全 文 ：第 35卷 第1期 水 生 生 物 学 报 Vol. 35, No.1
2 0 1 1 年 1 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Jan. , 2 0 1 1

收稿日期: 2009-12-29; 修订日期: 2010-10-15
基金项目: 国家自然科学基金(30870221, 20877093, 50808172); 中国博士后科学基金(20080431013)资助
作者简介: 高云霓(1982—), 女, 土家族, 湖北长阳人; 博士后; 主要从事水环境化学生态学研究。E-mail: freebird23231060@163.com
通讯作者: 吴振斌, Tel: 027-68780675; E-mail: wuzb@ihb.ac.cn

DOI: 10.3724/SP.J.1035.2011.00170
三种水鳖科沉水植物释放的脂肪酸类化感物质的分离与鉴定
高云霓1 刘碧云1 葛芳杰1,2 梁 威1 徐 栋1 张丽萍1 吴振斌1
(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049)
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ALLELOPATHIC FATTY ACIDS EXUDED FROM
THREE SUBMERGED HYDROCHARITACEAE SPECIES
GAO Yun-Ni1, LIU Bi-Yun1, GE Fang-Jie1,2, LIANG Wei1, XU-Dong1, ZHANG Li-Ping1 and WU Zhen-Bin1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China;
2. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
关键词: 伊乐藻; 轮叶黑藻; 苦草; 脂肪酸; 分离
Key words: Elodea nuttallii (Planch) St. John; Hydrilla verticillata (L.f.) Royle; Vallisneria spiralis Linn; Fatty acids; Isolation
中图分类号: Q948.8 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2011)01-0170-05

