全 文 ：南 方 农 业 学 报 45卷
收稿日期：2013-08-21
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（41202013）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（CUGL110219）；中国地质大学
（武汉）教学实验室开放基金项目（SKJ2012019）
作者简介：侯新东（1977-），主要从事生物化学与分子生态学研究工作，E-mail:houxd@cug.edu.cn
荨麻科植物DNA条形码的筛选
侯新东，韩大永，曾 莉，邢婷婷
（中国地质大学 环境学院，武汉 430074）
摘要：【目的】评价不同DNA条形码候选序列对荨麻科植物的鉴别能力，为荨麻科植物鉴定提供参考。【方法】使用
ITS、matK、rbcL和psbA-trnH序列的通用引物对荨麻科植物进行PCR扩增和测序，比较各序列的扩增效率、测序成功
率，分析获得序列的碱基组成及变异，比较种间和种内变异的差异，并对条形码间距进行评估。【结果】psbA-trnH序列
在荨麻科植物13个种30个样品中的扩增成功率最高（100.0%）。psbA-trnH的有效序列获得率最高，为95.4%，ITS为
92.3%，rbcL为90.1%，matK为零。ITS序列种间遗传距离范围为0~0.508，psbA-trnH序列为0~0.522，rbcL序列为0~0.532。
ITS序列在种间、种内的差异变异及条形码间距较rbcL与psbA-trnH具有更明显的优势。ITS序列构建的系统发育树中
不同物种形成单系分支的百分比最高，其次为psbA-trnH、rbcL序列。聚类结果表明，MP法的聚类效果最好，其次为
UPGMA法、ML法，NJ法最不理想。【结论】荨麻科植物种间变异明显大于种内变异，DNA条形码适用于荨麻科植物种
水平上的鉴定；3个候选序列中无任何一个序列可完全鉴别出不同种类的荨麻科植物，ITS、rbcL与psbA-trnH可作为鉴
别荨麻科植物的DNA条形码序列组合。
关键词：荨麻科植物；DNA条形码；ITS；rbcL；psbA-trnH；matK
中图分类号：Q78；Q949 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2014）02-0178-06
0 引言
【研究意义】荨麻科（Urticaceae）植物在全球约有47
个属1300个种，在中国有25属352个种63个变种，主要分
布于长江流域以南亚热带和热带地区。该科中许多种
类的茎皮中均富含纤维，如苎麻属、荨麻属、艾麻属等
均为重要的纤维植物。其中苎麻（Boehmeria nivea）、悬
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2014.2.178
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2014，45（2）：178-183
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
Screening potential DNA barcode regions for Urticaceae plants
HOUXin-dong，HANDa-yong，ZENGLi，XINGTing-ting
（School of Environmental Studies，China University of Geosciences，Wuhan 430074，China）
Abstract：【Objective】Identification ability of DNA barcode sequences for Urticaceae plants was evaluated to provide ref-
erences for Urticaceae plants identification. 【Method】DNA fragments of 4 hot regions （ITS，matK，rbcL and psbA-trnH） were
amplified by PCR and sequenced using universal primers from Urticaceae family to compare PCR amplification efficiency and
sequencing success rate. The nucleotide constitution and mutation of sequences were analyzed to compare inter- and intraspe-
cific divergences and estimate barcoding gap. 【Result】psbA-trnH region had the highest amplification efficiency（100.0%）
in 30 plant samples belonging to 13 Urticaceae species. The sequencing efficiency rate was the highest for psbA-trnH region，
which was 95.4%. It was 92.3%， 90.1%， and 0 for ITS， rbcL and matK， respectively. The genetic distance of ITS sequences
was from 0 to 0.508. The genetic distance of psbA-trnH sequence was from 0 to 0.522. The genetic distance of rbcL sequence
was from 0 to 0.532. ITS region had better inter- and intraspecific divergences and DNA barcoding gap than other tested re-
gions （rbcL and psbA-trnH）. The phylogenetic tree based on ITS sequence had the highest percentage on a monophyletic clade
for different species， and followed by psbA-trnH and rbcL sequences. The clustering results showed that the best method was
MP， followed by UPGMA， ML and NJ. NJ method was the most unsatisfactory. 【Conclusion】The interspecific divergences
were significantly bigger than the intraspecific divergences in Urticaceae plants. DNA barcode was suitable for identifying Ur-
ticaceae plants. Among all sequences in this study， no any single sequence could completely identify different types of Ur-
ticaceae species. ITS，rbcL and psbA-trnH can be used as a combination of DNA barcode sequence to identify the species in
Urticaceae.
