全 文 ：收稿日期:2006-12-02
基金项目:贵州省优秀人才省长基金(2005185)资助项目。
作者简介:王国鼎(1981 - ),男 ,山东济宁人;在读硕士研究生 ,主要从
事植物生物技术研究。
通讯作者:文晓鹏 , E-m ail:xpw en0121@ yahoo. com. cn。
11种兰属植物 DNA的提取及 RAPD-PCR实验体系的建立与优化
王国鼎 , 文晓鹏 , 季祥彪 , 乔 光 , 胡 鹏
(贵州大学 /贵州省农业生物工程重点实验室 , 贵阳 550025)
摘要:采用改进的 CTAB-DNA提取方法 , 从 11种兰属植物的嫩叶中提取总 DNA。所得的 DNA样品的 A 260 /A 280值在
1. 7 ～ 1. 9之间 , 琼脂糖凝胶上主带清晰 , 较少降解 , 样品纯度高 , DNA量大。 另外 , 对影响 RAPD-PCR的 M g2+、 dNTPs、
Taq酶 、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为:75 ng模板 DNA, 1 ×Buffer, 2. 5 mm o l /L M g2+,
0. 15 mm o l /L dNTPs, 0. 75 U Taq酶 , 引物浓度 0. 4μm o l /L,反应总体积为 25μl。该体系在 20个供试兰属实验材料中获
得较好的扩增结果。
关键词:　兰属植物;DNA提取;RAPD-PCR
中图分类号:　S682. 31　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2007)03-0024-04
Extraction of DNA and Op tim ization of
RAPD-PCR Protocol in 11 Species o fCymbid ium
WANG Guo-ding, WEN Xiao-peng, JI X iang-biao, Q IAO Guang, HU Peng
(G uizhou Key Labo ra tory of Agricultural B ioeng inee ring, Gu izhou Unive rsity, Guiyang 550025, Ch ina)
Abstract:Theme thod ofCTAB-DNA iso lation w as op tim ized and used to ex tract genom ic DNA from the tende r
leaves of 11 species ofCymbidium . DNA samples w ith superio r qua lity and h igh yie ld cou ld be gained by this
method, and the A 260 /A 280 values o f tested samples w ere 1. 7 - 1. 9. To establish the reproducible RAPD-
PCR pro toco l inCymbid ium , the concentrations ofM g2+, dNTPs, TaqDNA po lymerase, and primers we re also
optim ized in the presentw ork. W ith the tota l volum e of reac tion w as 25μl, the op timal sy stem using 75 ng ge-
nom ic DNA , 2. 5mmo l /LM g2+ , 0. 15mmol /L dNTPs, 0. 75U Taq DNA polymerase, and 0. 4μmo l /L prim-
ers, were employed to ca rry ou t PCR in 20 accessions from 11 species o fCymbid ium .
Key words:　Cymbidium ;DNA extraction;RAPD-PCR
　　全世界有兰属植物 48种 ,我国有 29种 [ 1] ,具有重
要的观赏价值和经济价值 。由于各种变种以及自然杂
交种的存在 ,仅凭植株的形态特征进行兰花种质鉴定
较为困难 ,这对兰花品种的整理和研究产生了不利影
响 。有关利用现代分子标记技术研究兰属植物分类及
种质资源研究的报道目前尚不多见[ 2] 。随机扩增多
态性 DNA技术 (Random Amplified Po lymorphic DNA ,
RAPD)是W illiams[ 3]和 Welsh[ 4]发展起来的一项基于
PCR技术的 DNA多态性检测技术。此技术操作简便 ,
成本低 ,检测快速 ,在生物学的许多领域都得到广泛的
应用 , 已成为一种广泛的分子标记技术[ 5] 。然而 ,
RAPD技术采用的引物较短 ,退火温度较低 ,对反应条
件比较敏感 ,应用 RAPD标记时 ,对反应体系进行优化
十分必要[ 6] 。本实验对常规的 SDS法 、传统 CTAB法
及改良后的 CTAB法对兰属植物 DNA的提取作了比
较 ,找出了兰属植物 DNA提取的有效方法 ,同时还对
该属植物 RAPD-PCR反应体系的各影响因素进行了
