全 文 ：禾本科植物原生质体分离研究进展
彭小群，唐 然，解新明
（华南农业大学农学院，广州 510642）
摘 要：利用原生质体可以方便快捷地对植物进行遗传改良和细胞生理生化特性研究。为了给禾本科
植物原生质体分离体系的建立提供理论依据，推动禾本科植物原生质体的研究应用，对制备禾本科植物
原生质体的材料选择、材料的预处理、分离方法及条件和纯化方式等方面的研究进展进行详细的阐述，
分析了影响禾本科植物原生质体分离效果的有关因素，并对禾本科植物原生质体分离所存在的问题提
出建议及对其研究应用进行展望。
关键词：禾本科植物；原生质体；分离；研究进展
中图分类号：S188 文献标志码：A 论文编号：2014-1921
Advances on the Isolation of Protoplast in Gramineous Plants
Peng Xiaoqun, Tang Ran, Xie Xinming
(College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)
Abstract: The protoplast is a convenient tool for genetic improvements and characteristic researches on cell
physiology and biochemistry in gramineous plants. In order to provide theoretical basis for establishment of
protoplast isolation in gramineous plants and promote the application, a detailed description about protoplast
isolation research progress in gramineous plants from four aspects, including materials, pretreatment, the
methods and conditions of separation as well as purification, were reviewed in the article. The relevant factors
affecting the protoplast separation were analyzed. At the same time, some suggestions about the protoplast
separation were put forward and utilization of gramineous plants was also proposed.
Key words: Gramineous plants; protoplast; separation; research advance
0 引言
禾本科植物广布世界各地，是中国被子植物的第
二大科[1]。世界上大部分牧草和粮食作物均属于禾本
科植物[1-2]。近年来，对禾本科植物的研究主要集中在
提高牧草及能源植物的品质[3-6]；培育抗寒、抗旱、抗病
或其他优良特性的经济作物等方面[7-8]。在基因工程研
究方面，建立禾本科植物再生体系困难且耗时[9-10]，限制了
利用转基因株系对植物基因进行大规模的研究。利用
植物原生质体可以快速对目的基因进行功能分析[11-13]。
因此，原生质体对禾本科植物的研究具有重要的意义。
植物原生质体是指去除细胞壁由质膜包裹着的裸
露细胞。1892年，Klercker等 [14]率先从一种藻类植物
中成功分离出原生质体。20世纪60年代初，Cocking[15]
首次用酶解法从番茄根尖分离出大量有活力的原生质
体。1971年，Nagata[16]通过培养烟草叶肉原生质体首
次获得再生植株。自此，植物原生质体的研究和应用
迅速发展。目前，植物原生质体被广泛应用于研究瞬
时表达、启动子分析、种质资源改良等领域[17-20]。
迄今为止已在玉米 [21]、水稻 [22]、小麦 [23]、高羊茅
(Festuca arundinacea) [24]、多 年 生 黑 麦 草 (Lolium