沉水植物是水生态系统的重要组成部分, 在维持水
生态系统结构和功能方面具有重要作用 [1], 其中的一个
重要机制就是通过释放化感物质抑制藻类生长, 从而保
持水体的清水稳态[2]。自然水体中许多沉水植物如轮叶狐
尾藻(Myriophyllum verticillatum)、金鱼藻(Ceratophyllum
demersum)、 水 卫 士 (Stratiotes aloides)、 伊 乐 藻 (Elodea
nuttallii)和篦齿眼子菜(Potamogeton pectinatus)等均表现
出明显的化感抑藻现象[3—7]。研究沉水植物对藻类的化感
作用不仅有助于揭示水生态系统中生物间的化学生态学
关系, 而且可以为水华的控制和沉水植被的重建提供科
学指导。
化感作用发生的一个重要条件就是植物必须将其体
内产生的化感物质释放到环境中去影响目标生物的生
长[8]。水生植物化感抑藻物质也必须是由植物体释放到水
环境中并影响藻类生长的物质。目前已发现一些水生植物
可以释放酚酸和脂肪酸类化感物质影响周围藻类的生长,
如 Nakai, et al.[9,10]先后从穗花狐尾藻种植水中分离到焦
酚等酚酸和壬酸等脂肪酸类化感抑藻物质。其中, 脂肪酸
是指一端含有一个羧基的脂肪族碳氢链。按饱和度的不同
可分为饱和与不饱和脂肪酸两大类, 在不饱和脂肪酸分
子结构中含有一个或多个双键。除穗花狐尾藻以外的许
多水生植物已被报道其体内含有多种脂肪酸 [11 — 16]。同
时许多脂肪酸的抑藻活性已被证实, C2 到 C22 的饱和和
不饱和脂肪酸对多种蓝藻和绿藻有不同程度的抑制作
用[17—19]。但这些植物体内含有的脂肪酸是否能释放到水
环境中去发挥其化感抑藻作用还有待研究。
伊乐藻 (Elodea nuttallii)、轮叶黑藻 (Hydrilla ver-
ticillata)和苦草(Vallisneria spiralis)为长江中下游浅水湖
泊中常见的水鳖科沉水植物, 三种植物的浸提物和种植
水均可以显著抑制多种浮游或附着藻类的生长[20, 21]。我
们的前期研究已发现这些植物能够释放酚酸类化感抑藻
物质 [22], 但这三种沉水植物是否也释放脂肪酸类物质抑
制藻类生长还没有相关报道。
为了全面鉴定伊乐藻、轮叶黑藻和苦草三种水鳖科
沉水植物释放的主要化感抑藻物质, 本文在建立并初步
优化了水生植物分泌物分离鉴定方法的基础上检测了
三 种 植 物 释 放 到 水 环 境 中 的 脂 肪 酸 种 类 及 其 相 对 含
量, 并结合文献资料初步评估了这些脂肪酸的化感作用
潜力。
1 材料与方法
1.1 试剂和标准物质
双 (三 甲 基 硅 烷 基 )氟 乙 酰 胺 (BSTFA)购 自 Sigma-
Aldrich(美国)公司。所有的溶剂和试剂均为色谱纯。
1 期 高云霓等: 三种水鳖科沉水植物释放的脂肪酸类化感物质的分离与鉴定 171
1.2 植物采集与培养
伊乐藻、轮叶黑藻和苦草均采自武汉月湖(30°33′N,
114°15′E), 然后用采自同一样点的底泥室外水泥缸培养。
实验前一个月左右转入实验室内底泥培养, 培养条件为
3000 lx 光照强度, 12:12 光暗周期, 25℃。实验开始前 15
天, 新鲜植物用自来水反复冲洗去除植物表面的附着物,
然后在相同的培养条件下用改良的 MIII 培养液[23]适应培
养, 发现有新枝长出。培养液每 5 天换一次。为减少微生
物在共培养体系中对藻类生长的影响, 用于培养的玻璃
方缸和营养盐都经过灭菌处理。
实验开始前, 伊乐藻和轮叶黑藻挑选大小一致的新
鲜顶枝(30—50 cm), 苦草挑选新生完整植株(株长不超过
50 cm), 自来水清洗, 双蒸水润洗后, 在无菌 MIII 培养液
中培养。3 种水草培养时间均为 3d。培养条件同前。3 种
水草均设置了 10 g FW/L 的培植密度, 为了比较不同水草
密度对化感物质释放情况的影响, 伊乐藻还设置了一个
50 g FW/L 的培植密度。
1.3 植物分泌物的提取
取出植物后的培养液, Whatman GF/F 玻璃纤维滤纸
过滤, 盐酸调 pH 到 2 后, 过 Oasis HLB 固相萃取小柱(500
mg, 6cc, Waters, USA), 每根小柱使用前均用甲醇和超纯
水活化平衡。富集完后小柱真空抽干再用甲醇洗脱。根据
预实验结果 , 为减少烷烃和酞酸酯等杂质的干扰 , 合并
后的洗脱液旋蒸干 , 再用超纯水重新溶解 , 然后通过改
良的液液萃取方法 [3]进一步分离。主要步骤为 : 2mol/L
NaOH 将水相调 pH 到 12 后, 正己烷萃取 3 次, 然后将水
相用 2 mol/L HCl 调 pH 到 2, 乙酸乙酯萃取 4 次。收集乙
酸乙酯组分 , 无水硫酸钠干燥 , 旋蒸浓缩后转移到棕色
样品瓶, 硅烷化[24]后进行 GC/MS 分析。未添加植物的培
养液也同步提取作为无植物对照, 每组实验重复一次。
1.4 GC/MS分析
GC/MS 分 析 在 串 联 的 HP 6890N 色 谱 仪 和 HP
5973Inert 质 谱 仪 上 进 行 。 所 采 用 的 毛 细 管 柱 型 号 为
HP-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 µm)。定性分析采用 SCAN
模式进行。载气为氦气, 流速为 1.0 mL/min。柱升温程序
如下: 起始温度 50ºC, 保持 1min, 然后以 10℃/min 升温
到 280ºC, 最后保持 5min。进样温度和接口温度均为
280ºC。进样量为 1 µL, 以不分流模式进样。各个峰的鉴
定参照 NIST02 标准谱库, 面积归一化法计算样品中各物
质的相对含量。
2 结果与讨论
2.1 伊乐藻、轮叶黑藻和苦草种植水中脂肪酸的鉴定
将 10 g FW/L 密度种植的伊乐藻、轮叶黑藻和苦草
分 泌 到 水 中 的 物 质 固 相 萃 取 和 液 液 萃 取 , 硅 烷 化 后
GC/MS 分析得到总离子流图(图 1)。将每个峰的质谱图与
标准物质谱图比对, 如停留时间为 7.78min 的峰质谱图为
图 2(a), 乳酸的标准物质谱图为图 2(b), 两者匹配度大于
95%, 故将停留时间在 7.78min 的物质鉴定为乳酸。依次
类推, 先后从 10 g FW/L 密度种植的伊乐藻、轮叶黑藻和
苦草分泌物中鉴定出琥珀酸、己二酸、癸酸、月桂酸、酒
石酸、壬二酸、棕榈酸和硬脂酸。图 3 列出了各物质的化


