全 文 ：胡伟毅，邵套喜． matK序列作为 DNA条形码在苍耳属中的应用［J］． 杂草科学，2013，31(4):13 － 16．
matK序列作为 DNA条形码在苍耳属中的应用
胡伟毅1，邵套喜2
(1．连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;2．江苏省赣榆县塔山镇农业技术服务中心，江苏连云港 222123)
摘要:以 matK序列作为 DNA条形码，对从国外截获的 7种苍耳属植物进行物种区分鉴定研究，采用 DNeasy
Plant Mini Kit试剂盒进行总 DNA的提取，应用通用引物对其 matK 基因进行扩增，测序得到 7 种苍耳属植物的
matK序列，利用 MEGA 5． 1 软件对这 7 种苍耳属植物的 matK 序列进行比对和分析并构建系统树，结果显示:
matK序列能从基因位点层面对苍耳属植物进行区分鉴定。
关键词:matK序列;DNA条形码;苍耳属
中图分类号:S41 － 30 文献标志码:A 文章编号:1003 － 935X(2013)04 － 0013 － 04
The application of matK sequence as DNA barcode in Xanthium
HU Wei-yi1，SHAO Tao-xi2
(1． Lianyungang Entry － Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang 222042，China;
2． Ganyu Tashan Agricultural Technology Service Center，Ganyu222042，China)
Abstract:MatK sequence was used as DNA barcode to distinguish and indentify seven plant species in the genus Xanthi-
um of foreign origin． DNeasy Plant Mini Kit was used to extract the total DNA． A universal primer was used to amplify
matK genes for sequencing． The matK sequences of the seven Xanthium species were contrasted and analyzed by MEGA
5． 1 software，and a phylogenetic tree was constructed． The matK sequences were able to distinguish and indentify Xanthi-
um plants at the gene level．
Key words:matK sequence;DNA barcode;Xanthium
收稿日期:2013 － 09 － 13
基金项目:江苏出入境检验检疫局科技项目(编号:2012KJ54)。
作者简介:胡伟毅(1984—)，男，硕士，主要从事港口外来有害生物
截获工作。E － mail:94087540@ qq． com。
苍耳属(Xanthium)植物为农田中的主要杂草，
且可黏附于动物毛皮上，从而降低毛皮的品质，影响
动物的健康，因此在 2006 年发布的农业部与国家质
量监督检验检疫总局共同制定的《中华人民共和国
进境植物检疫性有害生物名录》中，将所有的苍耳
属(非中国种)植物都列为检疫性有害生物，防止其
进入我国，危害我国农业生态安全。近年来，随着我
国检验检疫鉴定技术的提高，许多苍耳属(非中国
种)植物都被鉴定到种，但是苍耳属植物的形态鉴
定手段对实验室鉴定经验有着较高的要求，而且苍
耳属的果实在粮谷的长期运输中难免会受到磨损，
因此检验检疫工作的一线工作人员有必要寻求新技
术、新方法的支持。
植物 DNA条形码技术是针对植物基因组中的
特定基因进行片段扩增、测序并发现其碱基变化规
律的技术手段，其概念由加拿大科学家 Paul Hebert
于 2003 年正式提出［1］，该技术在动物的 COI 基因
中应用较为成熟［2 － 4］，但由于 COI 基因在植物中变
化保守，不能起到很好的区分作用，使得植物 DNA条
形码技术的研究重点仍在通用基因片段的应用、筛
选、搭配上［5］。尽管如此，植物 DNA条形码技术仍在
