全 文 ： Journal of Pharmaceutical Analysis药物分析杂志
·974· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(6)
Chinese
超高效液相串联质谱法测定大鼠血浆中胡麻属苷浓度 *
叶其旺 1，王双虎 2，周云芳 2**
（1.庆元县中医院药剂科，丽水 323800；2.丽水市人民医院临床药学实验室，丽水 323000）
摘要　目的：建立超高效液相串联质谱法快速测定大鼠体内胡麻属苷的浓度。方法：用乙腈沉淀蛋白方法
处理血浆，色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2．1 mm，1．7 μm），流动相为乙腈 -0．1%甲酸水，
梯度洗脱，流速为 0．4 mL·min-1；用正离子多离子反应监测（MRM）扫描，内标为芦丁。结果：血浆中胡麻
属苷的线性范围为 1~250 ng·mL-1（r=0．998 6），最低定量限为 0．2 ng·mL-1；胡麻属苷的日内、日间 RSD均
<10%。大鼠单次灌胃胡麻属苷后，胡麻属苷在大鼠体内的 t1/2为（1．35±0．26）h，CL为（8．62±1．25）L·h-1·kg-1，AUC0-t为（349．57±48．5）ng·h·mL-1；大鼠舌下静注胡麻属苷后，胡麻属苷在大鼠体内的 t1/2为
（1．45±0．28）h，CL为（2．38±0．57）L·h-1·kg-1，AUC0-t为（128．79±30．52）ng·h·mL-1，得胡麻属苷的绝
对生物利用度为 26．6%。结论：该方法经方法学验证，适于大鼠血浆中胡麻属苷浓度的测定及其药代动力
学研究。
关键词：胡麻属苷；环烯醚萜苷；独一味；芦丁内标；血药浓度；药代动力学；方法学验证；UPLC-MS
中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2016）06-0974-06
doi：10．16155/j．0254-1793．2016．06.05
Content determination of sesamoside in rat plasma by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry*
YE Qi-wang1，WANG Shuang-hu2，ZHOU Yun-fang2**
（1. Department of Pharmacy，Traditional Chinese Medicine Hospital of Qingyuan，Lishui 323800，China；
2. The Laboratory of Clinical Pharmacy，People′s Hospital of Lishui City，Lishui 323000，China）
Abstract Objective：To develop an ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
for the content determination of sesamoside in rat plasma．Methods：Plasmas were precipitated with 200μL
acetonitrile．An ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2．1 mm，1．7 μm）column was used as the stationary phase．The mobile phase was consisted of acetonitrile and 0．1% formic acid water with gradient elution at a
flow rate of 0．4 mL·min-1．The analytes were detected with positive electrospray ionization in multiple reaction
monitoring（MRM）mode and rutin was used as internal standard．Results：Excellent linear calibration curve
of sesamoside was obtained in the concentration range of 1-250 ng·mL-1（r=0．998 6）．The lowesr limit of