Key words： Urticaceae； DNA barcoding； ITS； rbcL； psbA-trnH； matK
2期
表 1 荨麻科植物样本信息
Tab.1 Information of Urticaceae samples
编号 中文名 拉丁名 样本数量
No. Chinese Latin name Sample
name quantity
1 苎麻 Boehmeria nivea 2
2 大叶苎麻 Boehmeria grandifolia 2
3 序叶苎麻 Boehmeria clidemioides var.diffusa 2
4 悬铃叶苎麻 Boehmeria tricuspis 2
5 小赤麻 Boehmeria spicata 2
6 冷水花 Pilea notata 2
7 矮冷水花 Pilea pepoides 3
8 透茎冷水花 Pilea mongolica 2
9 粗齿冷水花 Pilea fasiata 3
10 三角叶冷水花 Pilea swinglei 2
11 赤车 Pellionia radicans 3
12 庐山楼梯草 Elatostema stewaardii 3
13 糯米团 Memorialis hirta 2
铃叶苎麻（Boehmeria tricuspis）和红火麻（Girardinia
suborbiculata）是我国南方较常见的栽培优良纤维植物，
在纺织及其他工业生产中均有广泛应用（王文采和陈
家瑞，1995）。此外，冷水花属、赤车属、楼梯草属中的一
些种类可作为药用植物，如长柄冷水花、短叶赤车、异
叶楼梯草等具有祛风通络、活血散瘀、消肿止痛的功能
（万明香和何顺志，2005）。由于荨麻科植物种类繁多、形
态结构差异复杂，分布较为广泛，因此，探讨一种快速
准确鉴定荨麻科物种的方法，对荨麻科物种的鉴定和
应用具有重要意义。【前人研究进展】DNA条形码概念
由加拿大动物学家Hebert等于2003年首次提出，DNA条
形码（DNA barcoding）是利用一个或几个短DNA片段
对地球上现有的物种进行快速、准确识别和鉴定的一
项新方法（刘宇婧等，2011），是近年来迅速发展起来的
一种全新的物种鉴定技术，为解决传统分类学面临的
难题开拓了新视野，已成为国际上生物多样性研究的
热点之一。目前，DNA条形码在植物分类及多样性方面
的研究和应用尚处于探索阶段，虽然学者们在各种植
物的DNA条形码候选序列及其组合开展了相关研究
（Chen et al.，2010；罗焜等，2010；王珂等，2011；Peter et
al.，2011；黄琼林等，2013；马新业等，2014），但这些序列
能否适用于所有的科或属，仍需进一步验证。对于我国
荨麻科植物，康冬丽等（2008a，2008b）测定了荨麻科苎
麻属大叶苎麻组中9种4变种的核基因组的ITS序列，并
进行了系统发育分析；同时对苎麻属4个种的rbcL序列
进行了PCR扩增和T/A克隆产物的序列测定，结合Gen-
Bank中荨麻科rbcL数据，分析了荨麻科中9个属间的亲
缘关系。此外，还测定和分析了荨麻属中10个种和8个
变种的TrnL-F序列，并构建了苎麻属植物的分子系统进
化树，探讨了该属部分种之间的系统发育关系（康冬丽
等，2011）。【本研究切入点】由于DNA条形码可用于探
索、检测和辨识未曾被描述过的物种和疑难物种，因此，
运用DNA条形码技术可为荨麻科植物的分类鉴定和系
统学研究提供新的思路和方法。【拟解决的关键问题】
以应用较多的植物DNA条形码候选序列ITS、matK、ps-
bA-trnH及rbcL对荨麻科植物种类的鉴别能力进行比较
研究，考察这些序列作为该科植物DNA条形码通用序
列的适用性，以期为DNA条形码技术在荨麻科植物中
的应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
试验材料为荨麻科13个种30份样本（表1），采自江
西省九江市庐山，由中国地质大学环境学院生物科学
与技术系程丹丹副教授鉴定，数字影像信息及凭证标
本保存于中国地质大学（武汉）。
1.2试验方法
1. 2. 1 样品DNA的提取、PCR扩增和测序 称取经硅
