全 文 ：收稿日期:2002-07-01
基金项目:山东省自然科学基金重点项目 ,Z2001D01.
作者简介:向凤宁(1965-),女 ,副教授 ,主要从事植物生理学研究.
＊通讯作者
　文章编号:1671-9352(2003)02-0093-04
柴胡与高寒藏药一川西獐芽菜科间体细胞杂交
向凤宁　黄贤荣　王　颖　夏光敏＊　陈惠民
(山东大学 生命科学学院,山东 济南 , 250100)
摘要:川西獐芽菜原生质体用强度为 260μw/ cm2 紫外线照射 1、2 、3 min 后 , 与狭叶柴胡原生质体在 PEG 诱导下融
合.对融合再生的 46个单细胞克隆进行杂种形态学 、染色体 、同功酶分析 ,结果表明 , 它们中有 32个为体细胞杂种
细胞系.11 个克隆在 3 个月时再生出完整小植株.
关键词:川西獐芽菜;狭叶柴胡;UV照射;不对称体细胞杂交;植株再生
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A
Asymmetric Somatic Hybridization Between Bupleurum
Scorzonerifolium Willd and Swertia musstii Franch
XIANG feng-ning ,HUANG Xian-rong ,WANG Ying ,XIA Guang-min , CHEN Hui-min
(School of Life Sci., Shandong Univ., Jinan 250100 , Shandong China)
Abstract:The protoplasts of Swertia musstii irradiated by ultravioet light(UV)at an intensity of 260μw/cm2 for 1 , 2 , 3 min respec-
tively wete fused with those of Bupleurum scorzonerifolium wild by PEG method.The regenerated 46 clones , each derived from a sin-
gle fused cell , were examinde for their hybrid nature by phenotype , isozyme and chromosome analysis.The results reveal that 32
clones of them are somatic hybrids.11 hybrid cell lines derived from asymmetric fusion regenerated plants after 3 months of culture.
Keywords:Bupleurum scorzonerifolium Wild;Swertia musstii Franch;UV-irradiation;Asymmetric somatic hybridization;Hybrid pla-
nts
　　植物体细胞杂交可以克服远缘不亲和性 ,扩大
杂交双亲的亲缘距离.不同来源的原生质体融合后 ,
能够获得含不同来源的核基因和细胞质基因的体细
胞杂种.在中药材品质改良方面 ,该方法可将决定药
用植物有效成分的基因在不同科 、属 、种间相互转
移 ,再生出含有高含量药效成分的体细胞杂种 ,实现
在易于快繁的植物细胞中生产有效药用成分 ,并进
一步克隆目标性状基因的目标.
狭叶柴胡(红柴胡)属于伞形科(Umbelliferae)、
柴胡属(Bupleurum),具退热解毒 、舒肝解郁等作用 ,
是治疗感冒 、疟疾等症的常用药材.川西獐芽菜
(Swertia musstii franch)系龙胆科(Gentianaceae)、獐芽
菜属(Swertia)青藏高原特有种 ,亦称“藏茵陈” ,分布
于西藏 、青海海拔 3800 ～ 5000 m 的高寒地区 ,专治
黄疸型肝炎及病毒性肝炎 ,其主要有效成分为齐墩
果酸(01eanolic)和芒果甙(Mangiferin)[ 1] .
目前 ,本实验室己在柴胡与葡萄[ 2](科间)、柴胡
与石防风[ 3](属间)的体细胞杂交获得成功.本文报
道这两种药用植物的不对称体细胞杂交的植株再
生 ,为为数不多的科间体细胞杂交增添又一成功的
例证.
　第 38 卷　第 2期
　Vol.38　No.2 　 　 　 　 　
山　东　大　学　学　报　(理　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
　 　 　 　 　 2003年 6 月　
Jun.2003　
1　材料与方法
1.1　双亲原生质体的本源 　以狭叶柴胡(Bupleu-
rum scorzonerifolium Willd)幼茎来源的愈伤组织(长期
继代己丧失分化能力)建立悬浮细胞系.取继代 3 d
的悬浮细胞系分离制备原生质体[ 4] 作为受体.