quantification was 0．2 ng·mL-1．t1/2 of sesamoside in rats was（1．35±0．26）h，CL of sesamoside in rats was
（8．62±1．25）L·h-1·kg-1，AUC0-t of sesamoside in rats was（349．57±48．5）ng·h·mL-1 following intragastric
　　*　 2014年浙江省人口计划生育科研项目（编号：2014KYB367）
　　**　 通信作者　Tel：（0578）2780158；E-mail：zyf2808@126.com
　　　　第一作者　Tel：（0578）2780158；E-mail：yqw609675771@163.com
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administration of sesamoside；t1/2 of sesamoside in rats was（1．45±0．28）h，CL of sesamoside in rats was
（2．38±0．57）L·h-1·kg-1，AUC0-t of sesamoside in rats was（128．79±30．52）ng·h·mL-1 following sublingual intravenous administration of sesamoside，whose absolute bioavailabilityrate was 26．6%．The intra
and inter day relative standard deviations of sesamoside were all below 10%．Conclusion：The established
method is proved by methodology validation that it is suitable for pharmacokinetics study of sesamoside in rats．
Keywords：sesamoside；iridoid glycoside；Lamiophlomis rotata（Benth．）Kudo；rutin internal standard；
plasma concentration；pharmacokinetics；method validation；UPLC-MS
独一味为唇形科独一味 Lamiophlomis rotata
（Benth.）Kudo的干燥地上部分，其根及全草入药，是
我国藏、蒙、纳西等民族民间常用药之一，具有消炎
止痛、活血化淤之功效，可用于治疗多种外科手术后
的刀口疼痛、出血和外伤骨折等［1］。中国药典 2010
年版一部收载以山栀苷甲酯和 8-O-乙酰山栀苷甲
酯、黄酮和苯乙醇苷为代表的环烯醚萜苷是独一味
中的主要化学成分。黄酮、苯乙醇苷和 8-O-乙酰山
栀苷甲酯为代表的环烯醚萜苷是独一味中的主要化
学成分［2］。独一味根中 4种环烯醚萜苷—胡麻属苷
（结构式见图 1）、山栀苷甲酯、7，8-去氢钓钟柳苷和
8-O-乙酰山栀苷甲酯研究较多［3］，现代药理学研究
表明，环烯醚萜苷具有明显的止血镇痛作用［4-5］。文
献报道关于胡麻属苷含量的检测方法有很多，主要是
HPLC法［6-10］。通过查询 web of science和中国知网
等权威数据库，尚未找到关于胡麻属苷的药代动力学
的研究，本研究旨在建立快速、稳定的大鼠体内胡麻
属苷浓度测定方法及其药代动力学研究。
A.胡麻属苷（sesamoside）　B.芦丁（rutin）
图 1　胡麻属苷和芦丁结构式
Fig．1　Chemical structures of sesamoside and rutin
1　仪器与试药
1.1　仪器　ACQUITY I-Class超高效液相色谱仪、
Masslynx 4.1色谱工作站和 XEVO TQD三重四极
杆质谱仪（美国Waters公司）；Milli-Q纯水机（美
国 Millipore公司）；5804R低温高速离心机（德国
Eppendorf公司）；XS105DU电子天平（瑞士梅特勒托
利多公司）；TE4101-L电子天平（北京赛多利斯仪器
系统有限公司）；HH-S2水浴锅（北京诺基公司）。
1.2　试药　对照品胡麻属苷及芦丁纯度 99%，批号
