全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2015，27(8) :1394 － 1398 http:/ /www． zjnyxb． cn
胡靖锋，杨红丽，徐学忠，等． 芸薹属萝卜胞质不育抗根肿病种质创新研究［J］． 浙江农业学报，2015，27(8) :1394 － 1398．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004 － 1524. 2015. 08. 14
收稿日期:2014-08-04
基金项目:农业部公益性行业专项(201003029) ;云南省科技厅重点新产品开发计划(2012BB017) ;云南省农业厅蔬菜新品种协作项目
［云财农(2012)58 号］
作者简介:胡靖锋(1982—) ，男，云南曲靖人，助理研究员，从事蔬菜抗病遗传育种研究。E-mail:good_mf_13@ 163． com
* 通讯作者，和江明，E-mail:hejiangming666@ qq． com
芸薹属萝卜胞质不育抗根肿病种质创新研究
胡靖锋1，杨红丽1，徐学忠1，和江明1，* ，赵 颖2
(1 云南省农业科学院 园艺作物研究所，云南 昆明 650205;2 云南农业职业技术学院 农学院，云南 昆明 650212)
摘 要:为将结球白菜 A组染色体上的抗根肿病基因转育至甘蓝型油菜和甘蓝里，试验以萝卜胞质不育抗根
肿病白菜不育系 C49-141 为母本，以甘蓝自交系 MWZS 为父本进行杂交。应用胚挽救技术，在授粉后 12 d，
接种在 MS + 1. 00 mg·L －1 6-BA + 0. 08 mg·L －1 NAA培养基上，成功获得培养材料 C49-141“1 /1”× MWZS“3 /
1”。经对培养材料扩繁，进行染色体加倍、菌土法抗根肿病鉴定，通过用形态学观察与气孔保卫细胞叶绿体
数目鉴定植株染色体倍性对比，获得萝卜胞质不育抗根肿病 AACC型染色体甘蓝型油菜材料 ZZCZ13000，AC
型染色体种间材料 ZZCZ13001。
关键词:抗根肿病;芸薹属;萝卜胞质不育
中图分类号:S 631. 1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2015)08-1394-05
Study on the CMS germplasm innovation of clubroot resistance in Brassica
HU Jing-feng1，YANG Hong-li1，XU Xue-zhong1，HE Jiang-ming1，* ，ZHAO Ying2
(1 Institute of Horticultural Crops，Yunan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China;2 Agricultural
College，Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture，Kunming 650212，China)
Abstract:In order to transfer the clubroot resistance genes on A group chromosome of Brassica campestris L． ssp． Pe-
kinensis(Lour．)Olsson to Brassica Oleracea and Brassica napus，radish cabbage cytoplasmic male sterility (CMS)
lines C49-141 with resistance to clubroot and cabbage inbred lines MWZS were used as female and male parents． The
material of C49-141“1 /1”× MWZS“3 /1”was successfully obtained on the culture medium of MS + 1. 00 mg·L －1 6-
BA + 0. 08 mg·L －1 NAA on 12 days after pollination by embryo rescue techniques． We used a series of methods to
identify chromosome ploidy of plants，including micropropagation of plants，chromosome doubling，bacteria soil inoc-
ulation identification，as well as the morphological observation and identification of stomatal guard cell chloroplast