保护濒危物种、药品食品监督、中草药资源鉴定及生
态学调查等诸多领域中起到了突破性的作用，发挥了
以前形态学研究所无法产生的威力［6 － 8］。matK序列
是编码成熟酶K蛋白的基因，是国际生物条形码联盟
(CBOL)推荐的植物 DNA条形码核心序列［9］。本试
验以 2012年连云港口岸截获的 7 种苍耳属植物为研
—31—杂草科学 2013 年第 31 卷第 4 期
究对象，探讨其 matK序列变化规律。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
7 种苍耳属植物:北美苍耳(Xanthium chinese)、
苍耳(Xanthium sibiricum)、刺苍耳(Xanthium spino-
sum)、西方苍耳(Xanthium occidentale)、巴西苍耳
(Xanthium brasilicum)、美丽苍耳(Xanthium specio-
sum)、宾州苍耳(Xanthium pensylvanicum)。以上外
来苍耳均为 2012 年在进口大豆中截获，并由中国检
验检疫科学院鉴定的样本;DNeasy  Plant Mini
Kit、2 × Taq master mix、琼脂糖、Golden View Ⅰ(GV
Ⅰ)等试剂耗材。
matK引物［10］:matKf:5 － CGATCTATTCATTCA
ATATTTC－3;matKr:5 － TCTAGCACACGAAAGTC
GAAGT－3。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 DNA 的提取 采用 DNeasy  Plant Mini
Kit试剂盒法提取 DNA，按照说明书逐步操作，可得
到 200 μL DNA样品，－ 20 ℃冰箱保存。
1． 2． 2 PCＲ反应体系 PCＲ 反应使用中美泰和公
司 2 × Taq master mix 进行扩增，反应采用 25μL 体
系:DNA 模板，3μL;引物 1，1μL;引物 2，1μL;2 ×
Taq master mix，12． 5 μL;ddH2O，7． 5μL。
1． 2． 3 PCＲ 扩增反应条件 95 ℃，4 min;94 ℃、
45 s，52 ℃、1． 5 min，72 ℃、1． 5 min，35 个循环;
72 ℃、10 min;4 ℃保存。
1． 2． 4 琼脂糖凝胶置备 称取 1． 5 g 琼脂糖 G －
10 于锥形瓶中，分别加入 100 mL ddH2O、2 mL 50 ×
TAE buffer，高火微波 4 min，将锥形瓶置于 75 ℃水
浴中 5 min;再加入 10 μL GV Ⅰ，摇匀后静置
10 min，倒入凝胶模具中，放置 30 min 后使用。
1． 2． 5 电泳 取 4 μL PCＲ 产物点样电泳，100 V，
45 min。将凝胶放入凝胶成像系统拍照，得到电泳
结果图(图 1)。与 Marker 对比可知，改扩增产物大
小接近 750 bp，符合预期。
1． 2． 6 测序及拼接 将 PCＲ产物送往中美泰和生
物技术(北京)有限公司进行双向测序，将测序结果
用CodenCode Aligner软件对其剪切和拼接，得到完
整序列。
2 结果分析
2． 1 BLAST检测
登陆 NCBI，将拼接后的序列进行 BLAST 检测，
证明 7 种苍耳属植物的 matK序列扩增及测序成功。
2． 2 ClustalW校对
利用 MEGA5． 1 软件［11］对 7 种苍耳属植物进行
ClustalW校对，校对后的序列继续用 MEGA5． 1 进行
分子进化遗传分析。
2． 3 碱基构成分析
从表 1 可以看出，苍耳属植物 matK 序列的 T、
A、G、C 碱基的变化范围依次减小，分别为 8． 6%、
7. 9%、1． 5%、0． 3%。其中 T 碱基含量最高的是刺
苍耳，为 37． 8%，最低的是西方苍耳，为 29． 2%;A
碱基含量最高的是西方苍耳，为 37． 2%，最低的是
为巴西苍耳、北美苍耳，均为 29． 3%;G 碱基含量最
高的是苍耳，为 17． 5%，最低的是宾州苍耳，为
16. 0%;C碱基含量最高的是宾州苍耳，为 16． 9%，
最低的是西方苍耳、苍耳，均为 16． 6%。
2． 4 基因位点分析
由 MEGA5． 1 测算可知，苍耳属植物 matK 序列
共有 927 个位点，其中保守位点有 422 个、变异位点
505 个，变异位点中单突变位点有 19 个(表 2)。