胶干燥的不同荨麻科植物样品叶片约0.1000 g，用液氮
研磨后，使用植物DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech
Co.，中国）提取总DNA。候选序列ITS、rbcL和psbA-trnH
通用引物参照Kress等（2005）设计，matK引物序列参照
Lahaye等（2008）设计。PCR反应在PTC-100 PCR仪（MJ
公司，美国）上进行，反应总体积为50.0 μL，包含DNA模
板 50~70 ng，25 mmol/L MgCl2 5.0 μL，10 mmol/L
dNTPs 2.0 μL，5 U的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L
的正反向引物各3.0 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性
5 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环
后；72 ℃延伸10 min，根据具体情况而略有变动。PCR扩
增产物在冰箱中-20 ℃保存。
扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳后，以QIAGEN
（德国）公司生产的凝胶回收试剂盒纯化，再送南京金斯
瑞生物科技有限公司直接测序（ABI 3730型自动测序
仪）。为保证测序的准确性，均采用正反双向测序。
1. 2. 2 统计分析 利用Clustal X2（Larkin et al.，2007）
和Bioedit（Hall，1999）软件对所测DNA序列进行比对并
辅以手工校正；使用Mega 5.0计算所得序列的碱基组
成、序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率
及其比率（Tamura et al.，2011）。采用SPSS统计软件对
各条形码序列种间与种内的遗传距离进行Wilcoxon
Signed Rank Tests检验（Lahaye et al.，2008），通过比较
序列种间和种内变异的分布评估条形码间距（Barco-
ding gap）。用Mega 5.0构建系统发育树，采用1000次抽
样进行自展分析，根据抽样自展值评估各序列的鉴定
效果。
2 结果与分析
2.1PCR扩增效率与测序成功率
通过对4个候选序列的PCR扩增效率（出现明显
侯新东等：荨麻科植物DNA条形码的筛选 179· ·
南 方 农 业 学 报 45卷
PCR条带即判定为成功）、测序成功率（测序后获得高质
量的序列即判定为成功）及有效序列的获得率（PCR扩
增效率×测序成功率）进行统计（表2），结果表明，ps-
bA-trnH的有效序列获得率为95.4%；ITS的有效序列获
得率为92.3%；rbcL为90.1%；matK为零。尽管试验的样
本数量较少，但这些数据基本可以反映各候选条形码
序列对荨麻科物种分析能力的差异。在上述候选序列
中，由于matK的有效序列获得率为零，因此在后续研究
分析中被排除。
2.2序列分析
2. 2. 1 不同DNA条形码的序列及变异 经比对后，所
获ITS序列共有757个排列位点，其中保守位点338个，约
占44.6%，变异位点419个，约占55.4%；简约信息位点
306个，约占40.4%；单一多态位点69个，约占9.1%。A、T、
G、C碱基平均含量分别为23.0%、22.4%、27.3%和27.4%。
其中，转换突变的核苷酸位点数82个；颠换突变的核苷
酸位点数89个，转换/颠换为0.9。
经比对后，所获psbA-trnH序列共有332个排列位
点，其中保守位点200个，约占60.2%，变异位点132个，约
占39.8%；简约信息位点52个，约占15.7%；单一多态位
点22个，约占6.6%。A、T、G、C碱基平均含量分别为
33.2%、37.1%、17.2%和12.6%。其中，转换突变的核苷酸
位点数21个；颠换突变的核苷酸位点数31个，转换/颠换
为0.7。
经比对后，所获rbcL序列共有708个排列位点，其中
保守位点638个，约占90.1%，变异位点70个，约占9.9%；