number． Finally，We obtained the materials of Brassica napus ZZCZ13000，which was radish cytoplasmic male sterile
and resistant to clubroot disease and had chromosome AACC;and interspecific hybridization materials ZZCZ13001，
which had chromosome AC．
Key words:clubroot resistance;Brassica;radish CMS
远缘杂交是不同种间、属间，甚至亲缘关系
更远的物种之间的杂交，可把不同种、属的特征、
特性结合起来，突破种属界限，扩大遗传变异，从
而创造新的变异类型或新物种。随着种质资源
竞争日益激烈，远缘杂交作为种质创新的方法，
发挥着重要的作用。远缘杂交一般具有不亲和
性，人工杂交通常不易结实［1］，且分离世代长，不
易稳定。但随着生物技术的发展，可通过胚挽
救、染色体加倍等技术来解决这些问题，从而扩
大遗传变异范围，创造新的品种。石艳等［2］通过
利用胚挽救技术创制了葡萄多倍体种质，最终获
得 10 株杂种植株;日本学者用芸薹属蔬菜子房
培养获得种间杂种;赵德培等［3］对幼胚培养，通
过愈伤组织获得甘蓝与白菜的种间杂种植株。
由于远缘杂交获得的植株往往混有单倍体和自
然加倍的双单倍体、多倍体植株，故需对得到的
植株进行倍性鉴定。许多研究者采用流式细胞
仪、根尖染色、气孔保卫细胞叶绿体数目计数等
方法对所得植株进行倍性鉴定［4 － 5］。本研究采
用抗根肿病的萝卜胞质不育大白菜与品质优良
的甘蓝进行种间杂交，通过胚挽救技术、组织扩
繁及抗病鉴定等方法，获得 AACC 型染色体甘蓝
型油菜材料及 AC 型染色体种间材料，为选育抗
根肿病的萝卜胞质不育甘蓝新品种奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
试验以抗根肿病的萝卜胞质不育大白菜材
料 C49-141 为母本，甘蓝材料 MWZS为父本。
1． 2 方法
2013 年初，将母本材料 C49-141、父本材料
MWZS 种于试验基地大棚中，待抽薹开花时，将
父母本已开花蕾去除，对未开花蕾喷洒农药，并
套上硫酸纸袋以防花粉污染。花开后将父本花
粉授在母本雌蕊上，待萌发后将子房进行胚挽救
处理。
1． 2． 1 授粉后天数对胚珠培养的影响
授粉后，将 3 个组合 i(C49-141“1 /1”×
MWZS“3 /1”) ，ii(C49-141“1 /2”× MWZS“2 /1”) ，
iii(C49-141“1 /1”× MWZS“1 /3”)的子房分别在
5，12，18，25，30 d 取下后，在超净工作台进行表
面消毒，并用解剖针将胚珠取出接种在培养基
中，每个取样天数处理接种 10 个，重复 3 次，观
察培养成活情况。
1． 2． 2 不同培养基对胚珠培养的影响
将授粉后生长一定天数的子房取下，在超净
工作台用一定浓度酒精及次氯酸钠溶液消毒后，
在无菌条件下将胚珠从子房中取出，接种到 MS
固体培养基中，其中琼脂 0. 7%，蔗糖 2%。不同
胚珠培养 MS 培养基配方分别为:Ⅰ，2. 00 mg·
L －1 6-BA + 1. 00 mg·L －1 NAA;Ⅱ，1. 00 mg·L －1
6-BA +0. 08 mg·L －1 NAA;Ⅲ，3. 00 mg·L －1 6-BA
+1. 00 mg·L －1 NAA;Ⅳ，0. 50 mg·L －1 6-BA +
0. 20 mg·L －1 NAA;Ⅴ为不加任何激素的空白处
理。每种培养基接种 10 个胚珠，重复 3 次，并观
察其诱导情况。
1． 2． 3 杂种植株的形态学鉴定
对植株进行形态学观察，记录每个植株的形
态特征，以此进行植株的倍性鉴定。
1． 2． 4 观察杂种植株气孔保卫细胞叶绿体数目
参照朱慧琴等［4］的染色体倍性快速鉴定方
法。取第 4 片以上的真叶下表皮于载玻片上，用
碘 －碘化钾染色液染色，加盖玻片后，在显微镜
下计数气孔保卫细胞叶绿体数目。
1． 2． 5 不同激素及浓度对再生苗生根的影响
将壮苗后的植株转入不同生根培养基进行
比较试验。不同 MS 生根培养基配方分别为:①
不加任何激素的空白对照;②1. 00 mg·L －1 6-BA
+ 0. 10 mg·L －1 NAA;③0. 10 mg·L －1 NAA;④
0. 20 mg·L －1 NAA。培养基 pH值 5. 8，蔗糖 2%，
琼脂 0. 7%。接入苗培养 20 d后调查生根情况。
2 结果与分析
2． 1 授粉后时间对胚珠培养的影响
由表 1 可知，ⅰ，ⅱ，ⅲ组合在授粉后不同天
