |379036668 | gi |82547066 |
罂粟 Papaver somniferum gi |379035232 | gi |115520943 |
鬼罂粟 Papaver orientale gi |115490359 | gi |115520945 |
大红罂粟 Papaver bracteatum gi |115490355 | gi |115520944 |
野罂粟 Papaver nudicaule gi |115490357 | gi |115520948 |
北极罂粟 Papaver radicatum gi |115490347 | gi |82547028 |
红花疆罂粟 Ｒoemeria refracta － gi |82547064 |
毛茛属植物的一种 Ｒanunculus acris gi |359388829 | gi |50812056 |
水毛茛 Ｒanunculus aquatilis gi |359388833 | gi |325656701 |
毛茛属植物的一种 Ｒanunculus arcticus gi |359388841 | gi |50811938 |
匍枝毛茛 Ｒanunculus repens gi |379037256 | gi |50812041 |
323第 2 期 张 哲等:基于 DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物系统发生分析
GC 3’)上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，rTaq
(浓度 5 U·μL －1，TaKaＲa 公司)0． 2 μL，10 × PCＲ
缓冲液 5 μL，dNTP(浓度为每种碱基 2． 5 mol·
L －1)4 μL，体积分数为 1% 二甲基亚砜(DMSO) ，其
余无菌蒸馏水补足。ITS基因的扩增体系同 rbcL 基
因，不同之处在于所用引物为 ITS4(序列为 5’TCC
TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’)〔12〕，ITS5 序列为
(5’GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G 3’)。
PCＲ反应程序均为:95 ℃预变性 10 min;94 ℃变性
30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 90 s，35 个循环;
72 ℃延伸10 min。PCＲ 扩增反应均在 MG96 + 型
PCＲ仪(杭州朗基)上进行。
1． 2． 3 测序 PCＲ 所扩增产物以上游引物为测序
引物进行单向测序，由博迈德生物有限公司完成。
所得到 rbcL序列长度为 540 bp 左右，ITS 序列长度
为 700 bp 左右。将序列提交到 GenBank 所得到的
序列号见表 1。
1． 3 数据分析和系统发生树的构建
序列编辑和质量控制由软件 Phred 完成〔13 － 14〕。
rbcL和 ITS序列构建联合矩阵，用软件 ClustalW 进
行序列比对和调整〔15〕，空位(gap)作丢失(missing)
处理。应用 MEGA的 MODEL选项对联合序列矩阵
进行模型选择〔16〕，获得相关碱基替代模型和位点差
异模型及参数等信息，得到最佳模型为 K2 + G。分
别用 MEGA 对联合矩阵基于邻近连接法构建 NJ
(neighbor joining)树〔17〕。基于最大似然法构建 ML
(maximum likelihood)树，采用自展检验获得一致树
(bootstraps，BS) ，评估分支的可靠性〔18〕。此外，还
基于 MrBayes 软件构建系统发生树，选择 GTＲ 模
型，rates 设置为 invgamma(gamma-shaped rate varia-
tion with a proportion of invariable sites) ，设置分析代
数(ngen，number of generations)为 100 000 ～
1 000 000，对链取样频率(samplefreq)为 10。
2 结果分析
2． 1 序列分析
对罂粟科所选植物的样本序列及联合矩阵进行
相关统计分析(表 3)。
用软件 DNAsp 分析 31 个个体的 860 个位点，
其中不包含所选外类群，共发现 409 个可变位点。
单一多态位点 72 个，2 个及 2 个以上突变的多态位
点 356 个。
表 3 DNA序列信息分析
Tab． 3 Information analysis of DNA sequences
DNA
序列
样本数
序列比
对长度
/bp
变异
位点
/个
信息
位点
/个
信息位
点比例
/%
GC
含量
/%
rbcL 41 520 60 49 9． 42 43． 84
ITS 35 718 370 305 42． 48 62． 14
ITS-rbcL 31 1 205 428 353 29． 29 54． 77
表 4 基于 Kimura 2-Parameter 距离模式的
种内遗传距离
Tab． 4 Intraspecific genetic distance based on
Kimura 2-Parameter distance method
分类单元 种内遗传距离