分别为 MUST-15030514和 MUST-15010707，成都曼
斯特公司；HPLC级甲醇、乙腈，美国 Merck Chemicals
公司；其余常规化学试剂均为分析纯或优级纯，北京
化学试剂公司。
1.3　动物　清洁级 SD大鼠，体重为（300±20）g，
由温州医科大学实验动物中心提供，动物合格证
号 SCXK（沪）2012-0002，实验动物使用许可证号
SYXK（浙）2010-0150。标准喂养：每日早晚各喂 1
次大鼠饲料，水随意饮用，1周后进行给药实验。实
验前未使用过其他药物，禁食 12 h。
2　方法
2.1　色谱条件　采用 ACQUITY UPLC BEH C18（50
mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，以乙腈 -0.1%甲酸
水为流动相，梯度洗脱（初始浓度为 20%的乙腈，在
1.5 min内逐步增加至 60%；再在 0.5 min内快速将乙
腈浓度增加至 95%，维持 0.5 min；最后在 0.1 min内
变回初始浓度），流速 0.4 mL·min-1，柱温 40 ℃，进样
量 2 μL，内标为芦丁。
2.2　质谱条件　离子源为电喷雾 ESI源，正离子检
测模式扫描，扫描范围 m/z 100~1 500。毛细管电压
1.0 kV，胡麻属苷和内标芦丁的锥孔电压分别为 36
和 40 V，源温度 150 ℃，脱溶剂气温度 500 ℃，锥孔
气流量 50 L·h-1，脱溶剂气流量 1 000 L·h-1，氩气流
量 0.15 mL·min-1。用于定量分析的离子反应为 m/z
443.01→ 281.05（胡麻属苷）和 m/z 611.15→ 303.07
（芦丁，内标）。
2.3　对照品储备液与内标溶液的配制　分别精密称
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取胡麻属苷对照品 10.02 mg，置于 10 mL量瓶中，加
0.5 mL甲醇溶解，并以甲醇和 Milli-Q水（1∶ 1）稀
释至刻度，即得质量浓度为 1 mg·mL-1的对照品储备
液；精密称取芦丁对照品 5.01 mg，置于 100 mL量瓶
中，用甲醇溶解并稀释至质量浓度为 50 ng·μL-1的
内标溶液。
2.4　血浆样本的处理　取血浆样品 100 μL，加入内
标溶液（50 ng·μL-1）20 μL，再加入冰乙腈 200 μL
沉淀并涡旋 2 min，在 4 ℃下 13 000 r·min-1离心 10
min，转移上清液至新的 1.5 mL EP管中并取 2 μL上
样检测。
3　结果
3.1　方法专属性　分别取大鼠空白血浆，空白血浆
加胡麻属苷和内标的对照品，以及大鼠给药 1 h后的
血浆样品，按照“2.4”项方法操作。胡麻属苷的保留
时间为 0.71 min，内标芦丁的保留时间为 1.09 min，组
分之间分离良好并在相应的离子通道中，不受血浆中
内源性物质干扰，见图 2。
A.芦丁（rutin）　B.胡麻属苷（sesamoside）　C.总离子流图（TIC）
1.空白血浆（blank plasma）　2.空白血浆加 50 ng·mL-1胡麻属苷和内标（blank plasma spiked with sesamoside and IS）　3.灌胃给药 3 mg·kg-1的 1 h
后的血浆样本（a plasma sample collected at 1 h after a single dose of 3 mg·kg-1 sesamoside via intragastric administration）
图 2　血浆中胡麻属苷的代表性色谱图
Fig．2　Typical chromatograms of sesamoside in rat plasma
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3.2　标准曲线和定量下限　分别精密吸取上述对照
品储备液于 8个 100 mL量瓶中，用甲醇和 Milli-Q
水（1∶ 1）定容，配成质量浓度为 10、25、50、100、
250、500、1 000和 2 500 ng·mL-1的系列对照品溶液，
取空白血浆 100μL，加入上述对照溶液 10 μL，涡旋
混匀，配成质量浓度为 1、2.5、5、10、25、50、100和
250 ng·mL-1的系列标准血浆样品，按“2.4”项方法
操作，记录峰面积。以胡麻属苷的峰面积与内标峰面
