全 文 ：橱建农业大学学报 (自然科学版 )2 3( 4): 11 4一 45 1, 19 94
为 u r n ia ` o r F u i a n ^ g血 u l ut r a l u n iv e r is t y ( N a ut r a l s ic e n ce s 助 iit o n )
农杆菌介导的病毒侵染方法在禾本科
植物转化上的研究进展 ’
吴祖建 林奇英 谢联辉
(福建农业大学植物病毒研究所 ` 福州 3 5。。。 2)
摘要 综述了农杆菌介导的病毒侵染方法 (A g or in fe ict on )在禾本科植物转化研究方面的进展 . 利用农杆菌
的 iT / R i 质粒载体将病毒或类病毒的核酸导人植物细胞的方法 , 近年来在禾本科植物包括水稻、 大麦 、 小
麦和玉米等具有经济重要性的粮食作物的转化研究上取得了长足的进展 . 它具有直接 、 高效、 灵敏等特
点 , 在导人植物过程中不需制备病毒或类病毒的核酸 , 也不需通过介体昆虫的介导 . 因此 , 农杆菌介导的
病毒侵染方法是人们研究农杆菌及其禾本科寄主的相互关系 、 病毒的生物学特性 、 病毒基因功能和核酸序
列的很好的方法 .
关键词 农杆菌介导的病毒侵染方法; 禾本科植物 ; 转化
中图分类号 5 4 3 5 . 12 1 . 9
A d v s n C e S o n T r a n s fo r m a it o n o f G r a m i n a C e o u S M o n 0 C 0 st
b y A g r o i n fe e t i o n
W u Z u五a n L i n Q i y i n g X ie L i a n h u i
(P la n t V i r o lo g y I n s ti t u t e
,
F A U
,
F u z h o u 3 50 00 2)
A加 tr a e t A d v a n ce s o n t h 已 t r a n s fo r m a t io n o f g r a m in a e e o u s m o n o e o t s b y a g r o in fe 以 i o n w e er s u m m a r流 d
in t h is P a P e r
.
R e m a r k b l e P r o g er s s o n t h e t r a n s fo mr at i
o n o f g r a m in a e o u s P l a n t s
,
icn lu d i n g t h e m o st
ce o n o m ic a l y i m P o r t a n t ce er a l e r o P s (
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fu l v e e ot r T i / R i p l a s m id t o i n t r o d u e o v i r a l o r v i r o id a l g e n o m e s in t o p l a n t e e l ls
.
A g r o i n fe e t io n h a s t he a d v a -n
恤 g e o f d i r e e t n e s s , e fe e t iv e n e s s a n d se n s i t iv e n e s s
.
S u ch
a s fo r e i g n D N A w a s i n t r o d u c d t o P l a n t 食i t h o u t P r c-
P a r ign vi r a l o r v ir o id a l D N A
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t te d t o P la n t w it h o u t i n s e e t
,
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it e s ot s t du y ht
e in t e r a e t i o n be tw e e n th e b a e et ir a a n d t h e ir g r a m in a ce o u s h o s t s
,
b i o lo g ie a l ch a ar e et ir s t ic s
,
罗 n e fu cn t io n a n d n cu le o t i d e cs q u e n ce o f P la n t v iur cs 3 .