2． 5 遗传距离分析
利用 MEGA5． 1 软件，采用 Tajima － Nei 模型计
算遗传距离，得到表 3，可以看出，苍耳属植物 matK
序列的遗传距离最高值为 2． 553 3，为苍耳与美丽苍
耳的遗传距离;最小值为 0． 000 0，为巴西苍耳与北
美苍耳的距离。这说明虽然巴西苍耳与北美苍耳单
从序列上看，于 33、904、916 位点存在有位点的插入
缺失差异，但在 Tajima － Nei 模型中被忽略不计，所
从遗传距离上无法区分。
2． 6 系统进化发育树
利用 MEGA5． 1 软件，采用 Neighbor － Joining方
法构建系统发育树(图2)，可以看出:苍耳、西方苍
—41— 杂草科学 2013 年第 31 卷第 4 期
表 1 苍耳属植物 matK序列碱基构成
Table 1 The matK sequence base composition of Xanthium plants
中文名 拉丁名
碱基构成(%)
T C A G
碱基总数
(个)
宾州苍耳 Xanthium pensylvanicum 37． 7 16． 9 29． 5 16． 0 902． 0
美丽苍耳 Xanthium speciosum 37． 6 16． 8 29． 4 16． 2 905． 0
巴西苍耳 Xanthium brasilicum 37． 7 16． 8 29． 3 16． 2 907． 0
西方苍耳 Xanthium occidentale 29． 2 16． 6 37． 2 17． 0 898． 0
刺苍耳 Xanthium spinosum 37． 8 16． 7 29． 4 16． 1 908． 0
苍耳 Xanthium sibiricum 29． 4 16． 6 36． 6 17． 5 899． 0
北美苍耳 Xanthium chinese 37． 7 16． 8 29． 3 16． 2 905． 0
平均 35． 3 16． 7 31． 5 16． 5 903． 4
表 2 苍耳属植物 matK序列单突变位点
Table 2 The matK sequence single mutations of Xanthium plants
中文名 拉丁名
位点位置
2 4 6 7 11 13 23 245 265 297 301 536 641 881 921 924 925 926 927
宾州苍耳 Xanthium pensylvanicum C T T T G G T A A C C T G T T T C C G
美丽苍耳 Xanthium speciosum C T T T G G C A A C C T G T T T T C G
巴西苍耳 Xanthium brasilicum C T T T G G T A A C C T G T T T T C G
西方苍耳 Xanthium occidentale C A A C A G T A A A C A A A A T G T G
刺苍耳 Xanthium spinosum C T T T G G T A A C C T G T T T T C A
苍耳 Xanthium sibiricum T C C A G A T C G G T G G G T A A A G
北美苍耳 Xanthium chinese C T T T G G T A A C C T G T T T T C G
表 3 苍耳属植物 matK序列遗传距离
Table 3 The matK sequence genetic distance of Xanthium plant
中文名 拉丁名 对应编号
遗传距离
1 2 3 4 5 6 7
宾州苍耳 Xanthium pensylvanicum 1 0． 002 3 0． 001 1 2． 467 5 0． 003 4 2． 530 1 0． 001 1
美丽苍耳 Xanthium speciosum 2 0． 002 3 0． 001 1 2． 489 8 0． 003 4 2． 553 3 0． 001 1
巴西苍耳 Xanthium brasilicum 3 0． 001 1 0． 001 1 2． 469 0 0． 002 3 2． 531 8 0． 000 0
西方苍耳 Xanthium occidentale 4 2． 467 5 2． 489 8 2． 469 0 2． 470 4 0． 019 9 2． 469 0