图 1 三种沉水植物分泌物的乙酸乙酯组分总离子流图
Fig. 1 Total ion chromatogram of ethyl acetate fraction of enriched exudates from three submerged macrophytes
1. 乳酸; 2. 琥珀酸; 3. 己二酸; 4. 癸酸; 5. 月桂酸; 6. 酒石酸; 7. 壬二酸; 8. 棕榈酸; 9. 硬脂酸
1. lactic acid; 2. succinic acid; 3. hexanedioic acid; 4. capric acid; 5. lauric acid; 6. tartaric acid; 7. azelaic acid; 8. palmitic acid; 9. stearic acid
172 水 生 生 物 学 报 35 卷

图 2 停留时间为 7.78min 的物质的质谱图(a)与谱库中乳酸 BSTFA 衍生物的质谱图(b)比较
Fig. 2 Comparison of the GC/MS fragment pattern of the peak at 7.78min (a) with that of the BSTFA derivative of lactic acid from the NIST
mass spectral library (b)


图 3 10 g FW/L 密度种植的伊乐藻、轮叶黑藻和苦草分泌的脂肪酸物质结构
Fig. 3 Structures of fatty acids exuded from E. nuttallii, H. verticillata and V. spiralis cultured at 10 g FW/L

学结构。而在同样条件下的无植物对照中则没有检测到这
些物质, 由此可以推断, 伊乐藻、轮叶黑藻和苦草可以释
放些物质到水环境中。其中的癸酸、月桂酸、棕榈酸和硬
脂酸均具有抑藻活性 , 且随着脂肪酸碳数的递减 , 抑藻
效果递增, 活性最强的癸酸对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻
和斜生栅藻生长 5d 的半抑制率分别为 0.96、1.38 和 1.17
mg/L[19]。
根据总离子流图中各物质的峰面积得到各脂肪酸在
不同植物分泌物中的相对含量(表 1)。结果显示, 尽管三
种植物同属于水鳖科, 但不同植物释放的脂肪酸相对含
量表现出差异。就总量而言, 苦草分泌物中脂肪酸相对最
高, 占分泌物总量的 18.87%, 轮叶黑藻次之, 12.38%, 伊
乐藻最低, 5.89%。琥珀酸是苦草分泌的主要脂肪酸物质,
占到脂肪酸类物质总量的 60.15%, 其次是壬二酸, 乳酸
和癸酸也有一定的含量。轮叶黑藻分泌物中壬二酸含量最
高, 占脂肪酸总量的 34.65%, 乳酸、棕榈酸和癸酸也有一
定的含量。伊乐藻分泌的各脂肪酸含量都不高, 只有乳酸
和琥珀酸含量超过了 1%。这与 Xian, et al.[20]从苦草和轮
叶黑藻水浸提液中检测到的脂肪酸组成情况相似, 苦草
体内也含有包括乳酸、琥珀酸、月桂酸、壬二酸、棕榈酸
和硬脂酸等在内的多种脂肪酸 , 且琥珀酸含量最高 , 乳
酸和壬二酸含量也较高。琥珀酸、乳酸、壬二酸在轮叶黑
藻中均有较高的含量。
2.2 种植密度对伊乐藻脂肪酸分泌的影响
自然水体中伊乐藻的生物量可以达到 500—1693 g
DW/m2 [21], 若按 1 m 的水柱计算, 1 m3 的水域内伊乐藻的
1 期 高云霓等: 三种水鳖科沉水植物释放的脂肪酸类化感物质的分离与鉴定 173
表 1 10 g FW/L 密度种植的伊乐藻、轮叶黑藻和苦草释放的主要脂肪酸
Tab. 1 Main fatty acids exuded from E. nuttallii, H. verticillata and V. spiralis cultured at 10 g FW/L
序号
Number
停留时间
Retention time
物质名称
Compound
伊乐藻/相对含量
E. nuttallii/Content (%)
轮叶黑藻/相对含量
H. verticillata/Content (%)
苦草/相对含量
V. spiralis/Content (%)
1 7.78 乳酸 1.17 2.43 1.81
2 11.52 琥珀酸 1.49 0.94 11.35
3 14.00 己二酸 0.46 0.55 0.80
4 14.71 癸酸 0.47 1.15 1.03
5 15.67 月桂酸 0.33 0.71 0.74
6 15.76 酒石酸 0.76 0.36 —
7 17.29 壬二酸 — 4.29 3.14
8 19.71 棕榈酸 0.45 1.19 √
9 21.48 硬脂酸 0.76 0.76 √
注: —表示未检测到
Note: — indicates it has not been detected