用川西獐芽菜未成熟种子来源的愈伤组织(继
代一年半 ,分化频率较低 ,〈10%)分离原生质体作供
体 ,方法同狭叶柴胡.原生质体经纯化后用洗液(0.6
mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2)悬浮 ,取悬浮液放入
直径为 3.5 cm 培养皿成一薄层 ,经 260μW/cm2 的
紫外线照射1 min 、2min 、3 min后作融合供体.
1.2　原生质体的融合和培养
将供体与受体以 1×106/ml的密度按 1∶1比例
混匀 ,用 PEG法[ 5] 融合.融合组合:A:狭叶胡(+)川
西獐牙菜(UV1 );B.狭叶柴胡(+)川西獐牙菜
(UV2 );C.狭叶柴胡(+)川西獐牙菜(UV3 ).分别
培养双亲原生质体及混合双亲原生质体用对照.融
合与对照原生质体皆用附加 9%葡萄糖的 P5 培养
基[ 2] 浅层培养.每次实验重复 2次以上.当融合处理
及对照培养物再生的小愈伤组织长到 1.5 ～ 2.0mm
大小时 ,转至含 0.5mg/L 2 , 4-D的 MB培养基[ 5]上
增殖 ,以后转至 0.5mg/L IAA+0.5 mg/ zeatin的MB
培养基上分化.
1.3　再生愈伤组织及再生植株的鉴定
(1)形态比较　对融合再生的愈伤组织及再生
植株与双亲在外形 、颜色上进行比较.
(2)同工酶分析　分别取再生愈伤组织及叶片
作酯酶同工敏及过氧化物同工酶分析 ,方法同文献
[ 6] .
(3)染色体分析　再生愈伤组织及再生植株根
尖用压片法[ 5] 制片.
2　结果与讨论
2.1　柴胡与川西獐牙菜原生质体融合培养和植株
发育
刚游离的柴胡原生质体胞质内富含淀粉颗粒 、
不透明 ,川西獐牙菜原生质体胞质浓而透明 ,内含物
较少 ,异质融合细胞容易识别.各融合组合的融合产
物在培养 5 d时发生第一次细胞分裂 ,1个月左右出
现了大量细胞团 ,6周后共形式 46块小愈伤组织(A
再生 25块 、B再生 21块), C组融合未见细胞分裂.
这些再生的细胞系经分化培养 2个月 ,A组合有 11
个(1 ～ 11)、B 组合有 8 个(1 ～ 8)再生了体细胞胚 、
幼叶(图 1)、幼根;其中11个克隆在培养 3个月后再
生出有根的完整小植株(图 2).
图 1　杂种克隆 3 再生的幼叶
Fig.1　The regenerated leaflet of hybrid clone No.3
图 2　杂种克隆 3 再生的植株
Fig.2　The regenerated plant of hybrid clone No.3
　　作为对照培养的柴胡悬浮系原生质体分裂形成
小细胞团 ,并进一步增殖形成再生愈伤组织 ,川西獐
牙菜原生质体在本实验条件下不分裂 ,双亲原生质
体混合培养后亦形成较多细胞团 ,但均未形成愈伤
组织.
2.2　融合产物杂种性质的鉴定
2.2.1　表型比较　用于游离原生质体的愈伤组织
表型:狭叶柴胡为黄色 、粉粒状 、较松散;川西獐芽菜
为浅黄色 、颗粒状 、较致密.狭叶柴胡原生质体幼叶
为倒披针形 ,全缘[ 2] 茎圆 ,川西獐牙菜愈伤组织再生
幼叶卵状披针型 、茎四棱[ 1] .A融合组合早期先挑出
的愈伤组织表型介于双亲之间的中间型(M),为黄
色 、颗粒状 、较紧密.少数克隆表型完全不同于双亲.
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B融合组合各克隆均为中间型.早期(3 个月时)形
成的克隆再生的幼叶形态各异 ,不同于双亲.
