全 文 ：2010年 3月
2010, 32(1):020 -024
中国油料作物学报
Chinesejournalofoilcropsciences
芸薹属种子贮藏蛋白质组分的比较研究
孔　芳 ,蒋金金 ,吴　磊 ,葛才林 ,王幼平＊
(扬州大学生物科学与技术学院 ,江苏 扬州 225009)
　　摘要:对组成芸薹属 3个基本种和 3个复合种的种子贮藏蛋白亚基组成进行了 SDS-PAGE比较分析 ,结果表
明:不同种间的种子贮藏蛋白具有一定的差异 , 表现出丰富的多态性;6个种共有 24条亚基带 , 并各自具有特征蛋
白谱带。利用贮藏蛋白亚基条带的信息 , 分析了种间的蛋白相似度 , 并进行了聚类分析。供试材料分为两类:Ⅰ类
为白菜型油菜 、甘蓝与甘蓝型油菜;Ⅱ类为黑芥 、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥。
关键词:芸薹属;种子贮藏蛋白;SDS-PAGE;蛋白质亚基;亲缘关系
中图分类号:S565.403　　文献标识码:A　　文章编号:1007-9084(2010)01-0020-05
ComparativestudyonseedstorageproteinofBrassicaspecies
KONGFang, JIANGJin-jin, WULei, GECai-lin, WANGYou-ping＊
(ColegeofBioscienceandBiotechnology, YangzhouUniversity, Yangzhou225009, China)
Abstract:SeedstorageproteinsextractedfromsixspeciesofBrasicawereanalysedwithSDS-PAGE.Seed
storageproteinscontained24subunits, whichexhibitedabundantpolymorphismsandspecificproteinbandsamong
diferentspecies.Clusteranalysisindicatedthat6 specieswereclassifiedintotwotypes.Firsttypeincluded
B.rapa, B.oleraceaandB.napus.ThesecondtypeincludedB.nigra, B.junceaandB.carinata.
Keywords:Brasica;Seedstorageprotein;SDS-PAGE;Proteinsubunits;Geneticrelationship
收稿日期:2009-07-18
基金项目:国家自然科学基金(30671166, 30971812)
作者简介:孔芳(1973-),女 ,博士研究生
＊通讯作者:王幼平 ,男 ,博士生导师 ,教授 ,主要从事油菜遗传和生物技术育种研究 , Tel:0514-87997303, E-mail:wangyp@yzu.edu.cn
　　芸薹属(BrasicaL.)是十字花科(Brasicaceae)
植物中经济价值最大的一个属 ,约 40种 ,主要分布
在地中海区域。中国有 13个栽培种 、11个变种和 1
个变型 ,南北各地均有栽培 ,可用于蔬菜 、油料 、药用
以及调味品等[ 1] 。芸薹属主要包括 3个基本种:白
菜(B.rapa, AA, 2n=20)、甘蓝(B.oleracea, CC, 2n=
18)和黑芥(B.nigra, BB, 2n=16)以及 3个异源四
倍体复合种:甘蓝型油菜 (B.napus, AACC, 2n=
38)、芥菜型油菜(B.juncea, AABB, 2n=36)和埃塞
俄比亚芥(B.carinata, BBCC, 2n=34)。大量的实验
表明 , 3个异源四倍体物种分别是由各自不同二倍
体种相互杂交通过自然选择后进化而来 [ 2 ～ 5] 。 Song
等 [ 2]利用 RFLP分析芸薹属 3个二倍体栽培种的起
源与进化关系 ,认为这 3个栽培种可能起源于一个
共同的祖先 ,白菜型油菜和甘蓝的亲缘关系比黑芥
近 ,它们分属于两个不同的进化途径。分子标记方
法研究表明:芸薹属基因组进化过程中可能发生了
染色体融合或裂变 ,从而导致染色体数目的变化 ,同