组 1
组 2 0． 001
组 3 0． 000
组 4 0． 007
组 5 0． 010
表 5 基于 Kimura 2-Parameter 距离模式的
种间遗传距离
Tab． 5 Interspecific genetic distance based on
Kimura 2-Parameter distance method
组 1 组 2 组 3 组 4 组 5
组 1
组 2 0． 155
组 3 0． 151 0． 006
组 4 0． 051 0． 153 0． 152
组 5 0． 187 0． 142 0． 138 0． 183
基于 ITS-rbcL联合矩阵，将植株分为以下组分:
组 1 － 01 黑环罂粟，组 2 － 04、05、07、08 伊犁秃疮
花，组 3 － 09、10、13、14、16、18 鳞果海罂粟，组 4 －
20、23 野罂粟，组 5 － 24、26 对叶元胡(表 1、表 4)。
所选植株间的遗传距离采用生命条形码联盟
(CBOL)，建议使用的遗传距离计算模型 K2P 计
算〔7，19〕。以组 2 为例，得到种内的平均遗传距离为
0． 001，种间平均遗传距离为 0． 114，种间距离大于
种内距离，说明所选 ITS-rbcL 序列片段可作为鉴定
罂粟的参考序列(表 4 ～ 5)。
2． 2 系统发生分析
用引自 GenBank 序列、毛茛属外类群及所测
ITS-rbcL联合序列比对后，构建系统发生树(图 1)。
对图 1 的 3 种系统发生树的拓扑结构分析表
明，共同点在于秃疮花属、紫堇属、罂粟属、花菱草属
各为 1 支，在 3 种树中均发现鳞果海罂粟属于海罂
粟属，并入了秃疮花属，2种绿绒蒿属植物都并入罂
423 干 旱 区 研 究 31 卷
图 1 联合序列系统发生树
Fig． 1 Phylogenetic trees of the integrated sequence
粟属。MEGA 5． 0 所建的 NJ树与ML树结果基本一
致，贝叶斯树显示了一点不同之处(图 1c)，鳞果海
罂粟和伊犁秃疮花因地区不同而出现小分支，这说
明贝叶斯树可以更好地区分所选类群。
图 2(a、b)与图 1c中基于贝叶斯法构建系统发
生树的拓扑结构分析表明，rbcL贝叶斯树(图 2a)主
要分为罂粟属、紫堇属、秃疮花属(鳞果海罂粟列入
其中)，该树可以将紫堇属的对叶元胡按地区分为
2 个次级支，但并未将伊犁秃疮花与鳞果海罂粟分
开。ITS贝叶斯树(图 2b)对所选的物种有较好的
区分度，首先鳞果海罂粟及伊犁秃疮花分为姊妹群，
伊犁秃疮花和鳞果海罂粟不同地点分为不同次级
支，野罂粟按照地区也可分为 2 支，红花疆罂粟罂粟
与黑环罂粟为近缘。这些特点表明，ITS 序列比
rbcL序列能更有效地对罂粟科植物进行分类。ITS-
rbcL联合序列贝叶斯树结果显示，有效地将伊犁秃
疮花与鳞果海罂粟分开，与 ITS 构建的系统发生树
基本一致。
523第 2 期 张 哲等:基于 DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物系统发生分析
图 2 贝叶斯系统发生树图
Fig． 2 Bayesian phylogenetic tree
3 讨 论
MEGA 5． 0 构建的 NJ、ML 树与贝叶斯软件构
建的贝叶斯树(图 1)中发现，贝叶斯树能够更有效
地对罂粟科植物分类。在贝叶斯树(图 1c)中可以
看出，鳞果海罂粟能够按照地区更有效地分类。
rbcL、ITS及联合矩阵所构建的贝叶斯树中显示
(图 2) ，ITS 及联合矩阵有较好的效果。但要区分
种及种以下的植株，仍需要找到其他的分子联合基
因作为分类标准。Kress 等〔5〕表示，因 rbcL 基因变
异程度低，所以单独使用难以满足分类要求。在
DNA序列信息中显示，对 41 条 rbcL序列进行分析，
序列长度在 520 bp左右，变异位点有 60 个，信息位
点有 49 个，信息位点占 9． 42%;对 35 条 ITS序列进
行分析，序列长度在 718 bp 左右，变异位点 370 个，
信息位点 305 个，信息位点占 42． 48%;在联合序列
中，对 31 条序列进行分析，序列长度基本在
1 205 bp左右，变异位点 428 个，信息位点 353 个，信
息位点占 29． 29%。比较发现，rbcL 序列的长度较
短，变异位点少，信息位点比例较其他两种序列都
低，保守程度高，且在系统树(图 2a)中发现，rbcL不
能够将鳞果海罂粟及伊犁秃疮花区分开。
Sass等〔20〕利用 7 个叶绿体基因和核糖体 ITS
片段，对裸子植物苏铁类群进行了探索研究，并提出
ITS在变异过程中是最适用的。在本研究中同样证
实 ITS在鉴定罂粟属植物方面是一种较有效的分子
标记。
此外，在 ITS-rbcL 联合序列构建贝叶斯树(图
1c)中显示，秃疮花属及海罂粟属是一个大的分支
类群，但是其中显示新疆的伊犁秃疮花与鳞果海罂
粟为姊妹群，伊犁秃疮花与患秃疮花并未分在同支
上，鳞果海罂粟与角罂粟也未分为同支，并且在新疆
植物志第 2 卷〔1〕中显示，伊犁秃疮花与海罂粟属植
物极其相似，区别在于本种蒴果无隔膜，那是由于地
域的不同导致新疆的鳞果海罂粟与伊犁秃疮花会有
更为接近的进化关系吗?是否应把伊犁秃疮花分到
海罂粟属?这些疑问有待证明。在 GenBank 中引
用的西欧绿绒蒿是第三纪孑遗植物〔21〕，袁长春