积的比值（Y）为纵坐标，血药浓度（X）为横坐标，用
最小二乘法进行线性回归。定量下限（LLOQ）要满
足信噪比（S/N）>10，得出胡麻属苷的定量下限的标
准血浆样品并经过“血浆样本处理”进行进样测定。
回归方程：
Y=3.895×10-5X-2.806×10-5　r= 0.998 6
胡麻属苷质量浓度在 1~250 ng·mL-1范围内线
性关系良好，最低定量限为 0.2 ng·mL-1。
3.3　精密度、准确度和提取回收率　取质量浓度为 2、
25和 250 ng·mL-1的标准血浆样品，按“2.4”项方法
操作，并分别在 1 d内和连续 3 d内进样测定（n=6），
计算相对回收率、日内精密度和日间精密度；胡麻属
苷的日内和日间精密度 RSD均 <7.3%，见表 1。同上
取质量浓度为 2、25和 250 ng·mL-1的标准血浆样品，
按“2.4”项方法操作，记录峰面积 A1；另取空白血浆，
按“2.4”项方法操作，并在上清液中加入对照品溶液
和内标溶液，浓度和上述一样，进样分析得峰面积 A2，
按 A1/A2×100%计算提取回收率，结果见表 1。
表 1　血浆中胡麻属苷的精密度和提取回收率（n=6）
Tab. 1　Precision and recovery of sesamoside in rat plasma
浓度（concentration）/
（ng·mL-1）
日内（intra-day） 日间（inter-day） 相对回收率
（relative recovery）
/%
绝对回收率
（absolute recovery）
/%
均值
（mean）/（ng·mL-1）
RSD
/%
均值
（mean）/（ng·mL-1）
RSD
/%
2 2.06±0.15 7.3 2.08±0.11 5.4 103.1±7.5 83.2±4.5
25 24.79±1.63 6.6 24.62±1.08 4.4 99.2±6.5 82.9±4.3
250 244.32±17.57 7.2 240.2±9.79 4.1 97.7±7.0 82.2±2.9
3.4　基质效应　经处理后的空白基质中分别添加
至质量浓度为 2、25和 250 ng·mL-1的标准血浆
样品和相同质量浓度对照品溶液，并按“2.4”项方
法操作，其中空白基质中待测物的峰面积 A2和相
应对照品的峰面积 A3比较求算胡麻属苷的基质效
应，即基质效应 =A2/A3×100%。结果表明，低、中、
高浓度的胡麻属苷的基质效应为（101.7±3.6）%、
（95.5±5.4）%和（94.0±5.3）%，内标芦丁的基质效
应为（93.3±6.2）%，均符合生物样品测定要求。
3.5　稳定性考察　取低、中、高浓度（2、25和 250 ng·
mL-1）的标准血浆样品，按“2.4”项方法操作，并分别
于 0、2、4、8、12和 24 h进样测定；将 3种浓度的标
准血浆样品置于 -80 ℃冰箱中保存，分别于第 1、5、
15和 30天结束后解冻，依法测定；经过 3次反复冻
融，每次间隔 12 h，依法测定。上述条件下，高、中、低
浓度的 RSD均小于 10.0%，表明标准血浆样品中胡
麻属苷在 24 h内稳定和 -80 ℃条件下稳定至少 1个
月。
3.6　大鼠体内药代动力学考察　准备 SD大鼠 6
只，体重（300±20）g，实验采用单次灌胃和舌下静
脉给药方式，灌胃组和舌下静脉组给药剂量分别为
3 mg·kg-1和 0.3 mg·kg-1。给药前（空白）和给药后
0、0.033、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和 12 h，由 大
鼠尾静脉取血 300 μL，置于肝素化的 EP管中，4 000
r·min-1离心 10 min，取血浆于 -20 ℃冷冻保存。为
了保证大鼠血流量充足，2 h后大鼠可以自由饮水。
灌胃和舌下静脉给药后，胡麻属苷的血药浓度数据
采用 DAS 3.0软件进行分析，相关药代动力学参数见
表 2，平均药时曲线见图 3。绝对生物利用度公式为
F=AUCig·Div/AUCiv·Dig×100%（D为用药剂量），得胡
麻属苷的绝对生物利用度为 26.6%
4　讨论
独一味主要生长于西藏、青海、云南、四川、甘肃
等高寒地区，为我国藏族、蒙古族和纳西族等民间常
用草药，最早收载于藏族医药学巨著《四部医典》及
《晶珠本草》，距今已有 1 200年历史［11］。目前关于
独一味胶囊中胡麻属苷含量的测定文献较多，但是无