时也可能伴随着大片段染色体的易位和倒位[ 6 ～ 9] 。
我们利用着丝粒重复序列做探针进行的原位杂交及
CAPS(Cleavedamplifiedpolymorphicsequences)标
记也报道过芸薹属的 3个基本种与 3个复合种之间
的亲缘关系 ,确认了基因组 A和 C非常相似 ,而基
因组 B与 A、C关系较远的研究结果 ,同时 3个复合
种也并不是 2个基本种的简单相加 ,表现出异源四
倍体在长期进化过程中可能发生了重排和重组 [ 10] 。
种子贮藏蛋白 (Seedstorageproteins, 简称
SSPs)是近年来应用较广泛的一种生化标记。蛋白
质的合成受植物体内基因的控制 ,是很好的遗传标
记。由于蛋白质分子量大小不一 ,所带电荷不同 ,所
以利用电泳法 ,可以根据蛋白质在立体网状结构的
凝胶中移动速度不同 ,分离出蛋白质分子 ,表现出蛋
白质分子谱带的差异 ,不同的品种和杂交种具有不
同的谱带模式 ,从而可以从蛋白质水平鉴别出不同
植物材料的差异 。种子贮藏蛋白作为遗传标记已被
广泛应用于种 、属间关系 、种内遗传多样性分析 、品
种鉴定以及植物繁育系统的鉴别 ,如国内近期在水
稻 、小麦和大豆的研究 [ 11 ～ 13] 。 SDS-PAGE方法对
芸薹属种子贮藏蛋白的研究分别在甘蓝型油菜和白
菜中运用过 [ 14, 15] 。本文首次对芸薹属的 3个基本
种(白菜 、甘蓝和黑芥)和 3个复合种(甘蓝型油菜 、
芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥)的种子贮藏蛋白进行
SDS-PAGE系统的分析 ,研究芸薹属种子贮藏蛋白
质亚基构成及四倍体形成过程中亚基的变化。
1　材料与方法
1.1　材料
白菜型油菜品种矮抗青(B.rapa, AA, 2n=20)
与甘蓝品种中花芥蓝(B.oleracea, CC, 2n=18)的纯
合种由中国农业科学院油料作物研究所提供;黑芥
品种 Koch(B.nigra, BB, 2n=16),甘蓝型油菜品种
扬油 6号(B.napus, AACC, 2n=38)、芥菜型油菜品
种胜利油菜(B.junceaCzern., AABB, 2n=36)以及
埃塞俄比亚芥(B.carinata, BBCC, 2n=34)种子由江
苏里下河地区农科所提供 。
1.2　方法
1.2.1　种子贮藏蛋白质样品的提取　按 Hurkman
和 Tanaka[ 16]的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法 ,
并有所改进 。将 0.5g成熟种子在液氮中研磨成粉
末状 ,分别加入提取液 10mL[ 50%(v/v)苯酚 , 0.45
mol/L蔗糖 , 5mmol/LEDTANa2 , 0.2% (v/v)β -巯
基乙醇 , 50mmol/LTris-HCl, pH8.8] ,充分混匀后
将装有匀浆液的离心管在 4℃条件下 ,摇床上振荡
30min,然后 4℃ 5 000g离心 15min,吸取上清液至
一新离心管中加入 5倍体积的 -20℃的 0.1mol/L
乙酸铵(0.770 8g乙酸铵溶解在无水的 100mL甲醇
中), -20℃冰箱静置沉淀 16h或过夜 。第二天 4℃
5 000g离心 10min,沉淀的蛋白用 0.1mol/L乙酸铵
洗涤 2次 ,再用冰冻的 80%的丙酮洗 1次 ,最后用
70%的乙醇洗涤后 , 蛋白粉 37℃干燥后 , 放置
-70℃冰箱保存备用。
1.2.2　SDS-PAGE电泳 　按 Sambrook等 [ 17]的
SDS-PAGE程序 ,取适量种子总蛋白样品与 2×样
品缓冲液 (100mmol/LTris-HCl, pH6.8, 200
mmol/LDTT, 4%SDS, 20%Glycerol, 0.2% bromo-
phenolblueR)混合 , 99℃变性处理 10min后 ,在 8%
的分离胶和 5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上
电泳分离 。使用 DYY212型电泳仪和 DYCZ228C
型垂直双板夹芯式电泳槽 ,电极缓冲液为十二烷基
硫酸钠 -甘氨酸 (pH8.3)。每个样品点样 15μL,