优化 ,以期为遗传变异及分子进化研究构筑技术平台。
1　材料和方法
1. 1　材　料
用于 DNA提取的材料采自贵州大学农业生物工
程省建重点实验室兰花资源圃 。建立 RAPD优化反应
体系所用材料为野 生春兰 (C. goe ring ii)、春剑
(C. long ibracteatum)、珍珠矮 (C. nanulum)各 1株。验
证优化条件时所用材料分别来自兰属的 11个种
(表 1)。
1. 2　方　法
1. 2. 1　DNA的提取
DNA提取以 CTAB常规法 [ 7 -9]为基础 。为了克服
多酚 、多糖等次生物质对 DNA纯度的干扰 ,提高获得
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第 26卷　第 3期　2007年 3月　 　 　　　　　　　　　种　子　(Seed)　　　 　 　　　　　　　Vo .l 26　No. 3　M ar. 　2007
DOI牶牨牥牣牨牰牭牴牥牤j牣cnki牣牨牥牥牨牠牬牱牥牭牣牪牥牥牱牣牥牫牣牥牬牭
DNA的数量和质量 ,本研究对其进行了改良:(1)选取
新生幼嫩的春兰叶片 ,研磨时不加入 N a2 S2O5;(2)减
少酚的用量 , 避免其残留影响 DNA的质量;(3)用
5mo l /L NaC l 2m l,除去多糖物质 ,同时可减轻 DNA的
褐化。
表 1　实验所用材料及编号
编号 样品 学名 采集地
1 春兰 C. goering ii 贵州省遵义市汇川区
2 多花兰 C. flor ibundum 贵州省贵阳市乌当区
3 落叶兰 C. d efo lia tum 贵州省毕节市亮岩镇
4 寒兰 C. kanra n 贵州省贵阳花溪区
5 送春 C. szech uan icum 贵州省遵义市
6 珍珠矮 C. nanu lum 贵州省都匀市
7 春剑 C. long ibra ctea tum 贵州省开阳县
8 线叶春兰 C. serra tum 贵州省贵阳市
9 春兰 C. goering ii 四川省夹江县
10 春剑 C. long ibra ctea tum 四川省洪雅县
11 春兰 C. goering ii 四川省丹棱县
12 墨兰(企黑) C. sinense (Q ihei) 贵州省贵阳市
13 春兰 C. goering ii 四川省芦山县
14 春兰 C. goering ii 四川省马边县
15 春剑 C. long ibra ctea tum 四川省都江堰市
16 春兰 C. goering ii 四川省攀枝花市
17 春剑 C. long ibra ctea tum 重庆市垫江县
18 建兰(四季兰) C. ensifo lium (S i jilan) 贵州省贵阳市
19 建兰(铁杆素) C. ensifo lium (T iegan su) 贵州省贵阳市
20 兔耳兰 C. lancifo lium 贵州省剑河县
　　改良后的 CTAB法具体提取步骤如下:(1)取新
鲜叶片 1 g,放入已冷冻的研钵中 ,加入不溶性的 PVP
0. 2 g,在液氮中迅速研磨成粉末;然后将粉末放入含
有 650μl高盐提取缓冲液 1. 5m l加入离心管中 ,加入
80μlβ -巯基乙醇 ,混匀 , 65℃水浴的 75m in,其间混匀
2 ～ 3次 ,取出样品 ,冷却至室温;(2)加入 650μl氯仿 /
异戊醇 (24∶1), 50μl饱和酚 ,震荡混匀 , 12 000 r /m in
离心 10m in;(3)取上清液 ,移至另一 1. 5 m l离心管
中 ,再加入 700 μl氯仿 /异戊醇 (24∶1),震荡混匀 ,
12 000 r /m in离心 10m in;(4)取上清液 ,移至另一 1. 5
m l离心管中 ,加入 5mo l /L NaC l 200μl、加入 600μl冰
冻无水乙醇 ,充分混匀 ,静置 , - 20 ℃沉淀凝聚 2 h,
10 000 r /m in离心 10m in;(5)弃上清 ,加入 75%乙醇
洗涤 2 ～ 3次 ,最后将沉淀置于 40℃烘箱中烘干 ,加入
100μlTE buffe r中溶解沉淀 ,待完全溶解后短暂离心。
1. 2. 2　DNA的检测
用紫外分光光度法测定 DNA 260 nm及 280 nm吸
收值 ,然后根据 A 260 /A 280值判断 DNA纯度。
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA样品:采用 1. 0%的琼
脂糖凝胶(含 0. 5 μl /mL的 EB溶液 )进行电泳 ,在紫
外透射仪下检测 DNA的纯度及降解情况。
1. 2. 3　RAPD-PCR扩增
PCR扩增程序为:95℃预变性 8m in,然后 40个
循环 94℃变性 1m in, 37℃复性 1m in 30 s, 72℃延伸
1. 5m in,最后 72℃延伸 7m in, 4℃保存。反应体积 25
μl,并将 Mg2+、dNTPs、Taq酶 、引物等设置不同的浓度
梯度 ,用 S 216(GGTGAACGCT)和 S 219(GTCCGTAT-
GG)引物组合 (上海生工生产 )进行 PCR扩增 。取
10μl扩增产物电泳检测 ,以确定最佳的反应体系 。
2　结果与分析
2. 1　DNA提取分析