等〔22〕利用 ITS 基因分析西欧绿绒蒿及其近缘类群
之间的关系，表明该植物与绿绒蒿属的其他种之间
差异较其与罂粟属种类间差异更大，与罂粟属有更
近的亲缘关系，将其并入罂粟属中更为合理。本研
究中也发现，西欧绿绒蒿与鬼罂粟、大红罂粟、罂粟
623 干 旱 区 研 究 31 卷
等植物有更近的亲缘关系，与五脉绿绒蒿的亲缘关
系较远。在系统发生树中显示，新疆的野罂粟与
GenBank中的野罂粟序列存在差异，这种现象是否
因地域差异而造成的也有待研究。基于 ITS 构建的
系统发生树结果显示，GenBank 中引用的红花疆罂
粟与新疆黑环罂粟有很近的进化关系，红花疆是新
疆重点保护植物之一。系统发生树是一种亲缘分支
分类方法。在树中，每个节点代表其各分支的最近
共同祖先，而节点间的线段长度对应演化距离。本
研究中，贝叶斯树将不同地域的同种植物都能够在
进化时间的角度上区分开，说明微弱的变异都可在
分子水平上显示出来，对于植物进化研究，分子标记
有一定的特殊性及价值尺度。
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723第 2 期 张 哲等:基于 DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物系统发生分析
Phylogeny of Some Papaveraceae Plants in Xinjiang
Based on DNA Barcoding Technology
ZHANG Zhe1，2， KONG Yan1，2， LI Yan1，2， WANG Xi-yong1， LIU Bin1
(1． State Key Laboratory of Desert and Oasis Ecology，Xinjiang Institute of Ecology and Geography，Chinese Academy of Sciences，
Urumqi 830011，Xinjiang，China;2． University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract: DNA sequencing technology was used to sequence the chloroplast rbcL gene and nuclear gene ITS of 5
species of 4 genus individuals in papaveraceae． The main purpose was to verify the feasibility and availability of the
integrated gene sequence as a method to identify papaveraceae plants in Xinjiang． The analyzed results of ITS-rbcL
and sequences of 15 Xinjiang poppy plants revealed that the integrated gene fragment had many polymorphism sites，
and the average intraspecific genetic distance was shorter than the average interspecific genetic distance． In addi-
tion，based on 4 ranunculus outgroups and 31 poppy plants，a cluster analysis was carried out，and it was revealed
that most of the same genus individuals stayed together． So this fragment was feasible to identify the genus taxa of
papaveraceae，and it had a certain reference value for classifying and identifying poppy plants． It was also found
that the Glaucium squamigerum and Dicranostigma iliensis have a closer kinship than other plants of the same two
genera，Ｒoemeria refracta，a key protected plant in Xinjiang，has a close relation with Papaver，and rbcL is too
conservative to do as an evolutionary gene marker in papaveraceae．
Key words: papaveraceae;DNA barcode;DNA sequencing;rbcL;ITS;
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
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823 干 旱 区 研 究 31 卷