基金项目：国家自然科学基金“象草木质素合成关键酶基因CAD的功能鉴定和表达特性研究”(31272491)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金
“RNA干扰沉默CAD基因对象草木质素合成的影响”(20124404110011)。
第一作者简介：彭小群，女，1990年出生，广东化州人，硕士研究生，主要从事草业生物技术与育种研究。通信地址：510642广东省广州市天河区五山
路483号华南农业大学农学院，E-mail：Q80266813@163.com。
通讯作者：解新明，男，1963年出生，内蒙古包头人，教授，博士生导师,博士，主要从事牧草资源及其生物技术研究。通信地址：510642广东省广州市
天河区五山路483号华南农业大学农学院，Tel：020-38604789，E-mail：xiexmbs@scau.edu.cn。
收稿日期：2014-07-11，修回日期：2014-09-12。
中国农学通报 2015,31(1):252-257
Chinese Agricultural Science Bulletin
perenne) [24]、草甸羊茅 (Festuca pratensis) [25]、结缕草
(Zoysia japonica)[26]、草地早熟禾(Poa pratensis)[27]、甘蔗[28]、
象草(Pennisetum purpureum)[29]、高粱 [30]等多种禾本科
植物中获得原生质体再生植株，并获得了普通小麦与
无芒雀麦(Bromus inermis)[31]、小麦与谷子[32]、小麦与玉
米[33]、水稻与非洲狼尾草(Pennisetum squamulatum)[34]、
小麦与拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides)[35]、匍匐
剪 股 颖 (Agrostis stolonifera) 与 狗 牙 根 (Cynodon
dactylon)[36]、草地早熟‘禾午夜2号’和‘新格莱’[27]等多
种禾本科植物的体细胞杂种。另外，近年来利用原生
质体进行亚细胞定位、蛋白互作以及基因沉默与表达
等研究在水稻和玉米中常有报道[37-39]。
然而，相对其他植物，如双子叶模式植物拟南芥，
禾本科植物原生质体的研究应用相对滞后，这是因为
禾本科植物组织结构比较特殊，建立原生质体系统困
难[27]。大量有活力的原生质体是开展植物原生质体研
究的重要保障[40-41]，笔者在前人研究的基础上，对影响
原生质体分离的因素进行综述，以期为分离高产量、高
活性的禾本科植物原生质体提供理论依据，为禾本科
植物原生质体的研究应用提供帮助。
1 原生质体的分离
1.1 分离组织与器官的选择
原生质体可以从植物叶片、叶鞘、叶柄、芽尖、根、
果实、胚芽鞘、胚轴、茎、胚芽、花粉粒、细胞悬浮培养液
等组织或器官分离出来[42]。早期禾本科植物原生质体
主要是通过愈伤组织悬浮细胞培养液制备[21,43-45]，但是
悬浮细胞来源的原生质体为透明状，在分离和纯化过
程中不易操作[46]，且悬浮细胞处于未分化的阶段，以此为
材料分离的原生质体不适合研究细胞生物学问题[47]。
随着研究的开展，越来越多的科研工作者通过分离小
麦[48]、玉米[49]、水稻[50]等禾本科植物黄化苗叶片获得了
原生质体。但以黄化苗分离的原生质体不能对与光或
叶绿体有关的基因进行功能研究。为了弥补这一缺
点，Zhang等[39]通过优化酶解条件，从水稻绿色幼茎和
叶鞘中分离出大量有活力的原生质体，并成功对与光
或叶绿体有关的基因进行研究。目前，叶片是植物原
生质体分离常用的材料。这是由于叶片来源广泛，而
且叶肉细胞排列松散使得酶液容易到达细胞壁[51]。然
而，近年来研究发现，在相同的酶解条件下分离水稻幼
叶和幼茎原生质体，幼茎酶解效果显著高于幼叶[47,52]。
这可能是因为幼叶主要是由硅质细胞组成而幼茎富含
薄壁细胞，导致了两者的酶解效果不同[52]。另外，通过
对比发现，幼茎分离的原生质体细胞比较大，中央液泡
明显；幼叶分离的原生质体细胞较小，叶绿体几乎充满
整个细胞[47]。有研究称高含量的叶绿体和叶绿素可能
会妨碍原生质体瞬时表达[53]。因此，分离植物原生质
体所选的材料除了要考虑材料的生理状态之外，后续
的实验目的也应该作为材料选择的一个考虑因素。
1.2 材料的预处理