用常规 SDS法 [ 10]提取春兰 DNA时 , DNA质量不
高 (图 1)。而传统的 CTAB法得到的 DNA中多糖 、蛋
白质 、RNA等杂质含量也高于改良后的 CTAB法所提
取的 DNA ,其 A 260 /A 280值普遍低于 1. 6, PCR扩增
效果也不理想。虽然 DNA产量与改良 CTAB法相近 ,
但所含杂质较多 。
改良后的 CTAB法得到的 DNA沉淀呈乳白色 ,经
纯度测定 A 260 /A 280均达到 1. 7 ～ 1. 9。从图 1可以
看出 ,电泳检测时 ,点样孔亮度不明显 ,主带清晰 ,且所
供试的 20个样品的 DNA在 RAPD扩增中均获得理想
带型。
图 1　SDS(上)及改良 CTAB(下)法提取 DNA电泳结果
注:1.春兰;2.多花兰;3.落叶兰;4.寒兰;5.送春;6.珍珠矮;
7.春剑;8.线叶春兰;9.墨兰;10.建兰;11.兔耳兰
2. 2　RAPD-PCR反应体系建立与优化
2. 2. 1　不同影响因子对 RAPD-PCR扩增效果的影响
由图 2A可以看出 ,当 Mg2+浓度为 1. 5mmo l /L时
春兰的扩增产物不明显;2. 0 mmo l /L时的谱带也很
弱;2. 5mmo l /L和 3. 0mmol /L时谱带清晰且稳定。所
以 Mg2+浓度以 2. 5mmol /L为宜 。
当 dNTPs浓度为 0. 1mmo l /L和 0. 15mmo l /L时
25
研究报告　　王国鼎 等:11种兰属植物 DNA的提取及 RAPD-PCR实验体系
条带均较清晰 ,但为 0. 1mmo l /L时 ,部分条带不稳定 ,
有缺失现象 ,在 0. 15mmol /L时谱带更为清晰稳定;当
浓度升高到 0. 2 mmo l /L和 0. 25mmol /L时 ,谱带变
弱 ,并且稳定性大大降低 (图 2 B)。 dNTPs是 PCR扩
增反应的原料 ,必须达到一定的浓度才能满足要求 ,但
过高也会与 Taq酶竞争 Mg2 +,对扩增反而不利[ 11] 。
故将 dNTPs浓度确定为 0. 15mmo l /L。
图 2 C结果显示 , Taq酶用量在 1. 25U和 1. 5 U
时 ,谱带较弱 ,而在 0. 75 U和 1. 0 U时均有较为清晰
的谱带 ,且稳定性好 ,所以从经济角度考虑 ,确定 Taq
酶的适宜用量为 0. 75U /25μl。
当引物浓度在 0. 3μmo l /L时 ,春剑和珍珠矮的扩
增谱带较弱;而在 0. 4 μmo l /L、 0. 5 μmol /L和 0. 6
μmo l /L时 ,均有较为清晰的谱带 (图 2 D)。但考虑到
引物的用量过大容易形成引物二聚体 ,所以引物的浓
度以 0. 4μmol /L为宜 。
图 2　4种因子对 RAPD-PCR扩增效果的影响
注:M g2+(a 1. 5mm ol /L, b 2. 0 mm ol /L, c 2. 5mm o l /L, d 3. 0 mm ol /L),
1、 2、3分别代表春兰 、春剑 、珍珠矮(下同);B dNTPs(a 0. 1 mm ol /L,
b 0. 15mmo l /L, c 0. 2mmol /L, d 0. 25mmol /L);C Taq酶(a 0. 75U, b 1. 0
U , c 1. 25U, d 1. 5U);D引物(a 0. 3μM , b 0. 4μM , c 0. 5μM , d. 0. 6μM)。
图 3　20个兰属材料 S 216和 S 219引物组合的
RAPD-PCR扩增谱带(注:实验材料编号同表 1)
2. 2. 2　RAPD-PCR反应体系的确立
根据以上所确定的条件 ,同时用引物 S 216和
S 219组合对供试的 20个兰属实验材料进行扩增 (图
3)。由图 3可以看出 , 20个供试实验材料均有清晰的
谱带 ,且多态性也较好 。
从稳定性和经济性出发 ,并综合以上各种因素 ,确
立兰属植物 RAPD-PCR的最佳反应体系为:模板 DNA
75 ng, Buffer 1 ×, Mg2 + 2. 5 mmol /L, dNTPs浓度为
0. 15mmol /L, Taq酶 0. 75U ,引物浓度 0. 4μmo l /L,反
应体系为 25μl。
3　讨　论
RAPD分析对 DNA纯度的要求比较低 ,模板 OD
值 (A 260 /A 280)略高于 1. 6就可以进行 RAPD分析。
本实验分别使用了 SDS提取法 ,传统的 CTAB法及改
良后的 CTAB提取法对 11种兰属植物新鲜叶片进行
提取。结果表明:改良后的 CTAB法得到的 DNA沉淀
呈乳白色 , 经纯度测定 , A 260 /A 280均达到 1. 7 ～
1. 9,完全可以应用于 RAPD反应 ,所得的 RAPD谱带
均达到理想要求 。
自 RAPD技术诞生至今 ,已在国内外广泛的应用
于动植物种系鉴定 、遗传分析 、连锁图的构建 ,疾病诊
断 、基因分离等方面[ 12] 。尽管 RAPD技术方法简单 ,
灵敏度高 ,但存在实验结果稳定性相对较差的现象 ,因
而大大限制了该技术的应用 。但也有人认为 , RAPD
方法的重复性差完全可以加以改进[ 13] 。根据这些不
同的说法 ,我们发现 ,引起 RAPD方法稳定性差的原因
很多 ,如不同厂家甚至同一厂家不同批次生产的引物
