全 文 ：旋花科植物 ITS序列分析
*
刘 峥，张汉尧
(西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南 昆明 650224)
摘要:通过提取白色圆叶牵牛基因组的 DNA及紫色重瓣圆叶牵牛的 DNA，对其内转录间隔区 (ITS)序列进行
PCR扩增和序列测定。采用 BLAST方法，将测序结果在 GenBank中进行同源搜索，采用邻接距离矩阵法构建了
与其亲缘关系接近的旋花科 14 个种基于 ITS序列的系统发育树，并分析了它们的亲缘关系。结果表明，原牵牛
属和番薯属的亲缘关系较近，打碗花属、旋花属与番薯属为旋花科两大亲缘关系较远的类群;疑似新种的紫色
重瓣圆叶牵牛并非一个新种，而是属于圆叶牵牛种下分类水平的变种或变型。
关键词:旋花科;圆叶牵牛;ITS序列;系统发育树
中图分类号:Q 949. 777. 1 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2012)04 － 0070 － 05
ITS Sequence Analysis of Convolvulaceae Plants
LIU Zheng，ZHANG Han-yao
(Key Laboratory of Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，
Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. R. China)
Abstract:Genomic DNA of white normal Ipomoea purpurea and of purple suspected new species or variant were
extracted，and their internal transcribed spacer region (ITS)sequences were amplified by PCR，and sequenced．
Using the ITS sequences gained in this study，and sequences got from BLAST in GenBank，adopting the neighbor
joining method，the evolutionary phylogenetic tree of species of Convolvulaceae was built，and the genetic relation-
ships among those species were discussed． Our study results indicated that the suspected new species or variant
should not be inferred as a new species and should be described as a variant or biovar． The relation between Phar-
bitis and Ipomoea was close，whereas the relation between Calystegia，Convolvulus and Ipomoea was distant．
Key words:Convolvulaceae;Ipomoea purpurea;ITS sequences;phylogenetic tree
旋花科 (Convolvulaceae)是双子叶植物纲茄
目的一个科，有 56 属 1 800 种以上，广泛分布于
全球，美洲、亚洲的热带和亚热带地区为主要分布
区。我国有 22 属 125 种，南北均有，大部分属种
分布于西南和华南。云南有 19 属 74 种，多数分部
在南部［1 ～ 2］。旋花科植物大多数为草本或亚灌木，
生于阳光充足的地方，常见于灌丛和林缘。花色多
样，通常显著鲜艳，虫媒，具分泌蜜汁的花盘。其
在城市园林景观中占有极其重要的地位，采用不同
的种植方式和不同的应用形式，可使其在园林绿化
景观设计中达到丰富的效果。如旋花科的园叶牵牛
(Ipomoea purpurea)具有红色、紫色、粉色和白色
等类型，可应用的形式有片植、带植、丛植、散
植。在较大的空间上，如广场、公园、绿化小区可
设置片状、块状分布的色块或色带，也可设置花
坛，在花坛边缘可设置线状分布的花境或低矮的绿
第 41 卷 第 4 期
2012 年 08 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 41 No. 4
Aug. 2012
* 收稿日期:2012 － 03 － 27
基金项目:西南林业大学校基金项目 (111148)、国家林业局 948项目 (2012 －4 －62)和云南省重点学科 (西南林业大学森林培育)
资助。
第一作者简介:刘 峥 (1989 －) ，男，湖北黄石人，硕士研究生，主要从事植物生物技术研究。
通讯作者简介:张汉尧 (1975 －) ，男，福建永定人，教授，归国博士后，主要从事植物、微生物分子遗传研究。
DOI:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2012.04.010
篱。
目前对旋花科植物的研究主要采用经典分类方
法，以形态特征和生态分布为依据，与系统演化的
联系颇少，难以反映分类群之间的系统发育和亲缘
关系。因此，开展旋花科植物系统发育和分子进化
研究有着重要意义。