K e y w o dr s a g r o in fe e t i o n ; g r a m i n a e e o u s m o n co
o t s ; t r a n s f o rm a it o n
根癌农杆菌扭 g r o b a c t e r i u m t u m e .fo c et n s )和发根农杆菌 (A . r h iz o肛 n e s )分别带有 T i 和 R i
质粒 , 它们侵染植物的受伤部位并把带有肿瘤基因 o( cn og cn es )的 iT / iR 质粒传导人植物细
胞 , 其中的肿瘤基因整合到核 D N A 中并表达出来 , 从而引发冠瘦瘤或发根病 . 质粒中有两
个区域决定了其致病性 : T 一D N A , 它被转化并整合到转化细胞的核基因组中 , 通过控制生
长素和细胞分裂素合成而导致转化植物组织的肿瘤形成 ; 犷ir 区 , 至少包含 6 个操纵子 , 即
* 收稿 日期 : 1 9 9 4一 0 1一0 8
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 1994. 04. 007
,4 1 2
, 福 建 农 业 大 学 学 报 ( 自然科学版) 19 94 年
, ir A
、 , ir B
、 , i r e
、 , ir n
、
, ir E 和 , i r G , 它编码 T 一n N A 加工 、 转移和整合过程所需的酶 ,
但不能转化到植物细胞内 (R ia en ir ct al 19 93) . 插人 到 iT / iR 质粒 T 一 D N A 内的任何
D N A 片段可 以被 A . 扭川贬fo c et n : 和 A . kr iz 口ge en : 共同转化人植物细胞中 , 因此 , iT / iR
质粒可以作为基因工程中 , 特别是将外源基因导人双子叶植物中的一个非常有用的载体 .
一般认为 , iT / iR 质粒只可作为双子叶植物的载体 , 这是因为根据是否形成肿瘤来判
断农杆菌的寄主范围的缘故 . 农杆菌不能在单子叶植物上形成肿瘤或单子叶植物对其侵染后
不形成肿瘤的原因可能是 : ( l) 农杆菌不能附着单子叶植物的细胞壁 ; ( 2) 单子叶植物细胞内生
长素和细胞分裂素的平衡异常 , 大多不能有效地对 T 一D N A 肿瘤基因的表达产物发生反应 ;
(3 ) 单子叶植物缺乏特异的信号分子以引发根癌农杆菌感染 ; (4) 转化频率太低而不能导致冠
瘦瘤或发根的形成 ; ( 5) 单子叶植物中存在着抑制根癌农杆菌生长和 , i ; 基因活化的物质
(s h a cr r e t a l 19 5 7
,
H o o y k a
a s e t a l 1 9 54 )
. 显然 , 农杆菌这种寄主范围 的局 限性制约 了
iT / iR 质粒作为载体及其在单子叶植物包括在具有经济重要性的粮食作物的基因转化上 的
应用 .
随着对农杆菌生物学研究的深人和研究人员的不断尝试 , 人们发现这些障碍并非不可逾
越 . 近来有越来越多的证据表明 , iT / iR 质粒也可以应用于包括禾本科植物在内的单子叶植
物的基因工程研究中 . H o y k a s et al l( 98 4) 用农杆菌的 L B A 23 47 株系 (带有一个胭脂碱 iT
质粒和一个 iR 质粒 ) 感染吊兰和水仙 , 在受伤部位产生 了不明显 的肿瘤组织 , 并检测到胭
脂碱 . 这是农杆菌对单子叶植物转化的首次报道 . 人们发现 , 克服农杆菌转化单子叶植物的
困难的关键在于 vi r 基因的激活 . 许多酚类物质 (特别是复合酚类化合物 ) 、 多糖 (特别是酸性
糖 )和胭脂碱等物质都具有激活 vi ; 基因的作用 . 此外 , 感染单子叶植物的敏感部位也是转化
成功的关键 , 这些部位包括生长锥 、 叶鞘基部 、 盾片结节 、 中胚轴和分生组织等 (陈思学等
19 3
, 杨美珠等 19 93 ) . 这说明了人们只要通过选择合适的转化途径和方法是可 以实现农杆
菌对单子叶植物的转化的 . 在这些方法中特别值得一提的是近年来发展起来的以农杆菌介导
的病毒侵染方法 .