和 Taq酶都会引起实验结果的不一致。另外 ,不同的
人操作及不同的 PCR扩增仪也会产生结果的差异
性 [ 14, 15] ,故对实验条件进行摸索和优化十分必要。本
实验在前人的研究基础上 ,对 RAPD检测技术中的
M g
2 +浓度 、dNTPs浓度 、Taq酶用量 、引物浓度等因素
进行了重复的实验和摸索 ,探索出一套适合兰属植物
RAPD扩增的优化条件 ,并利用它对兰属 20个供试材
料进行了扩增 ,得到了较理想的实验结果 。
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收稿日期:2006-11-27
基金项目:中国农业大学科研启动项目。
作者简介:李　颜(1981 -),女 ,河南新乡人;在读硕士研究生 ,研究方向:种子老化生理。
通讯作者:王　倩(1964 -),女 ,山东济南人;副教授 ,研究方向:蔬菜栽培生理。
大葱种子人工老化与膜脂过氧化的研究
李　颜 , 　王　倩
(中国农业大学 农学与生物技术学院 , 北京 100094)
摘要:大葱种子经过人工老化处理后 , 其发芽率 、发芽指数 、活力指数下降 , 活力指数较发芽率和发芽指数下降明显 , 种子
老化 6天后活力指数比对照下降 70%。脱氢酶 、SOD、POD活性和 GSH含量也呈下降趋势 , 而浸出液可溶性糖 、MDA、自
由基 、H2O2的含量增加 , GSH、H2O2、自由基 、可溶性糖含量与种子活力显著相关 , 并且较其他指标变化更为显著 。说明
大葱种子人工老化过程中膜脂过氧化加剧 , 膜结构和功能遭到破坏。因此 ,大葱种子人工老化与膜脂过氧化直接相关。
关键词:　大葱种子;膜脂过氧化;种子老化
中国分类号:　S633. 1;　S604+. 1　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2007)03-0027-04
The A rtificial Aging ofW elsh On ion Seed and Its
Relation toM emb rane Lipid Pe roxidation
LIYan, 　WANG Q ian
(College o fAg ronomy and B iotechnology o f China Ag ricu lture University, Be ijing 100094, China)
Abstract:W elsh onion seed w as subjected to artificial ag ing under 40℃, 100%RH fo r 1 - 6 day s, the re lation
be tw een artificia l ag ing andmemb rane lipid perox ida tion w as studied. The results indicated tha t in response to
the artificia l ag ing, the germ ina tion rate, germ ina tion index, v igo r index, GSH con tent, the ac tiv ities of dehydro-
genase, POD and SOD decreased. But contents of soluble sugar, MDA , free radical, H2O 2 increased. The v igo r
index o f seeds afte r 6 days ag ing w as 70% low er than that o f contrast seeds, varied more ev idently than the
germ ina tion ra te and the gem ination index. The changes of GSH , H2O2 , free radical, so luble sugar contents
we re mo re remarkab le than tho se of other physio logica l and biochem ical indexe s, and therew as significan t co r-
re lation be tw een contents o fGSH , H 2O 2 , free radica l, so lub le sugar and w e lsh onion seed vigor. It is reasonab le
to sugge st thatmembrane lipid perox idation may p lay an impo rtant ro le in artificia l ag ing ofw e lsh on ion seed.
Key words:　welsh onion seed;membrane lipid pe rxoidation;artificia l ag ing o f seeds
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研究报告　　李　颜 等:大葱种子人工老化与膜脂过氧化的研究