生物量为 500—1693 g DW, 伊乐藻含水率为 94%(未发表
数据), 换算成鲜重伊乐藻的生物量为 8—28 g FW/L。本
实验选择的 10 g FW/L 的培植密度在一般水体中均可以
达到, 能较好地模拟自然情况。然而, 考虑到分离技术和
成本, 已有的一些水生植物分泌物分离实验都选择了显
著高于实际情况的种植密度, 如 Nakai, et al. [10] 在分离
穗花狐尾藻分泌的脂肪酸类抑藻物质时植物的培植密度
就达到了 100 g FW/L。本实验也采用和前面一致的提取
流程分离了 50 g FW/L 密度下种植的伊乐藻的分泌物。如
表 2 所示, 共分离出 17 种脂肪酸, 其中包括 8 种从 10 g
FW/L 伊乐藻种植水中检测到的脂肪酸。另外 9 种分别为
己酸、2-羟基乙酸、2-羟基丙烯酸、辛酸、壬酸、肉豆蔻
酸、十五酸、十七酸和花生酸。在两种种植密度下的分离
结果显著不同, 高密度的伊乐藻种植水中检测到的脂肪
酸种类明显增多, 且大部分新检出的脂肪酸如肉豆蔻酸、
十五酸和十七酸都具有较强的抑藻活性[17], 而己酸、辛酸
和壬酸活性更强, 对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和斜生栅
藻的半抑制率均低于 1 mg/L[19]。同时, 脂肪酸在种植水
中的含量也显著不同, 高密度伊乐藻种植水中检测到的
17 种脂肪酸总量占其分泌物总量的 18.18%, 其中棕榈酸
含量最高, 为 9.56%, 其次为硬脂酸, 1.5%, 乳酸和肉豆
蔻酸的含量也较高, 分别为 1.32% 和 1.12%。沉水植物的
化感抑藻作用在其受到较大的营养或光照等竞争压力的
情况下会表现得更加明显, 逆境胁迫除直接影响化感物
质的产生和分泌外, 还能使植物产生的化感物质含量发
生变化[25]。高密度种植下植物分泌物增多很可能就是植
物在空间、光照和营养等资源的获得量减少后的一种防御
行为。
3 结 论
本实验采用固相萃取、液液萃取和 GC/MS 联用技术
从 10 g FW/L 的伊乐藻、轮叶黑藻和苦草种植水中分离出
表 2 50 g FW/L 密度种植的伊乐藻释放的主要脂肪酸
Tab. 2 Fatty acids exuded from E.nuttallii cultured at 50 g FW/L
序号
Number
停留时间
Retention time
物质名称
Compound
相对含量
Content (%)
1 7.78 乳酸 1.32
2 7.91 己酸 0.23
3 8.02 2-羟基乙酸 0.22
4 10.33 2-羟基丙烯酸 0.21
5 10.77 辛酸 0.29
6 11.52 琥珀酸 0.16
7 12.10 壬酸 0.76
8 14.00 己二酸 0.22
9 14.71 癸酸 0.29
10 15.67 月桂酸 0.29
11 17.29 壬二酸 0.98
12 17.78 肉豆蔻酸 1.12
13 18.77 十五酸 0.73
14 19.71 棕榈酸 9.56
15 20.62 十七酸 0.19
16 21.48 硬脂酸 1.5
17 23.02 花生酸 0.11

9 种脂肪酸, 其中的癸酸、月桂酸、棕榈酸和硬脂酸已被
证明是对藻类具有抑制作用的化感物质。同时从 50 g
FW/L 的伊乐藻种植水中分离出 17 种脂肪酸, 除了 10 g
FW/L 的伊乐藻种植水中检测到的脂肪酸外, 还分离到具
有强抑藻活性的己酸、辛酸和壬酸等脂肪酸。种植密度的
增大导致伊乐藻分泌的脂肪酸种类和含量显著增加, 有
关脂肪酸类物质在这些水生植物化感作用中的贡献以及
环境因素对植物化感物质分泌的影响还需要进一步研究。

致谢:
174 水 生 生 物 学 报 35 卷
在实验和论文写作期间, 得到了张甬元、刘保元先
生, 成水平研究员, 贺锋、周巧红副研究员等课题组成员
的帮助, 谨致谢忱。
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