胡麻属苷的药代动力学文献，本实验从大鼠血浆中胡
麻属苷浓度检测出发，研究胡麻属苷在大鼠体内的药
代动力学特征。
4.1　样本预处理方法的选择　血浆样本预处理方法
有固相萃取、液液提取和沉淀蛋白等。固相萃取的方
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表 2　胡麻属苷在大鼠体内的主要药代动力学参数
（mean±SD，n=6）
Tab. 2　Pharmacokinetics parameters of sesamoside in rat plasma
参数（parameter）
灌胃
（intragastric
administration）
舌下静注
（sublingual vein）
t1/2/h 1.35±0.26 1.45±0.28
CL/（L·h-1·kg-1） 8.62±1.25 2.38±0.57
Cmax/（ng·mL-1） 112.4±22.66 85.48±17.82
AUC（0-t）/（ng·h·mL-1） 349.57±48.5　 128.79±30.52
AUC（0-∞）/（ng·h·mL-1） 352.39±49.13 132.38±30.93
R_AUC（t/∞）/% 99.2±0.38 97.23±1.43
MRT（0-t）/h 2.85±0.23 1.48±0.38
MRT（0-∞）/h 2.92±0.23 1.79±0.27
Vd/（L·kg-1） 17.02±5.36 5.56±1.6
图 3　大鼠单次灌胃 3 mg·kg-1和舌下静脉给药 0．3 mg·kg-1后胡麻
属苷的平均血药浓度 -时间曲线（均值±SD，n=6）
Fig．3　Mean plasma concentration-time profiles of sesamoside in rats
following intragastric administration of 3 mg·kg-1 sesamoside and
sublingual intravenous administration of 0．3 mg·kg-1（mean±SD，
n=6）
法步骤较为复杂，不能达到快速测定的目的；液液萃
取的方法对于萃取剂的选择性较大，并且萃取的回
收率较低。本实验采用了沉淀蛋白的方法，先后比
较了高氯酸、甲醇和乙腈沉淀蛋白，由于高氯酸酸性
较强，对质谱影响较大，甲醇沉淀在质谱中容易出现
溶剂峰影响出峰时间，而乙腈沉淀就不会出现上述
问题［11］。
4.2　流动相的选择　本实验在开发过程中先后对
流动相的选择进行了比较，先后考察了甲醇和乙腈
作为有机溶剂，从胡麻属苷响应值比较得出乙腈比
甲醇具有更高的响应值。水相部分先后考察了水及
0.1%、0.2%、0.3%和 0.5%甲酸水溶液，从胡麻属苷
响应值比较得出 0.1%甲酸水溶液作为水相具有较
高的响应值和较好的峰形，胡麻属苷的最低定量限
为 0.5 ng·mL-1，比文献报道值［6-7，11］更低，分离度也
较好。
4.3　内标的选择　因为芦丁的结构与胡麻属苷相
似，均具有多个羟基并且在样品处理过程中具有良好
的回收率，且芦丁与胡麻属苷都是正离子检测模式并
且两者之间具有良好的分离度，因此本文选择芦丁作
为内标。
4.4　药动学特点　药代动力学参数显示，胡麻属苷
在大鼠体内的分布和消除半衰期较短，在体内的平均
滞留时间较短，最长为 3.14 h，说明胡麻属苷容易从
血液分布入组织。运用 SPSS 16.0软件对胡麻属苷
的药代动力学参数消除半衰期（t1/2）和清除率（CL）
以及剂量校正后的 AUC进行独立样本 t检验，结果
显示 t1/2中灌胃给药和舌下静脉给药无统计学差异，CL和表观分布容积（Vd）中灌胃给药和舌下静脉给
药有显著统计学差异（p<0.01）；胡麻属苷的绝对生
物利用度为 26.6%，胡麻属苷在大鼠体内呈现特征性
的二室动力学特征。
本实验最大的优点是采用超高效液相串联三重
四极杆质谱法检测大鼠血浆中胡麻属苷浓度，色谱峰
单一好，采用 ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）检测 1个样本仅需要 3 min。本实
验从大鼠血浆中胡麻属苷浓度检测出发研究胡麻属
苷在大鼠体内的药代动力学特征，方法操作简便、快
捷，灵敏度高，适于大鼠体内胡麻属苷的药代动力学
研究。
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（本文于 2015年 7月 10日收到）