室温下 40V电压待指示剂到达分离胶与浓缩胶界
面时 ,再调至 100 V稳压电泳 ,待指示剂迁移至凝胶
底部后结束电泳。
1.2.3　染色和脱色　取下胶后 ,在染色液(1.0g考
马斯亮蓝 R250 , 450mL甲醇 , 100mL冰醋酸 , 450mL
双蒸水)中染色 30min,然后用脱色液(100mL甲醇 ,
100mL冰醋酸 , 800mL双蒸水)脱色 1d。
1.2.4　聚类分析　参照刘敏轩等[ 18]的方法 ,根据
电泳结果计算每个实验材料蛋白带的 Rf值及统计
蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率 Rf=蛋
白带迁移距离 /溴酚蓝迁移距离。记录样品中产生
的多态性蛋白带 ,同一 Rf值位置上有蛋白条带的记
为 1,无蛋白带记为 0。输入计算机 ,用 cluster软件
聚类分析 ,根据 Main方法构建表征树。
2　结果与分析
2.1　油菜种子贮藏蛋白质亚基分析
种子贮藏蛋白主要分为 4类:清蛋白 、球蛋白 、
谷蛋白和醇溶蛋白;油菜种子中的贮藏蛋白主要是
球蛋白和谷蛋白[ 19] 。为了探究芸薹属各种间的种
子贮藏蛋白的差异 ,提取种子贮藏蛋白后进行 SDS
-PAGE分析 。供试的 6个种的蛋白谱带在不同种
间存在差异 ,所试材料的贮藏蛋白共表现出 24条谱
带 , 14条具有多态性。其中亚基条带数最多的是甘
蓝 ,共 19条带 ,黑芥条带数最少 ,仅 11条。种与种
之间的差异主要表现在 66.2 ～ 97.4kD之间(图 1)。
同时 , 3个基本种与 3个复合种都含有 Rf值为
0.235、0.412、0.434、 0.593、0.633、 0.674、0.789、
0.874、0.899、0.926的 10条共同的蛋白带 。
白菜型油菜(AA)含有专化的特征蛋白带 5号
和 14号谱带(图 1), Rf值分别为 0.375和 0.535,
且谱带染色较深 , 这两条特征带为 A基因组所特
有;异源四倍体种芥菜型油菜(AABB)中也含这两
条谱带 ,只是染色较浅;但另一个异源四倍体种甘蓝
型油菜(AACC)没有该特征带。甘蓝 (CC)含有专
化的 Rf0.286(2号)、0.467(10号)和 0.482(11
号)特征带 ,但在异源四倍数体甘蓝型油菜(AACC)
具有其中 2号与 10号特征谱带 ,而埃塞俄比亚芥
(BBCC)只具有 2号(带较弱 ,图 1中未标出)。黑
芥(BB)含有专化的特征谱带 12号 , Rf值 0.513,出
现此特征带的是芥菜型油菜(AABB),而埃塞俄比
亚芥(BBCC)中虽含有这条特征谱带 ,但染色非常
21孔　芳等:芸薹属种子贮藏蛋白质组分的比较研究
浅 。
和 3个基本种相比较 , 3个异源四倍体的谱带
基本上是双亲的叠加 ,没有新的条带的产生 ,但有的
缺少了双亲的条带。如 AACC所形成的带缺少了 4
条 Rf值分别为 0.347、0.375(5号)、0.482(11号)
和 0.535(14号),其中 5号与 14号是来源于 AA基
因组的特征谱带 , 特别是染色较深的 5号 ,而 Rf
0.347与 11号是来源于 CC基因组的特征谱带(图
1)。同样 , AABB与 BBCC所形成的谱带也如此 ,并
不完全是双亲的叠加 ,也各自缺少了亲本中的部分
谱带 , AABB中缺少的 3条 Rf值分别为 0.321、
0.422(8号)与 0.523(13号),这 3条谱带均来源于
AA基因组 ,而 BBCC中缺少的蛋白谱带最多 ,达到
5条 , Rf分别为 0.422(8号)、0.467(10号)、0.482
(11号)、0.558(15号)与 0.744(20号)(图 1),这 5
条谱带全部来源于 CC基因组。
AA,白菜型油菜;CC,甘蓝;BB,黑芥;AACC,甘蓝型油菜;AABB,芥菜型油菜;BBCC,埃塞俄比亚芥
AA, B.rapa;CC, B.oleracea;BB, B.nigra;AACC, B.napus;AABB, B.juncea;BBCC, B.carinata
图 1　芸薹属种子贮藏蛋白 SDS-PAGE电泳图
Fig.1　SDS-PAGEofseedstorageproteinsofBrassicaspecies
2.2　6个种蛋白质亚基相似度及亲缘关系