在原生质体游离前，对材料进行预处理可以改变
细胞核、细胞壁的生理状态，增强细胞膜的强度，提高
酶解效率的同时又能减少原生质体的损伤[54]。禾本科
植物组织结构比较特殊，如水稻叶片表面覆盖一层蜡
质层，硅含量高达10%[55-56]。这些特殊的叶片结构对酶
液酶解材料有阻碍作用，在酶解前加入高渗透压溶液
（如甘露醇）对材料进行质壁分离，可以促进酶解时细
胞壁在小面积破损条件下释放原生质体，从而提高产
量[57]。Yang等[58]在酶解前加入0.6 mol/L甘露醇，在室
温中黑暗处理 30 min，获得的原生质体产量是前人研
究的 5~10倍。水稻、玉米等植物的叶片较轻，可以通
过真空渗透预处理增加酶液与材料的接触面积，提高
分离效率[37-38]。另外，也有研究通过去除叶片下表皮，
降低细胞的破损率来提高原生质体的产量[59]。同时，
采用低温和黑暗预处理等措施也可以提高植物原生质
体分离效率[60]。
1.3 原生质体分离方法
植物原生质体可以通过机械分离法或酶解分离法
分离出来。机械分离主要是将细胞放在高渗糖溶液中
使材料质壁分离，之后通过磨碎植物组织从伤口释放
出完整的原生质体。该方法操作困难、适用范围小、所
得到的原生质体活性低[61]，因此，利用此方法分离原生
质体并不常见。
1960年，Cocking[15]利用纤维素酶粗制剂从番茄根
尖分离出大量的原生质体，从此为植物原生质体分离
展开了新局面。酶解法是目前原生质体分离的主要方
法。酶解原生质体分为振荡酶解和静置酶解两种方
式。静置酶解是在合适的温度下，将酶液处于静止状
态对细胞进行酶解；振荡酶解是将材料放在振荡器或
者摇床酶解。一般认为，振荡酶解有利于原生质体的
分离，且产量随着时间的延长而增加[62]。但是随着摇
床转速和酶解时间的增加，原生质体容易破碎[63-64]。禾
本科植物原生质体分离常用摇床振荡酶解的方式，摇
床转速大小一般在40~80 r/min[37,58,65-66]之间。低速振荡
不仅可以增加酶液与材料的接触，而且增加了氧气的
供应，有利于提高原生质体的产量[67]。
分离植物原生质体的酶主要有纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、离析酶和崩溃酶。酶解材料时，酶液组
成、浓度、酶解时间等因素对原生质体的产量和活力有
彭小群等：禾本科植物原生质体分离研究进展 ·· 253
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重要的影响。若酶液浓度过高会使材料褐化[68]甚至导
致原生质体破碎，酶液浓度过低则酶解效果差。目前，
常用纤维素酶和离析酶分离禾本科植物叶片原生质
体，且纤维素酶的浓度一般在 1%~2%(w/v)之间；离析
酶浓度则在0.2%~1%(w/v)之间[38-39,58]。当然，根据不同
的植物还会增用或者选用其他酶，比如半纤维素酶[69]
和崩溃酶[70]。若分离禾本科植物愈伤组织原生质体，
常 用 CPW(27.2 mg/L KH2PO4；101.0 mg/L KNO3；
1480.0 mg/L CaCl2 · 2H2O；246.0 mg/L MgSO4 · 7H2O；
0.16 mg/L KI；0.025 mg/L CuSO4 · 5H2O；1066 mg/L
MES)溶液作为酶溶剂，添加纤维素酶、半纤维素酶、果
胶酶、离析酶和崩溃酶对愈伤组织进行酶解[62-63]。从材
料和酶液用量来看，每1.0 g组织用10 mL酶溶液酶解
所得的效果最佳，酶解时间随着材料及酶液成分的不
同而有所差异，但是一般不超过24 h[27]。另外，植物不
同品种所需的酶液浓度和酶解时间差异较大，如水稻
‘日本晴’幼叶分离的最佳条件为：2%纤维素酶，0.7%
离析酶，酶解7 h[61]；而水稻‘中花 11’幼叶则在1.5%纤
维素酶，0.75%离析酶，酶解 5 h的条件下获得最佳分
离效果 [58]。同样的现象在狼尾草属的象草和御谷
(Pennisetum glaucum)中也有报道[70]。
由于没有细胞壁的保护，原生质体极容易受渗透
压的影响，因此常在酶混合液中加入一定浓度的质膜
稳定剂和渗透压稳定剂[46]。常用的渗透稳定剂主要分
为盐溶液（如KCl、KH2PO4）和糖溶液（如甘露醇、山梨
醇、蔗糖、葡萄糖）[65]。其中，甘露醇及山梨醇均具有代