1 农杆菌介导的病毒侵染及其原理
农杆菌介导的病毒侵染扭 g r o石a c r e r i u m一 m e d i a et d v i r u s i n cr e t i o n , A g r o i n er e t i o n )方法 ,
是指农杆菌 T i / R i 质粒载体将病毒或类病毒的核酸导人植物并形成侵染丽过程 (D a sg 叩 t a 。 t
al 1 99 1
一
,
G r im s l e y e t a l 1 9 8 7 )
, 它是 由 G r im s le y e t a l。 9 5 6 )建立 的 . 其原理是农 杆菌
iT / iR 质粒上的 T 一D N A 区能将插在其中的病毒或类病毒基因组转移整合到植物细胞中并
表达出来 , 然后通过下面的两种方法之一导致转化植物的系统感染 : l( )含有一个以上完整的
病毒基因组串联插人 T一 D N A 中后 , 重复的病毒基因组发生同源重组产生环状和完整的病毒
D N A, 或通过 -T D N A 的复制产生完整的病毒粒子 , 从而在受体植株中发展成为系统侵染 ;
(2) 通过整合过程 , 即携带完整病毒基因的 T 一D N A 整合到植物细胞中 , 转化的细胞增殖并
分化形成转基因植株 , 其每个细胞核 D N A 都携带有病毒的基因 , 随着植物基因组的复制转
录 , 病毒基因脱离植物基因组而产生具有活性的病毒粒子 , 从而使植物发生系统侵染 (施骏
等 2 9 9 3 ) .
第 4期 昊祖建等 :农杆菌介导的病毒侵染方法在禾本科植物转化上的研究进展 . 1 43.
2农杆菌介导的病毒侵染方法在禾本科植物转化上的应用
G i r ms c ly t e( a l1 98 6)首先用带有玉米条纹病毒 ( M s) v的根癌农杆菌的株系转化玉米获得
成功 . 现在农杆菌介导的病毒侵染作为一个非常灵敏的方法 , 已成功地使农杆菌也同样能侵
染禾本科植物 , 包括水稻 、 玉米 、 大麦 、 小麦 、 燕麦 、 黍 、 马唐和黑麦草 , 使用的病毒包括
M SV ( R a i n e r i e t a l 1 993
,
B o 从l t o n e t a l 1 989 b , G r im s le y e t a l 1 9 8 7 ) , 小麦 矮 缩病毒
W( D V ) (W
o o l s t o n e t a l 1 9 8 8
,
H a y e s e t a l 1 9 8 8 )
, 马 唐 条 纹 病 毒 (D SV ) 旧 o n s o n e t
al 19 8 8 )
, 狄 草条纹病毒 (M ISV ) ( C h a t a n i e t a l 19 9 1 )和水稻东格鲁杆状病毒 ( R T B V )
口 as gu tP a et al 19 1) (表 1) . 这些病毒都只能靠介体昆虫传播 , 但现在它们的病毒 D N A
可通过农杆菌传播到禾本科植物中 , 并产生典型的病毒侵染症状 .
表 1 可用农杆菌介导的病毒感染方法转化的禾本科植物
病 毒
玉米条纹病毒
(M S V )
农杆菌株系 文献
狄草条纹病毒
(M IS V )
A
.
tu m e fa e址 n s
C 5 8
,
L B A 4 30 1 (P T IC 58 )
A 6
,
A 13 6 (p T IA g 6 3 )
,
A 13 6 (P T IA 6 )
,
A T I
T 37
,
p E H A 10 l g
B 0 542
A
.
kr iz 口 g en es
A 4
,
N C P P B2 62 9
,
L B A 9 40 2
,
N C P P B 8 196
R 100 0
,
I C P B T R 7
A
.
r“沉 e fa e论n s
C 58
A
.
kr iz o g en “
A 4
,
L B A 9 4 02
A
.
t u m e fa e 加月 J
P C 2 6 9 ( PT IC 58 )
C 58
A
.