数取材接种，胚珠诱导成活情况各不相同。授粉
表 1 授粉后不同天数取样对胚珠诱导成活的影响
Table 1 Effect of different sampling days after pollination
on induction of ovule
材料组合 不同天数取样的胚珠诱导数
5 d 12 d 18 d 25 d 30 d
ⅰ 0 cB 4. 0 aA 1. 0 bB 0 cB 0 cB
ⅱ 0 cB 1. 0 bB 0 cB 0 cB 0 cB
ⅲ 0 cB 1. 0 bB 0 cB 0 cB 0 cB
注:数据后没有相同小写字母表示差异显著(P ＜ 0. 05) ，没有相
同大写字母表示差异极显著(P ＜ 0. 01)。下同。
·5931·胡靖锋，等． 芸薹属萝卜胞质不育抗根肿病种质创新研究
后 12 d取材对胚珠诱导成活数最高，与其他时间
取材诱导成活个数相比存在极显著差异。其中，
组合ⅰ在授粉后 12 d 取材，接种成活数为 4 个，
18 d时为 1 个;其余取材时间均无诱导成活。组
合ⅱ在授粉后 12 d 取材，接种成活数为 1 个，其
余取材时间均无诱导成活。组合ⅲ在授粉后 12
d取材，接种成活数为 1 个，其余取材时间均无诱
导成活。另外，组合ⅰ胚珠诱导成活个数较其他
2 个组合成活个数多。
2． 2 不同培养基对胚珠培养的影响
由表 2 可以看出，培养基Ⅱ的诱导成活效果
最好，诱导率为 40%，相比其他培养基，诱导效果
差异极显著。相比空白培养基，培养基Ⅱ诱导成
活率为其 4 倍，培养基Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ的诱导效果均较
差，为 0。由此可见，培养基Ⅱ最适宜胚珠的诱导
培养。
表 2 不同激素浓度配比的培养基对胚珠的诱导培养
Table 2 Effect of different hormone combinations on induc-
tion of ovule
培养基 6-BA /(mg·L －1) NAA /(mg·L －1) 诱导率 /%
Ⅰ 2. 00 1. 00 0 bB
Ⅱ 1. 00 0. 08 40 aA
Ⅲ 3. 00 1. 00 0 bB
Ⅳ 0. 50 0. 20 0 bB
Ⅴ 0 0 10 bB
2． 3 不同倍性植株的形态鉴定
胚挽救成活的单胚组培增殖出的杂种植株
生根后，移栽室外炼苗生长一段时间后，观察其
生长情况(图 1)。结果发现，单倍体移栽不易成
活，成活植株瘦弱，叶片较小，生长缓慢，叶片上有
毛刺;二倍体植株移栽较单倍体易成活，植株高，
叶片厚大，叶色翠绿，且生长旺盛，花蕾正常。
2． 4 不同倍性植株气孔保卫细胞叶绿体数目的
鉴定
通过观察，单倍体植株气孔保卫细胞叶绿体
图 1 单倍体形态
Fig． 1 Morphological of haploid
数在 6 ～ 8 个，二倍体植株气孔保卫细胞叶绿体
数在 10 ～ 15 个(图 2)。
图 2 不同植株叶片气孔保卫细胞叶绿体数目
Fig． 2 Chloroplast number of different ploidy plants
由表 3 可知，单倍体与二倍体植株叶绿体
数目差异极显著，而组合ⅰ与 MWZS 二倍体植
株叶绿体数目差异不显著。从叶绿体平均数目
上看，组合ⅰ的单倍体与二倍体符合 1 ∶ 2 的比
例。MWZS为已知二倍体材料，气孔保卫细胞
叶绿体数目鉴定与形态学观察鉴定结果相同，
一致性为 100%;组合ⅰ中的叶绿体数目鉴定与
形态学鉴定结果一致性，达到 93%。由此说明，
用气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定植株倍性是可
行的。
2． 5 不同激素对再生苗生根的影响
以空白培养基为对照，将胚珠培养生成的
再生苗转入不同培养基中，生根效果如表 4
所示。
由表 4 可以看出，① ～④号培养基生根率各
不相同，其中④号培养基的生根效果最好，为 100%，
表 3 不同倍性植株气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定与形态学鉴定的一致性
Table 3 Consistency of chloroplast number identification of stoma and morphological identification in different ploidy plants
材料 叶绿体数目 叶绿体数目鉴定 形态学鉴定
单倍体 二倍体 单倍体比例 /% 二倍体比例 /% 单倍体比例 /% 二倍体比例 /%
一致性 /%
组合ⅰ 6. 67 bB 11. 67 aA 73 27 80 20 93
MWZS — 14 aA 0 100 0 100 100
·6931· 浙江农业学报 第 27 卷 第 8 期
表 4 不同激素对再生苗生根的影响