谢惰性，不被植物细胞吸收利用[71]。甘露醇是最常用的
渗透压调节剂，当酶液中含有0.29~0.9 mol/L甘露醇有
利于原生质体存活，大多数原生质体在0.55~0.6 mol/L
甘露醇中能保持较高的活性[60]。玉米和小麦原生质体
分离过程中，常在酶解液中添加 0.4~0.6 mol/L甘露醇
维持细胞渗透压[63,67]；对于水稻原生质体分离，甘露醇
的浓度一般在0.5~0.6 mol/L之间[39,58,72]。段炼等[52]利用
0.3 mol/L山梨醇和 50 mmol/L CaCl2对水稻材料暗处
理30 min后，在含有1 mol/L蔗糖酶解液中酶解 4 h也
能达到很好的效果。
合适的质膜稳定剂可以提高原生质体的产量及活
力。禾本科植物原生质分离过程中，常在酶解液中添
加 10 mmol/LCaCl2作为质膜的稳定剂[39,67,72]。另外，在
酶解液中加入2-(N-吗啡琳)-乙基磺酸(MES)和牛血清
蛋白(BSA)也有助于增强原生质体膜的稳定性[42,47]。
酶解液的 pH对维持质膜的稳定性及酶的活性发
挥重要的作用。pH过高或者过低都会使质膜氧化水
平发生改变导致细胞结构发生改变，从而破坏原生质
体的形态[73]。禾本科植物原生质体酶解液的 pH一般
保持在5.7左右[58,67,74]。温度对原生质体分离具有双重
的影响，随着温度升高，酶解反应速度加快，但是温度
过高会使酶失活。一般情况下，禾本科植物原生质体
酶解温度在25~28℃之间[38,50,63,66]。另外，禾本科植物原
生质体酶解物一般在黑暗或弱光条件下进行，因为光
照可能引起细胞质膜损伤，导致原生质体活力下降[46]。
1.4 原生质体的纯化
材料经酶解后，原生质体混合液中有较多的未酶
解完全的细胞团和损伤的组织碎片，这些物质与酶液
的存在均不利于开展后续实验。因此，对酶解后的原
生质体进行纯化非常重要。禾本科植物原生质体分离
过程中，常用 100~400目无菌尼龙网筛将大的细胞团
过滤去除，然后将原生质体与酶液混合物通过低速
(100~300×g)离心3~10 min，去除上清后再将原生质体
重悬于 W5(154 mmol/L NaCl；125 mmol/L CaCl2；
5 mmol/L KCl；2 mmol/L MES；pH 5.7)溶液或者CPW
溶液，反复离心 2~3次[52,66,75]。由愈伤组织分离获得的
原生质体，通常用20%~25%蔗糖进行密度梯度离心分
离纯化[27,62]。郭艳萍等[65]在玉米胚乳细胞原生质体分
离过程中，采用 Ficoll漂浮法和流式细胞仪纯化法进
行纯化也获得很好的结果。经纯化的原生质体可以调
整到相应的浓度进行相关的研究。
总结了近年来常见的几种禾本科植物原生质体制
备的条件及效果，为禾本科其他植物原生质体的分离
提供参考，详见表1。
2 总结与展望
大量有活力的原生质体是禾本科植物研究应用的
2000
2006
2006
水稻‘岗优19号’
10 d幼苗叶鞘
水稻‘TaiPei309号’2周黄
化苗、绿苗幼茎、幼叶
水稻‘日本晴’2~3周愈伤
组织
2%纤维素、1%离析酶、0.5%果胶酶、27℃ 80 r/min酶解6 h
1.5%纤维素酶、0.75%离析酶、0.6 mol/L甘露醇、
10 mmol/L MES、1 mmol/LCaCl2、0.1% BSA、40 r/min酶解4 h
4%纤维素酶、1%离析酶、0.4 mol/L甘露醇、
0.1% MES、0.1% CaCl2· 2H2O酶解4 h
产量：1.21×106个/(g· FW)，
活性：大于93%
产量：1×106~5×106个/(g·FW)，
活性：几乎100%
产量：1×107个/g，
活性：未提及
[69]
[47]
[74]
年份 材料 酶解条件 产量及活力 文献
表1 常见的几种禾本科植物原生质体分离条件与效果
·· 254
基础。由于禾本科植物原生质体分离难，科研工作者
通过筛选最佳外植体、改变材料的生理状态、探索不同
的酶液组合以及酶解条件等方面研究并在少数植物中
取得可喜的成就。近年来，也有报道在酶解液中加入低
浓度抗生素（如羧苄青霉素）除菌以提高分离效率[75]。
然而抗生素的浓度大小会不会对原生质体产生副作
用以及抗生素是不是适合所有的禾本科植物原生质体
分离等均需要进一步的探讨。