ut m e fa c 趾n召
C 58
已转化的禾本科植物
玉米 eZ a m a ys
大麦 oH r de u m v o lg a r e小麦 rT i ri e u m a e s zi v u m
G ir m s le y e t a l 19 87 ;
B o ul t o n e t a l 19 8 9 a ;
R a i n e r i e t a l 19 9 3
燕麦 A ve n a , a t i v a
黍 P a n i c u m m i l勿 c e u m
马唐 D仅i ra r勿 sa , g u认 a价
黑麦草 L 口 iuI m tem u len tum
玉米 2 . m a y浮
黍 P . m i l勿 ce o m
C h a t a n i e t a l 199 1
小麦矮缩病毒
(W D V )
小麦 .T acs t i v u m H a界 5 e t a l 19 88
马唐条纹病毒
(D S V )
马唐 D . so 雌 u加 a公
玉米 .2 m a刃
燕麦 A . sa “ va
水稻 O小a sa t i v a
D O n叨 n e t al 19 88
水稻东格鲁杆状病毒 A . ut m e fo c扭。
( R T BV ) C 58
A
,
rk 松口月朋 es
A 4
,
L B A 9 40 2
W o o ls t o n e t a l 19 88
农杆菌介导的病毒侵染方法转化禾本科植物的过程和技术要点如下 : ( l) 选择合适的农杆
菌株系 : 不同的农杆菌株系具有不同的转化禾本科植物的能力 , 例如 , A . ut m 叹fo c勿n : 的胭
脂碱株系和 A . , h iz 。肛 n es 的农杆菌素与甘露糖碱两个株系都可 以高效地把 M SV D N A 转
化到玉米上 (R a i n e r i e t a l 19 9 3 , B o u l t o n e t a l 19 s g b ) . ( 2 ) 病毒 n N A 克隆 : 从病株中提取
病毒 , 抽提出病毒 D N A , 然后克隆到质粒中 . ( 3) 构建质粒 : 质粒中必须含有完整的或更长
的病毒 D N A . ( 4) 农杆菌共转化 : 用三亲株杂交法把 sE c h er ihc ia 。口 il 中的质粒共转化人农杆
.4 14
.福 建 农 业 大 学 学 报 (自然科学版 ) 194 9年
菌中 . (5)农杆菌接种 :带有 MSV一 DNA的农杆菌只有接种在植物的茎基部才能高效感
染 . ( 6)农杆菌接种的植株检测 :检测的内容包括症状 、 病毒粒体 、 病毒 DNA和外壳蛋 白
等 .
尽管目前农杆菌介导的病毒侵染方法只在玉米 、 大麦 、 小麦和水稻等禾本科植物的转化
上获得成功 , 而且其转化频率一般较低 , 但这一方法已在下列的研究中展示了光辉的前景 :
l() 为病毒传播提供新途径 , _ 由于农杆菌介导的病毒侵染方法可以不需借助介体传染或
制备病毒核酸 , 因此它为单一介体昆虫传播的那些病毒提供了另外的一条重要的传播途径 .
这一方法的介导效率很高 , 比直接用核酸感染高许多个数量级 (G ir m s lc y 。 t al 1 9 87) . 此
外 , 它也使人们大量繁殖病毒变得更容易 .
(2 )研究病毒的基因功能及其生物学特性 . 通过农杆菌介导的病毒侵染方法可以方便地
进行病毒基因的体外突变和重组 , 研究病毒的基因功能和生物学特性 . 如在 M S V 的两个正
链基因 v l 和 v Z 中进行插人和删除 , 抑制了病毒侵染症状的产生 , 表明 v l 和 v Z基因对系
统侵染是必须的 (B 。 ul ot n et al 1 9 8 9b) ;后来的研究表明 V l 和 V Z 基因产物和病毒在植物体
内的扩散有关 ( B o u lt o n e t a l 1 9 9 3 , B o u xt o n e t a l 1 99 1 ) ; 在 w n v 的反义基因 e l 和 e Z 上
的突变影响 了病毒的复制 ( s hc al k et al 19 89) . 此外在病毒基因组上的突变会影响到病毒的
生物学特性 , 包括寄主范围和症状等特性 (B 。 ul ot n 。 t al l 991 ) .
( 3) 研究病毒的核昔酸序列和基因组结构 . 农杆菌介导的病毒侵染方法已被用于 M IS v 、
w D V 和 R T B V 等病毒的核昔酸序列和基因组结构研究 ( D a sg u p t a e t a l 1 9 9 1 , C h a t a n i e t
al 199 1
,
W
o o l s t o n e t a l l 9 8 8 )
.