内转录间隔区 (internal transcribed spacer，
ITS)位于 18S 和 26S rRNA 基因之间，被 5. 8S
rRNA基因分为 2 段 (ITS1 和 ITS2)。ITS在核基因
组中是高度重复，而且通过不等交换和基因转换，
这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进
化，即不同的 ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一
致。ITS区进化速率较快，可以提供较丰富的变异
位点和信息位点，已证实它是研究许多被子植物类
群系统与进化的重要分子标记，近年来由于其能较
好地反映科内、属间及种间的亲缘关系，而被广泛
应用于植物的系统演化及亲缘关系的研究［3 ～ 8］。
本项研究采用 ITS序列产物直接测序方法及利
用 MEGA4. 1 软件构建系统发育树，对旋花科植物
进行分析，从 DNA 分子水平上探讨旋花科部分属
间及种间亲缘关系，以期为该科植物的系统演化途
径的研究、种质资源的分子评价、鉴定及分类提供
依据，为种质资源的合理利用和遗传改良提供理论
基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
实验材料为白色圆叶牵牛和紫色重瓣圆叶牵
牛，采集于西南林业大学附近。
1. 2 总 DNA提取
将采集的白色圆叶牵牛和紫色重瓣圆叶牵牛新
鲜幼嫩的叶片放入液氮中，研磨成粉末，用
BioTeKe 新型快速植物基因组 DNA 提取试剂盒提
取高质量的样品总 DNA。
1. 3 ITS序列的扩增及测序
通过参考相关文献［9］，设计出扩增 ITS 序列通
用引物。上游引物 ITS2:5’ － AGA AGT CGT
AAC AAG GTT TCC GTA GG － 3’;下游引物 ITS4:
5’ － TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC － 3’，以及
2 × power Taq PCR MasterMix 都由北京百泰克生物
技术有限公司合成。PCR反应体系为 25 μL，内含
双链总 DNA模板 1. 0 μL;2 × power Taq PCR Mas-
terMix 12. 5 μL;上下游引物各 1. 0 μL;用双蒸水
补足至 25 μL。PCR反应程序:94℃预变性 6 min;
94℃变性 30 s，50. 8℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，
共 40 个循环;最后 72℃终延伸 8 min，产物于 4℃
保存。PCR产物检测:PCR产物 5 μL用 EB 染色，
经浓度为 0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成
像仪照相。
PCR产物测序:将剩余的 PCR 产物委托中美
泰和生物技术 (北京)有限公司测序。
1. 4 ITS序列分析
在构建系统树时，实验材料测定的 ITS 序列结
果与 GenBank上公布的旋花科植物 ITS序列一起利
用 ClustalX2. 0 完成 DNA 序列的完全对比，保存
aln格式，后运用系统发育软件 MEGA4. 1 软件转
换成 meg 格式，系统树采用邻接距离矩阵法
(Neighbor － joining)构建，应用自展法 (Bootstrap，
1000 replicates)进行可信度检测，重复 1 000 次，
进化距离使用 Kimura 2 － parameter模型进行计算。
2 结果与分析
2. 1 旋花科植物的 GenBank序列登记号、ITS序
列长度和 G + C含量
采集白色圆叶牵牛和紫色重瓣圆叶牵牛样本，
提取基因组 DNA，以 ITS2 和 ITS4 为引物 PCR 扩
增后获得了单一的目的条带，获得样本的 ITS 区域
的 ITS1、5. 8 s、ITS2 片段和小部分的 18S和 26S片
段，总片段长度为 660bp左右。在 GenBank中利用
BLAST根据样本 ITS序列对比寻找旋花科其他同源
种的 ITS序列共 14 个，分别属于打碗花属 (Calys-
tegia)、旋花属 (Convolvulus)、番薯属 (Ipomoe-
a) ，其对应的 GenBank序列登记号、长度和 G + C
含量见表 1。
每一个物种的 DNA 中 G + C 含量的数值是恒
定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变
化，而且在同一个属不同种之间，DNA中 G + C含
量的数值差异不会太大。从表 1 可以看出，属于打
碗花属的藤长苗 (Calystegia pellita)、旋花 (Calys-
tegia sepium)、肾叶打碗花 (Calystegia soldanella)
和属于旋花属的线叶旋花 (Convolvulus lineatus)、
田旋花 (Convolvulus arvensis) ，这 5 个种的 G + C
含量为 54. 77 % ～ 58. 20 %，平均 G + C 含量为
56. 86 %。
番薯属中的番薯 (Ipomoea batatas)、毛果薯
(Ipomoea eriocarpa)、海南薯 (Ipomoea staphylina)、
17第 4 期 刘 峥等:旋花科植物 ITS序列分析
小心叶薯 (Ipomoea obscura)、五爪金龙 (Ipomoea