禾本科植物原生质体在细胞工程学、育种学、生物
工程学等研究领域都得到了应用，但是应用范围较小
且只有少数植物被报道。近年来，以植物原生质体为
基础利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体外界胁
迫作用后的调节机制已成为研究热点[17]，同时，利用原
生质体超低温保存种质资源[76]也是原生质体研究的一
个新方向，而这些研究在禾本科植物原生质体中报道
甚少。因此，如何在更多的禾本科植物中分离原生质
体并扩大禾本科植物原生质体的研究应用还需广大科
研工作者不断努力。
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注：BSA：牛血清蛋白；FW：鲜重；MES：2-(N-吗啡琳)-乙基磺酸；CPW：原生质体细胞洗涤液，成分见上文。
2010
2010
2011
2013
2013
2013
2014
2014
草地早熟禾‘橄榄球2号’
愈伤组织
小麦‘小偃22号’胚性愈
伤组织
水稻‘日本晴’7~10 d绿苗
幼茎、叶鞘
水稻‘日本晴’10 d幼叶
玉米‘综3’10 d幼叶
小麦‘中国春’10 d幼叶
水稻‘中花11号’7~10 d
绿幼苗叶鞘
玉米‘农大108’幼叶
CPW为酶溶剂，1%纤维素酶、1%离析酶、0.3%崩溃酶、
0.5%果胶酶、13%甘露醇、26℃静置30 min，50 r/min酶解16 h
CPW为酶溶剂，2%纤维素酶、0.5%果胶酶、
0.6 mol/L甘露醇26℃黑暗酶解4~6 h
0.6 mol/L甘露醇暗处理10 min、1.5%纤维素、0.75%离析酶、
0.6 mol/L甘露醇、10 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、
0.1% BSA、60~80 r/min酶解4~5 h
真空渗透5 min、2%纤维素酶、0.7%离析酶、0.4 mol/L甘露醇、
20 mmol/L KCl、20 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、
0.1% BSA、5 mmol/L β-巯基乙醇、50 r/min 28℃酶解7 h
1.5%纤维素酶、0.5%离析酶、0.4 mol/L甘露醇、20 mmol/L KCl、
20 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、0.1% BSA、
5 mmol/L β-巯基乙醇、50 r/min 28℃酶解7 h
1.5%纤维素酶、0.5%离析酶、0.4 mol/L甘露醇、20 mmol/L KCl、
20 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、0.1%BSA、5 mmol/L β-巯基乙醇、
50 r/min 28℃酶解5 h
0.6 mol/L甘露醇30 min、1.5%纤维素酶、0.75%离析酶、
0.5 mol/L甘露醇、10 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、
0.1% BSA、40~50 r/min 28℃酶解4 h
真空处理1 h，0.1%纤维素酶、0.01%离析酶、0.6 mol/L甘露醇、
10 mmol/L MES、1 mmol/L CaCl2、0.1% BSA、5 mmol/L
β-巯基乙醇40 r/min 25℃酶解2 h再60 r/min酶解10 min
产量：3.23×106个/g，
活性：79.3%
产量：6.38×106个/g，
活性：78.33%
产量：1×107个/(g· FW)，
活性：大于95%
产量：6×106个/(g· FW)，
活性：81.17%
产量：7×106个/(g· FW)，
活性：76.86 %
产量：6×106个/(g· FW)，
活性：55.79%
产量：5×107个/(g· FW)，
活力：大于90%
产量：1×106~5×106个/(g·FW)，
活性：大于95%
[66]
[63]
[39]
[67]
[67]
[67]
[58]
[38]
年份 材料 酶解条件 产量及活力 文献
续表1
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