(4 )作为 T 一 D N A 转移的标记 . 禾本科植物经农杆菌介导的病毒感染后 , 由于病毒核酸
在寄主细胞内快速复制 , 并发生病毒的系统感染 , 形成肉眼可见的病毒感染症状 , 因此病毒
症状可 以作为 T 一 D N A 是否转移到寄主体内的灵敏标记 , 这就改变了以往的用形成肿瘤 、
冠瘦碱合成或一些特定功能的基因的表达等来作为判定 T 一 D N A 转移的方法 .
( 5) 研究农杆菌寄主范围 . 长期以来 , 人们一直认为农杆菌不能感染单子叶植物 , 农杆
菌介导的病毒感染方法使农杆菌也能侵染水稻 、 小麦等禾本科植物 , 这说明 T 一D N A 是可
以转移到禾本科植物体内 . 这就大大提高了农杆菌的应用范围 . 虽然对其机制尚不完全清
楚 , 但农杆菌介导的病毒侵染方法为研究农杆菌和禾本科植物间的关系提供了可能 .
3 展望
随着越来越多的禾本科植物被农杆菌成功地进行转化 , 人们对农杆菌介导的病毒侵染方
法在禾本科植物的遗传转化充满了信心 . 许多禾本科植物作为重要的粮食作物 , 其经济重要
性不言而喻 . 通过农杆菌来转化这些重要粮食作物 , 进行外源基因导人 , 以培育有实用价值
的抗病毒工程植物是将来的发展方向 . 同时 , 这一方法在病毒的基因功能 、 农杆菌和禾本科
植物的相互作用等基础研究上也将扮演一个重要的角色 .
第4 期 吴祖建等 : 农杆菌介导的病毒侵染方法在禾本科植物转化上的研究进展 ·4 1 5 ·
参 考 文 献
杨美珠 , 陈章良 . 199 3 . 农杆菌介导的植物基因转化 . 见 : 陈章良主编 , 植物基因工程研究 . 北京 : 北京大学出
版社 , 3 5 1一3 59
陈思学 , 李洪泉 . 19 9 3 . 农杆菌介导的单子叶植物遗传转化研究进展 . 生物技术 , 3 ( 3) : 1一 5
施骏 , 许耀 . 1 99 3 . 农杆菌介导的病毒侵染 (A g or in fe ict on ) 方法在植物和病毒分子生物学基础研究中的应用 .
细胞生物学杂志 , 15 ( 2 ) : 7 1一 75
路铁刚 , 孙敬三 . 19 90 . 根癌农杆菌转化单子叶植物研究概况 . 生物工程进展 , 10( 3) : 4一8
B o u lt o n M l
,
B u e h h o lz W G
,
M a r k s M S
, e t a l 198 9 a
.
S P e e i if e i t y o f A g r o b a e z e r加m一 m e d i a t e d d e liv e r y o f
m a iz e s t r e a k v i ur s D N A t o m e m b e r s o f t h . G r a m i n e a e
.
P la n t M o l e e u 1a r B i o 1o g y
,
12 : 3 1一4 0
B o u lt o n M l
,
S te in k e ll n e r H
,
D o n s o n J
, e t a l
.
198 9b
.
M u t a t io n a l a n a ly s i s o f t h e v ir io n 一 se n s e g e n e s o n m a i z e
s t r e a k v i r u s
.
J G e n V i r o l
,
70 : 2 309一 23 32
B o u l t o n M l
,
K i n g D l
,
M a r k h a m P G
, e t a l
.
199 1
.
H o s t r a n邵 a n d s y m P t o m s a r e d e te mr i n e d by s P e e i if e d o ·
m a in s o f m a i z e s t er a k v i ur s g e n o m e
.
V i r o l o g y
,
18 1: 3 12一 3 18
B o u lt o n M l
,
P a l la g h y C K
,
C h a t a n i M
, e t a !
.
199 3
.
R e P lie a t io n o f m a i z e s t r e a k v ir u s m u t a n t s i n m a i z e
p r o t o P la s t s : e v id e n e fo r a m o v e m e n t p r o t e in
.
V i r o lo g y
,
19 2 : 8 5一9 3
C h a t a n i M
,
M a t s u m o t o Y
,
M i z u t a H
, e t a l
.