简约信息位点37个，约占5.2%；单一多态位点32个，约占
4.5%。A、T、G、C碱基平均含量分别为28.1%、29.9%、
22.4%和19.6%。其中，转换突变的核苷酸位点数16个；
颠换突变的核苷酸位点数9个，转换/颠换1.9。
2. 2. 2 不同DNA条形码候选序列反映的种内及种间
差异 利用Mega 5.0计算各条形码序列种内遗传距离
（Intraspecies genetic distance）及种间遗传距离（Inter-
species genetic distance），距离模型采用Kimura-2-pa-
rameter distance（K-2P）模型计算，其变异分布见图1。由
图1可知，ITS序列种间遗传距离范围为0~0.508，平均距
离为0.348；psbA-trnH序列为0~0.522，平均距离为0.275；
rbcL序列为0~0.532，平均距离为0.376；种间变异明显大
于种内变异，表明DNA条形码适用于荨麻科植物种水
平上的鉴定。
2. 2. 3 不同序列变异性的比较和条形码间距的评
估 使用Wilcoxon检验，根据P＜0.05为显著差异性的
原则，结果表明（表3~4），ITS和psbA-trnH序列的种间
和种内变异性均大于rbcL序列的变异性，并存在显著
性差异；而ITS序列与psbA-trnH序列的变异差异不显
著。从不同序列种间和种内变异的分布图（图1）来看，
ITS、psbA-trnH和rbcL序列均没有形成明显的变异间
隔区，序列种间和种内变异有较多重复，rbcL序列的
表 2 不同DNA序列PCR扩增及测序结果
Tab.2 Results of PCR amplification and sequencing by using
different DNA sequences
序列
Sequence
ITS
psbA-trnH
rbcL
matK
PCR扩增
成功率（%）
Successful rate of
PCR amplification
92.3
100.0
92.3
23.1
测序
成功率（%）
Successful rate
of sequencing
100.0
95.4
97.6
0
序列有效
获得率（%）
Effective rate
of sequence
92.3
95.4
90.1
0
图 1 荨麻科植物3个序列的种间变异和种内变异分布
Fig.1 Distribution of interspecific and intraspecific variations in
Urticaceae
A：ITS；B：psbA-trnH；C：rbcL
遗
传
距
离
G
e
n
e
t
i
c
d
i
s
t
a
n
c
e
K-2P距离K-2Pdistance
0
5
10
15
20
25
30
35
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

 Interspecies

 Intraspecies
遗
传
距
离
G
e
n
e
t
i
c
d
i
s
t
a
n
c
e
K-2P距离K-2Pdistance
0
5
10
15
20
25
30
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

 Interspecies

 Intraspecies
0
5
10
15
20
25
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

 Interspecies

 Intraspecies
遗
传
距
离
G
e
n
e
t
i
c
d
i
s
t
a
n
c
e
K-2P距离K-2Pdistance
种间 terspecies
种内 ntra pecies
种间 erspecies
种内 ntra pecies
种间 erspecies
种内 ntra pecies
A
B
C
180· ·
2期
种间变异偏小；与ITS、rbcL序列相比，psbA-trnH序列
种内变异相对更集中于图的左端，这种分布表明该序
列有利于物种鉴定。