蛋白质亚基的构成严格受基因的控制 ,因此稳
定的蛋白质亚基谱就直接地反映了基因型的异同 ,
而蛋白质电泳图谱是非常稳定 ,所以根据蛋白质亚
基构成的相似度就能预测亲缘关系 。 Vaughan
等 [ 20]提出蛋白质谱或酶谱相似度指数愈高 ,亲缘关
系愈近 。表 1是白菜型油菜(AA)与其它 5个种间
的蛋白质亚基相似度指数。可以看出:AA与 AACC
间的相同蛋白亚基数最多 ,在两者共有 20条蛋白质
亚基中相同亚基数达到 15条 ,相似度指数达到
0.750;其次是与含 AA基因组的 AABB,达到0.737;
相同亚基数最少的是 BB,在共有的 18条亚基中只
有 10条亚基相同 ,相似度最低 ,仅为 0.555。
甘蓝与其它 5个种之间也进行类似的蛋白质亚
基相似度指数的比较(表 2)。在表 2中出现了最大
的相似度指数值为 0.762,这是甘蓝 CC与四倍体
AACC间比较的数值 ,在两者共有的 21条蛋白质亚
基条带数的情况下 ,相似亚基数高达 16条 ,在所有
比较值中无论是绝对值还是相对值 ,数值都达最大。
2.3　种间的遗传距离和聚类分析
种子贮藏蛋白多态性反映了芸薹属基因组中编
码这些蛋白质基因的变异情况 ,因此根据油菜种子
表 1　白菜型油菜与其它 5个种间的蛋白质亚基相似度指数
Table1　SimilarityindexofproteinsubunitsinB.rapawithotherspecies
种类 Species 相同亚基数 No.ofsimilarsubunits 不同亚基数 No.ofdiferentsubunits 相似度指数 Similarityindex
CC 13 10 0.565
BB 10 8 0.555
AACC 15 5 0.750
AABB 14 5 0.737
BBCC 12 9 0.571
22 中国油料作物学报　2010, 32(1)
表 2　甘蓝与其它种间的蛋白质亚基相似度指数
Table2　SimilarityindexofproteinsubunitsinB.oleraceawithotherspecies
种类 Species 相同亚基数 No.ofsimilarsubunits 不同亚基数 No.ofdiferentsubunits 相似度指数 Similarityindex
AA 13 10 0.565
BB 10 10 0.500
AACC 16 5 0.762
AABB 12 11 0.522
BBCC 14 7 0.667
　　贮藏蛋白电泳获得的 24条蛋白带的 Rf值信
息 ,对 6个种进行非加权类平均聚类法(UPGMA)分
析 ,从而更进一步揭示它们之间的亲缘关系 ,如图 2
所示将芸薹属的 6个种分为两大类:
Ⅰ类:含二倍体种 AA、CC与四倍体种 AACC。
Ⅱ类:含二倍体种 BB与 2个四倍体种 AABB
和 BBCC。
其中第 Ⅰ类的材料共同的蛋白质谱带有 13条 ,
第 Ⅱ类的材料中共同带仅有 11条。聚类的结果与
前人所得的芸薹属基因组 A和 C亲缘关系较近 ,而
B与 A或 C相距较远的研究结果是一致的 [ 3 ～ 10] 。
图 2　油菜种子贮藏蛋白的聚类图
Fig.2　DendrogramofseedstorageproteinsfromBrassica
　　研究中我们发现 6个种之间具有 10条共同的
蛋白带 ,这也表明油菜种子贮藏蛋白有一定的保守
性 。同时异源四倍体并不是 2个基本种的简单相
加 ,有的还有缺失的蛋白质带 。特别是异源四倍体
AABB中缺少的 3条谱带均来源于 AA基因组 ,而
BBCC中缺少的 5条谱带全部来源于 CC基因组 ,这
个研究结果完全与芸薹属 3个栽培四倍体种中存在
B>A>C的核仁显性梯度的发现 [ 21]是吻合的 ,即在
芥菜型油菜 AABB和埃塞俄比亚芥 BBCC中表达的
是黑芥 BB的 rRNA基因 。这是不是意味着一个亲
本的某些基因在多倍体形成过程中会沉默 [ 22] ?更
有意思的是 ,组成芸薹属 A、B和 C基因组在形成异
源四倍体过程中相互间是如何作用的 ,哪些基因会
表达 ,哪些基因会沉默 ?回答这些问题 ,还需要更多
研究。
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