19 9 1
.
T h e n u
e le o t id e s e q u e e e a l一d g e n o m e s t r u e t u r e o f t h e
g c m n iv ir u s m i sc a n t h u s s t r e a k v i ur s
.
J G e n V i r o l
,
7 2 : 232 5一23 3 1
D a s g u p t a l
,
I王u l l R , E a s t o P S , e t a l . 199 1 . R ie e t u n g r o b a e i1li fo r m v i r u s D N A i n d e p e n d e n t ly in fe e t s r i e e a ft e z
通g 护o b a c t e r iu m一m e d i a t e d t r a n s fe r . J G e n v i r o 一, 7 2 : 12 12一 12 2 1
D o n s o n J
,
A“ o t t o G P , B o u lt o n M l , e t a l . 198 8 . A g r o b a c ze r iu 舰一m e d ia te d in fe e t iv i t y o f e l o n e d d ig i t a r i a
s t r e a k v i r u s D N A
.
V i r o l o g y
,
16 2 : 2 48一2 50
G r im s le y N H
,
H o h n B
,
H o h n T
, e t a l
.
198 6
.
A g r in fe e t io n
, a n a l te r n a t iv e r o u te of r P l
a n t v i r u s i n fe
e t io n b y u s
-
i n g T 一 p l a sm id . P r o e N a t l A e a d S e i U S A , 83 : 3 28 2一 32 86
价im s le y N H , H o h n T , D a v i e s J W , e t a l . 19 87 . A g r o b a e z e r i u m一 m e d ia t e d d e l iv e yr o f il讨’c e t足o u s m a iez s t r e a k
v iur s i n t o m a i z e p l a n t s
.
N a t u r e
,
3 2 5 : 17 7一 17 9
H a y e s R J
,
M a
e
d o n a ld H
,
C o u t t s R H A
, e t a l
.
1 9 88
,
A g r o i n fe e t i o n o f rT i
z ic u m a e s l艺v u 胡 w i t h e l o n e d D N A o f
w h e a t d w a r f v iru s
.
J G e n V ir o l
,
6 9 : 89 1一89 6
H o o y k a a s一 V a n S lo g t e r e n G M S , H o o y k a s s , P J J , S e h il P e r o o r t R A . 19 84 . E x p r e s s io n o f T i一p l a s m id g e n e s
i n m o n o e o t y l e d o n o u s p la n t i n fe e te d w i th A g r o b a e t e r iu, n z o m e af
e ie n ,
.
N a t u r e
,
3 11 : 7 63一7 64
R a ine ir D M
,
B o u lt o n M l
,
D a v i e s J W
, e t a l
.
199 3
.
v i r A
,
t h e P l a n t一 s i g xl a l er c e P t o r , 15 er s p o n s i b le fo r t h e T i
p l a s m i d一s P e e ifl e t r a n s fe r o f D N A t o m a i ez b y A g r o b a c l e r iu m . P r o e N a t l A e a d S e i U S A , 90 : .
cS h a l k H J
,
M a tz e i t V
,
S e h i lle r B
, e t a l
.
19 89
.
W h e a t d w a r f v i r u s
, a g e m in i v i r u s o f g r a m in a e e o u s P l a n t s n e e d s
s p l iic n g fo r r e p li e a t i o n
.
E M B O J
,
8 : 3 59一3 64
hS a fe r W
,
G a r e A
,
K a h l G
.
19 87
.
T 一D N A in t e g r a t i o n a n d e x P r e s s i o n in a m o n o e o t e r o P P la n t a ft e r i n d u e
-
t io n o f A肛 o b a e re r iu m . N a t u r e , 3 27 : 529一 53 2
W
o o l s t o n C J
,
B a r k e r R
,
G u n n H
, e t a l
.
198 8
.
A g r o in fe e t io n a n d n u e le o t i d e sc q u e n e e o f e lo n e d w h e a t d w a r f
v i ur s D N A
.
P la n t M o l e e u l a r B i o l o g y
,
11: 3 5一 43