cairica)和蕹菜 (Ipomoea aquatica)的 G + C含量为
60. 21 % ～ 62. 88 %，平均 G + C 含量为 61. 24 %。
番薯属中的原牵牛属 (Pharbitis)牵牛 (Ipomoea
nil)、变色牵牛 (Ipomoea indica)、圆叶牵牛 (Ipo-
moea purpurea)以及紫色重瓣圆叶牵牛和白色圆叶
牵牛的 G + C 含量为 59. 79 % ～ 64. 12 %，平均 G
+ C含量为 61. 79 %。
表 1 旋花科植物的 GenBank序列登记号、ITS序列长度和 G + C含量
Tab. 1 GenBank accession number，ITS sequence length and G + C content of Convolvulaceae plants
编号 种名 GenBank序列登记号
ITS序列全长
长度 /bp G + C /%
1 藤长苗(Calystegia pellita) GQ119509. 1 398 54. 77
2 田旋花(Convolvulus arvensis) AY560274. 1 745 55. 57
3 旋花(Calystegia sepium) EU812829. 1 756 57. 82
4 线叶旋花(Convolvulus lineatus) AH013871. 1 742 57. 95
5 肾叶打碗花(Calystegia soldanella) EU812832. 1 756 58. 20
6 紫色重瓣圆叶牵牛 － 674 59. 79
7 番薯(Ipomoea batatas) GQ249409. 1 681 60. 21
8 白色圆叶牵牛 － 659 60. 24
9 毛果薯(Ipomoea eriocarpa) AF309154. 1 582 60. 48
10 海南薯(Ipomoea staphylina) AF309170. 1 596 60. 57
11 小心叶薯(Ipomoea obscura) GQ478092. 1 598 61. 04
12 圆叶牵牛(Ipomoea purpurea) EU330324. 1 598 61. 37
13 五爪金龙(Ipomoea cairica) AF309169. 1 593 62. 23
14 蕹菜(Ipomoea aquatica) AF110919. 1 598 62. 88
15 牵牛(Ipomoea nil) AY538306. 1 577 63. 43
16 变色牵牛(Ipomoea indica) AY538295. 1 577 64. 12
2. 2 旋花科植物的 ITS聚类分析
根据实验中的 2个分析样品与 GenBank中同源搜
索的 14 个近缘种的 ITS 序列，先用 clustalX2. 0 软件
对序列进行完全的比对，再用 MEGA4. 1 软件，采用
邻接距离矩阵法 (Neighbor － joining)构建系统发育
进化树 (见图1)，完全删除序列的 Gaps /Missing Da-
ta，采用 Pairwise distance calculation法，选用 Kimu-
ra 2 － parameter参数模型，所得的遗传距离见表 2。
图 1 邻接距离矩阵法构建的旋花科植物 ITS序列系统发育树
Fig. 1 A phylogenetic tree of Convolvulaceae plants constructed by neighbor － joining method
27 西 部 林 业 科 学 2012 年
番薯属中的 6 个种以 98 %的支持率被分为两
支。其中小心叶薯和毛果薯以 63 %的支持率聚类
为一支;而在另一分支上又以 65 %的支持率分为
两小支，番薯属的蕹菜、五爪金龙、番薯和海南薯
聚类为一小分支，番薯属中原牵牛属的 3 个种和 2
个样本聚类为另一小分支。并且，原牵牛属 3 个种
和 2 个样本的 ITS序列平均 G + C含量 (61. 79 %)
与番薯属 6 种植物的 ITS 序列平均 G + C 含量
(61. 24 %)相近，它们之间的平均 Kimura 2 － pa-
rameter距离约为 0. 093。由此可见，番薯属植物与
原牵牛属植物亲缘关系非常相近，也支持被子植物
APGⅢ分类法［10 ～ 14］将牵牛属并入番薯属。
打碗花属的 3 个种，肾叶打碗花、旋花和藤长
苗与旋花属的 2 个种，线叶旋花、田旋花聚类为一
大分支，与原牵牛属和番薯属植物聚类的一大分支
并列。由此可知，它们属于两个不同的类群，亲缘
关系较远。
表 2 旋花科植物 ITS序列间的遗传距离
Tab. 2 Genetic distances between ITS sequences of different Convolvulaceae plants
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 0. 00
2 0. 00 0. 00
3 0. 00 0. 00 0. 00
4 0. 02 0. 02 0. 02 0. 00
5 0. 02 0. 02 0. 02 0. 01 0. 00
6 0. 08 0. 08 0. 08 0. 07 0. 06 0. 00
7 0. 09 0. 09 0. 09 0. 07 0. 06 0. 06 0. 00
8 0. 10 0. 10 0. 10 0. 09 0. 08 0. 07 0. 08 0. 00