Table 4 Effects of different hormones on the rooting of re-
generated plantless
培养基 6-BA /
(mg·L －1)
NAA /
(mg·L －1)
生根率 /
%
① 0 0 0 dD
② 1. 0 0. 1 60 cC
③ 0 0. 1 80 bB
④ 0 0. 2 100 aA
且根系发达，与其他培养基的生根效果差异达极
显著水平。其次是③号培养基，生根率为 80%。
②号培养基生根率为 60%，根系较细，且不发达。
①号培养基不生根。由此可知，④号培养基最适
植株的生根诱导，其生根效果及植株移栽成活情
况见图 3。
图 3 ④号培养基生根效果及植株移栽成活情况
Fig． 3 Ｒooting effect of culture medium ④ and transplan-
ting of plants
2． 6 再生植株的抗病鉴定
对生根加倍后炼苗移栽的再生植株进行根
肿病的抗性鉴定，采用根部注射对鉴定的再生植
株进行接种侵染。结果表明，90%的植株对根肿
病具有抗性，这为选育抗病新品种打下基础。
3 讨论
大白菜与甘蓝种间杂交由于存在生殖隔离
障碍，不宜结实，很难获得杂交种［6］。但通过胚
胎挽救技术可以克服远缘杂交不亲和性，从而获
得杂交种［7 － 9］。研究人员通过胚挽救技术及对
培养条件进行优化，获得杂种植株和杂交种。祝
朋芳等［10］对大白菜和羽衣甘蓝种间杂交的研究
表明，培养 14 d的离体胚胚龄最适宜，采用 MS +
2. 00 mg·L －1 BA + 0. 05 mg·L －1 NAA + 30 g·L －1
蔗糖培养基，胚发育成小植株。陈树忠等［11］对
甘蓝型油菜和羽衣甘蓝种间杂交杂种进行胚胎
挽救研究表明，授粉后 10 d，子房培养获得种子
成功率较高。采用 B5 + 1. 00 mg·L
－1 BA + 0. 20
mg·L －1 NAA +0. 5%活性炭 +30 g·L －1糖 +8. 0 g·
L －1琼脂培养基，对甘蓝型油菜和羽衣甘蓝杂交
子房培养效果较理想。扈新民等［12］研究发现，
胚珠培养优于子房培养，胚珠培养适宜取材时间
为蕾期授粉后第 14 天、花期授粉后第 16 天。研
究认为，在花期授粉后 12 d 取胚珠培养，培养成
活率最高。培养基采用 MS +1. 00 mg·L －1 6-BA +
0. 08 mg·L －1 NAA 最适宜胚珠诱导培养。研究
结果与已有研究有相似之处。研究还发现，未加
激素的 MS培养基上有胚珠诱导成活，说明培养
基中加入激素诱导胚培养成活并非唯一途径，提
高胚诱导率还有待进一步研究。
张亚丽等［13］研究发现，在植株生根培养研
究中，1 /2MS培养基中附加 0. 1 mg·L －1 NAA 为
小孢子植株的最适生根培养基，生根率为 100%。
韩晓光等［14］对羽衣甘蓝丛生芽诱导和植株再生
进行研究表明，生根阶段以 1 /2MS + 0. 50 mg·
L －1 IBA 生根效果最好;冯辉等［15］研究认为，生
根培养基以 1 /2MS + 0. 10 mg·L －1 NAA + 3%蔗
糖 + 0. 7%琼脂为宜。本研究中最适生根培养基
为 MS +0. 20 mg·L －1 NAA + 2%蔗糖 + 0. 7%琼
脂，与已有研究结果不一致。该培养基诱导生根
后根系发达，移栽后成活率高。
植株倍性鉴定是胚挽救技术的重要组成部
分，常见方法有形态学观察、流式细胞仪测
定［16］、根尖染色体计数法［5］等。本研究采用气
孔保卫细胞叶绿体计数与形态学观察相结合的
方法，鉴定大白菜与甘蓝种间杂种植株染色体倍
性，准确率达 93%以上。此外研究还发现，镜检
材料染色前用无菌蒸馏水浸泡后再染色，观察效
果比不浸泡直接染色观察效果好。气孔保卫细
胞叶绿体计数鉴定染色体倍性不仅运用于十字
花科作物中，还广泛运用于瓜果、烟草等［4，17 － 18］
经济作物中。研究认为，气孔保卫细胞叶绿体计
数法用于鉴定染色体倍性是一种既经济实惠、又
快速简便的鉴定方法，这与朱惠琴等［4，19］的研究
观点相同。究其原因认为，流式细胞仪检测虽然
准确、快捷，但费用高，不易普及;根尖染色体计
数需积累一定的细胞学知识及熟练操作才可获
得理想结果，且步骤复杂，每个环节出错都会影
·7931·胡靖锋，等． 芸薹属萝卜胞质不育抗根肿病种质创新研究
响结果。所以叶绿体计数法鉴定染色体倍性是
一种重要方法，提高叶绿体计数倍性鉴定效率是
今后研究的新方向。本研究运用胚挽救技术及
叶绿体快捷倍性鉴定法，通过抗根肿病萝卜胞质
不育大白菜与甘蓝种间杂交获得抗根肿病的种
质资源，为今后选育抗根肿病的甘蓝品种奠定
基础。
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(责任编辑 张瑞麟)
·8931· 浙江农业学报 第 27 卷 第 8 期