2. 2. 4 候选序列物种鉴定的有效性 从表5中可以
看出，在采用UPGMA、MP、NJ和ML聚类方法中，ITS
序列构建的系统发育树中不同物种形成单系分支的
百分比最高，rbcL序列构建的系统树中形成单系的物
种比例最低，psbA-trnH的单系聚类正确率介于前两者
之间，处于中等水平。从聚类方法的结果来看，MP法
的聚类效果最好，其次是UPGMA法，ML法的聚类效
果也较好，NJ法最不理想。
3 讨论
3.1荨麻科DNA条形码候选序列的筛选
本研究以13种荨麻科植物核基因组的ITS序列、
叶绿体基因组的rbcL基因、matK基因和psbA-trnH序
列为研究对象，筛选适用于作为条形码的候选序列，
并对DNA条形码技术在荨麻科植物鉴定中的应用进
行了探索。生命条形码联盟（the Consortium for the
Barcode of Life，CBOL）建议植物的DNA条形码的候
选序列有ITS、matK、rbcL等序列（CBOL，2009），本研
究对荨麻科植物条形码序列筛选所选用的序列符合
DNA条形码联盟的要求。
ITS（Internal transcribed spaces）片段广泛分布于
可进行光合作用的真核生物（除蕨类植物外）和真菌
中，由于ITS具有序列短（600~700 bp）、两端连接高度
保守区、拷贝数多、进化速率较快等优点，适用于被子
植物科内、近缘属种间的系统学研究。本研究结果表
明，核基因ITS序列具有较好的PCR扩增效率（92.3%）
和测序成功率（100.0%），在所考察的候选序列中具有
较大的种间变异和较小的种内变异，且两者存在明显
差异（图1）。在物种鉴定的有效性方面，ITS序列构建
的系统发育树中不同物种形成单系分支的百分比最
高。对比所获得ITS序列发现，碱基变异较多，有大量
的信息位点，表明ITS序列进化速度较快，适合作为荨
麻科植物的DNA条形码。因此，推荐ITS序列为荨麻科
植物首选的DNA条形码序列。
psbA-trnH片段是叶绿体基因进化速率最快的片
段之一（ torchová and Olson，2007），引物通用性较
好，扩增成功率高，并且平均长度较短，对降解材料的
扩增效果也较好（Newmaster et al.，2008），符合条形
码的基本特征。从本研究的结果来看，psbA-trnH序列
在种间与种内的变异存在一定差异，但差异不显著，
其PCR扩增成功率为100.0%，序列有效获得率为
95.3%，均高于ITS序列，表明该序列的引物通用性非
常好，可以覆盖和分析ITS序列不能分析的物种。对获
得的序列比较分析发现，psbA-trnH序列进化速度较
快，碱基变异较多，也适合作为荨麻科植物DNA条形
码。因此，建议psbA-trnH序列作为荨麻科植物DNA条
形码的候补序列。
在GenBank中有大量的rbcL序列数据，该序列易
扩增、引物通用性较好，但是其变异主要存在于种以
上水平，物种水平上通常变异不够大；通过研究发现，
尽管rbcL不能识别全部物种，但可以区分部分同属植
物。本研究发现，rbcL序列虽然扩增效率和序列质量
较好，但序列保守，缺少足够的信息位点，在构建的系
统发育树中不同物种形成单系分支的百分值较低，表
明该序列进化速度慢，碱基变异较少，不适于单独进
行荨麻科植物种水平上的鉴别，但可尝试将该序列与
其他序列组成组合条形码用于荨麻科物种的鉴定。
matK序列是植物叶绿体基因组中进化速率较快
的一条编码序列，也是很多研究者推荐的条形码序列
之一，但该片段的引物通用性较差，鉴定不同类群时
往往需要设计不同的引物。本研究尝试用390F/1326R
引物对荨麻科植物进行扩增，但扩增成功率极低，仅
有23.1%，因此在后期未对其进行考察。
3. 2DNA条形码技术在荨麻科植物鉴定中的应用前景
目前，利用DNA条形码技术对我国荨麻科植物进
行物种鉴定和分类的报道较少。康冬丽等（2008a，
2008b）的研究结果表明，用rbcL序列对荨麻科各属间
进行系统发育关系的研究是可行的；此外，还发现运
用分子系统学的手段所得到的分类结果与传统的形
表 5 不同聚类方法荨麻科植物形成单系分支百分比
Tab.5 Urticaceae plants formed monophyletic clade percentage