9 0. 09 0. 09 0. 09 0. 08 0. 07 0. 04 0. 06 0. 09 0. 00
10 0. 13 0. 13 0. 13 0. 12 0. 11 0. 08 0. 10 0. 10 0. 09 0. 00
11 0. 11 0. 11 0. 11 0. 10 0. 09 0. 08 0. 11 0. 12 0. 08 0. 07 0. 00
12 0. 14 0. 14 0. 14 0. 14 0. 15 0. 16 0. 17 0. 15 0. 18 0. 13 0. 13 0. 00
13 0. 16 0. 16 0. 16 0. 17 0. 16 0. 17 0. 18 0. 19 0. 16 0. 17 0. 13 0. 11 0. 00
14 0. 16 0. 16 0. 16 0. 16 0. 16 0. 17 0. 16 0. 19 0. 16 0. 18 0. 14 0. 11 0. 08 0. 00
15 0. 13 0. 13 0. 13 0. 13 0. 14 0. 17 0. 16 0. 18 0. 17 0. 17 0. 15 0. 09 0. 09 0. 04 0. 00
16 0. 16 0. 16 0. 16 0. 16 0. 17 0. 17 0. 18 0. 21 0. 17 0. 20 0. 16 0. 14 0. 10 0. 04 0. 05 0. 00
注:表中编号代表的物种，1 为圆叶牵牛 (Ipomoea purpurea) ，2 为紫色重瓣圆叶牵牛，3 为白色圆叶牵牛，4 为变色牵牛 (Ipomoea indica) ，
5 为牵牛 (Ipomoea nil) ，6 为番薯 (Ipomoea batatas) ，7 为五爪金龙 (Ipomoea cairica) ，8 为蕹菜 (Ipomoea aquatica) ，9 为海南薯 (Ipomoea
staphylina) ，10 为小心叶薯 (Ipomoea obscura) ，11 为毛果薯 (Ipomoea eriocarpa) ，12 为线叶旋花 (Convolvulus lineatus) ，13 为田旋花 (Con-
volvulus arvensis) ，14 为旋花 (Calystegia sepium) ，15 为肾叶打碗花 (Calystegia soldanella) ，16 为藤长苗 (Calystegia pellita)。
番薯属中原牵牛属的 3 个种与 2 个实验样本，
其相互间 Kimura 2 － parameter 距离范围为 0. 00 ～
0. 02，平均值约 0. 019，其中圆叶牵牛、白色圆叶
牵牛和紫色重瓣圆叶牵牛相互间 Kimura 2 － param-
eter距离为 0. 00;牵牛、变色牵牛与圆叶牵牛、白
色圆叶牵牛和紫色重瓣圆叶牵牛之间的 Kimura 2 －
parameter距离都为 0. 02;牵牛和变色牵牛相互间
的 Kimura 2 － parameter 距离为 0. 01。由此可知，
实验样本中的白色圆叶牵牛就是圆叶牵牛这个种，
紫色重瓣圆叶牵牛是圆叶牵牛种下分类水平的一个
变种或变型;牵牛和变色牵牛之间的亲缘关系较
近，它们与圆叶牵牛的亲缘关系也较近［14］。
番薯属的另外 6 个种，小心叶薯和毛果薯聚为
一支，相互间 Kimura 2 － parameter 距离为 0. 07;
蕹菜、五爪金龙、番薯和海南薯聚为一支，相互间
Kimura 2 － parameter距离范围为 0. 04 ～ 0. 09，平均
值约 0. 067。这两个群体的遗传距离为 0. 092。由
此可见，番薯属中的小心叶薯和毛果薯亲缘关系较
近，而它们与番薯属的蕹菜、五爪金龙、番薯和海
南薯的亲缘关系则相对较远。
打碗花属的 3 个种，肾叶打碗花、旋花和藤长
苗，其相互间 Kimura 2 － parameter 距离范围为
0. 04 ～ 0. 05，平均值约 0. 043，说明其相互间的亲
缘关系较近。旋花属的 2 个种，线叶旋花、田旋
花，其相互间 Kimura 2 － parameter 距离为 0. 11，
说明这两种植物在旋花属中亲缘关系相对较远。
37第 4 期 刘 峥等:旋花科植物 ITS序列分析
3 结语
本项研究从野外采集了紫色重瓣圆叶牵牛以及
白色圆叶牵牛进行 ITS 序列分析对比实验，并在
GenBank中下载了旋花科跟实验材料序列同源的物
种 ITS序列，构建了系统发育树，分析了其在系统
发育树中的进化关系。结果证明:疑似新种的紫色
重瓣圆叶牵牛并非一个新种，而是属于圆叶牵牛种
下分类水平的变种或变型。
虽然从形态学上可以对旋花科各种植物进行分
类，但是其亲缘关系远近及系统进化过程还是很难
确定，本项研究对旋花科 3 个属:打碗花属、旋花
属和番薯属植物的 ITS 序列进行分析，确定了这 3
个属间种内的亲缘和进化关系，从分子方面证明原
牵牛属和番薯属的亲缘关系较近，支持一些学者把
牵牛属并入番薯属作为其中的亚属、组或亚组的意
见;打碗花属、旋花属的植物与番薯属、原牵牛属
的植物应为旋花科两大亲缘关系较远的类群。
目前对旋花科植物的遗传多样性和亲缘关系的
研究还很少。同时，研究所涉及的种类较少，研究
的方法较单一，也难以较系统全面地评价旋花科植
物遗传多样性及亲缘关系，因此有必要采用一些新
的方法，选取更多的种来对该科植物的遗传多样性
及亲缘关系作更深入的研究，为旋花科植物的分类
和系统发育研究提供理论依据。
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