2.2.2　同功酶鉴定　A 、B组合再生的愈伤组织及
再生植株酯酶 、过氧化物酶同功酶分析发现 ,A组合
中 ,14个细胞系的两种同工酶均具有双亲特征谱带
(图 3),其中 3个细胞系出现了新带 ,4个细胞系仅
具有过氧化物酶双亲特征谱带.B组合中 , 11个细
胞系的两种同工酶均具有双亲特征谱带(图 3),其
中2个细胞系出现了新带 , 3个细胞仅具有过氧化
物酶双亲特征谱带.A 、B组合中 ,所有再生植株的酯
酶同工酶谱带中具有双亲的特征谱带(图 4),表明
通过 UV照射供体的融合产生的杂种细胞系及再生
植株含有双亲遗传物质.
图 3　杂种愈伤组织的酯酶同功酶分析 S:川西獐芽菜 ,
B:柴胡 , 3 , 4 , 6:来自融合组合 A 的再生克隆 , 10 , 11 , 14:
来自融合 B的再生克隆 , ←:双亲特征带
Fig.3　Esterase isozyme pattern of the calli of the somatic hy-
brids , S:Swertia musstii Franch , B:Bupleurum scorzonetifolium ,
3 , 4 , 6:No.of regenerated clones regenerated from combization
A.10 , 11 , 14:No.of regenerated clones regenerated from combi-
zation B.←:the specific bands of both parents.
图4　杂种再生植株的酯酶同功酶分析 , S:川西獐芽菜
叶片 , B:柴胡叶片 , 3 , 4 , 6:杂种克隆的再生植株 , 10 , 11 ,
14:杂种克隆的再生植株 , ←:双亲特征带
Fig.4　Esterase isozyme pattern of the regenerated plants lf the
somatic hybrids.S:Swertia musstii Franch , B:Bupleurum scor-
zonerifolium , 3 , 4:No.of repenerated hybrid plant , 10 , 11 , 14:
No.of regenerated hybrid plant.←:the specific bands of both
parents.
2.2.3　细胞学鉴定　狭叶柴胡愈伤组织染色体数
目多数为 10 ～ 12(图 5),川西獐牙菜愈伤组织染色
体数目大多数为 18 ～ 22(图 6).双亲均没有见到染
色体断片.对A 、B组合部分克隆及再生植株的染色
体观察发现 ,A 、B 组合再生的克隆染色体数目无明
显差别 , 各细胞系的染色体数目范围主要为 12 ～
19 ,介于双亲和之间 ,并普遍存在 1 ～ 3个染色体断
片(图 7).再生植株的染色体数目主要为 12 ～ 15.
图 5　柴胡愈伤组织染色体 , 2n=12 , 放大倍数:800
Fig.5　Chromosome of the calli of Bupleurum scorzonerifolium ,
2n=12 , ×800
图6　川西獐芽菜愈伤组织的染色体 , 2n=20 ,放大倍数:800
Fig.6　Chromosome of the calli of Swertia musstii Franch ,
2n=20 , ×800
图 7　柴胡与川西獐芽菜再生克隆 3的染色体 , 2n=19 ,←:染色体断片 , 放大倍数:800
Fig.7　Chromosome of the calli of hybrid clone No.3 ,
2n=19 , ←:chromosome fragment , ×800
　　综合以上各种分析资料可以确证 ,柴胡与川西
獐牙菜体细胞杂交产生了科间体细胞杂种再生植
株.
目前 ,许多名贵藏药材野生资源匮乏 ,其体外培
养难以形成快速生产的细胞系 ,对其有效成分基因
的分离 、克隆也难以开展 ,利用生物的技术改良中药
材成为中药研究的一个新的生长点 ,目前体细胞杂
　第 2期 向凤宁 ,等:柴胡与高寒藏药一川西獐芽菜科间体细胞杂交 95　 　
交尚未在名贵中药材的遗传改良及有效成分基因的
分离上开展研究 ,我们在获得柴胡与石防风的体细
胞杂交初步结果[ 3] 的基础上 ,进行名贵藏药材的体
细胞杂交 ,以期实现在易于快繁的植物细胞中生产
有效药用成分 ,并进一步克隆目标性状基因的目标.
本实验中 ,选用生长速度快的柴胡细胞系为受
体 ,以生长速度较慢的川西獐芽菜为供体 ,通过体细
胞杂交 ,获得了快速生长的柴胡与川西獐芽菜的体
细胞杂种细胞系 ,为进一步的大规模发酵奠定基础.
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