by using different clustering methods
聚类方法 Clustering method ITS psbA-trnH rbcL
MP 90.91% 85.71% 77.78%
UPGMA 90.91% 71.43% 66.67%
ML 81.82% 71.43% 55.56%
NJ 63.64% 57.14% 55.56%
W+ W- 物种种间显著性检验 Significant test 结果 Result
psbA-trnH ITS W+=3.25，W-=4.00，n=6，P＞0.05 psbA-trnH =ITS
psbA-trnH rbcL W+=13.17，W-=3.32，n=8，P＜0.05 psbA-trnH ＞rbcL
ITS rbcL W+=25.68，W-=14.72，n=12，P＜0.05 ITS＞rbcL
W+ W- 物种种间显著性检验 Significant test 结果 Result
psbA-trnH ITS W+=7.36，W-=5.27，n=4，P＞0.05 psbA-trnH =ITS
psbA-trnH rbcL W+=19.39，W-=13.16，n=5，P＜0.05 psbA-trnH＞rbcL
ITS rbcL W+=21.82，W-=17.15，n=5，P＜0.05 ITS＞rbcL
侯新东等：荨麻科植物DNA条形码的筛选
表 3 两两序列种间差异的Wilcoxon检验结果
Tab.3 Wilcoxon signed rank test for interspecific variation be-
tween different sequences
表 4 两两序列种内差异的Wilcoxon检验结果
Tab.4 Wilcoxon signed rank test for intraspecific variation be-
tween different sequences
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南 方 农 业 学 报 45卷
态学分类存在一定差异，单凭某一种序列的分析结果
并不能得到正确的结论（康冬丽等，2011）。
单个DNA条形码片段所能提供的有用信息较少，
甚至有些引物本身的通用性较差。部分研究结果显
示，单独使用某一个片段对所有的植物物种进行准确
鉴定是不太可能的（Kress and Erickson，2007），因此
筛选植物条形码不能仅关注单个片段，还要考虑多序
列组合的形式，这在一定程度上可以降低种内变异带
来的影响，同时减少种内和种间变异的重叠。Kress等
（2005）提出了多序列组合观点，预测将 ITS和 ps-
bA-trnH序列组合用于被子植物种类鉴定将有广泛的
应用前景。2007年，Kress和Erickson又提出使用rb-
cL+psbA-trnH 对陆生植物进行识别和鉴定。2009年，
生命条形码联盟（CBOL）植物工作组建议将rbcL和
matK组合作为鉴别陆地植物的通用DNA条形码。在
本研究中，荨麻科植物ITS序列的种内和种间差异没
有形成明显的条形码间距，出现了一些无法鉴别的样
本。此外，psbA-trnH序列的物种鉴定成功率略低于
ITS，但其扩增和测序成功率却高于ITS，并且可以补
充ITS不能鉴定的物种。虽然rbcL片段的变异率低，但
其通用性较好。因此，开展研究时要分步进行，先用编
码基因rbcL锚定到荨麻科的属，再用变异更大的核基
因片段ITS区分到种，对于ITS无法分辨的物种最后用
间隔区psbA-trnH片段来进行鉴定，按照这个顺序进
行，可以提高荨麻科植物的正确识别率。
4 结论
本研究结果表明，荨麻科植物种间变异明显大于
种内变异，DNA条形码适用于荨麻科植物种水平上的
鉴定；3个候选序列ITS、psbA-trnH及rbcL均不能单独
鉴别所有荨麻科植物物种，可作为鉴别荨麻科植物的
DNA条形码序列组合。
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（责任编辑 韦莉萍）
侯新东等：荨麻科植物DNA条形码的筛选 183· ·