刺苍耳 Xanthium spinosum 5 0． 003 4 0． 003 4 0． 002 3 2． 470 4 2． 533 1 0． 002 3
苍耳 Xanthium sibiricum 6 2． 530 1 2． 553 3 2． 531 8 0． 019 9 2． 533 1 2． 531 8
北美苍耳 Xanthium chinese 7 0． 001 1 0． 001 1 0． 000 0 2． 469 0 0． 002 3 2． 531 8
耳被分为一支;宾州苍耳被分为一支;巴西苍耳、北
美苍耳、刺苍耳、美丽苍耳被分为一支;对其进行
bootstrap检验，其分组支持率为 100%，说明这 3 支
苍耳属植物在系统进化发育中是相互独立的。巴西
苍耳、北美苍耳、刺苍耳、美丽苍耳这一支又被划分
为不同级别的分支，但是其 bootstrap 检验支持率最
高仅为 47%，说明从植物 matK序列进化层面讲，这
4 种苍耳属植物在苍耳属系统进化发育中的独立性
相对较弱。
—51—胡伟毅等:matK序列作为 DNA条形码在苍耳属中的应用
3 讨论
外来杂草对我国产生了严重危害［12］，对外来杂
草种子的鉴定工作一直以来都是进境粮谷检验检疫
工作的重点。但是由于杂草种子在粮谷的长期运输
中难免会受到磨损，从而不具备鉴定到物种的足够
信息，而进口货物的检验检疫周期又有一定的时间
要求，这就使得外来杂草种子的鉴定工作成为粮谷
检验检疫工作的难点。解决这个问题亟需加强检验
检疫系统与各个科研院所的合作，引进新的科技手
段。本试验就是将 DNA 条形码鉴定手段应用到来
自世界各地的苍耳属植物中，从试验结果来看，
matK序列能从基因位点层面对苍耳属植物进行区
分，但是也存在有以下不足:(1)巴西苍耳与北美苍
耳在 matK序列仅存在基因位点插入缺失的差异;
(2)matK序列对巴西苍耳、北美苍耳、刺苍耳、美丽
苍耳这一系统发育支系的继续分化没有提供较高的
支持值。在植物 DNA条形码的研究中，trnH － psbA、
rbcL、ITS、ITS2 等基因序列也是研究工作的重点，或
许对 matK序列可以起到补充作用［13 － 14］。
参考文献:
［1］Tautz D，Arctander P，Minelli A，et al． A plea for DNA taxonomy
［J］． Trends in Ecology and Evolution，2003，18(2):70 － 74．
［2］郭 锐，张守纯，宋艳珠． 9 种鹤类 DNA条形码的研究［J］． 中国
农学通报，2012，28(14):50 － 55．
［3］姜 帆，刘佳琪，李志红，等． 基于 DNA 条形码的广西苦瓜中实
蝇幼虫分子鉴定研究［J］． 植物保护，2011，37(4):150 － 153．
［4］李鹏飞，朱文斌，贺舟挺，等． 东海带鱼 DNA条形码的建立及 CO
Ⅰ序列变异分析［J］． 浙江海洋学院学报:自然科学版，2013，32
(1):6 － 9．
［5］Chase M W，Salamin N，Wilkinson M，et al． Land plants and DNA
barcodes:short － term and long － term goals［J］． Philosophical
Transactions of the Ｒoyal Society of London． Series B，Biological Sci-
ences，2005，360(1462) :1889 － 1895．
［6］任保青，陈之端． 植物 DNA条形码技术［J］． 植物学报，2010，45
(1):1 － 12．
［7］张 欣，于瑞祥，方晓明，等． 橄榄油掺假检测技术的研究进展
［J］． 中国油脂，2013，38(3):67 － 71．
［8］庞晓慧，宋经元，陈士林． 应用 DNA条形码技术鉴定中药材灯心
草［J］． 中国中药杂志，2012，37(8):1097 － 1099．
［9］Hollingsworth P M，Forrest L L，Spouge J L，et al． A DNA barcode for
land plants［J］． Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America，2009，106(31) :12794 － 12797．
［10］高连明，刘 杰，蔡 杰，等． 关于植物 DNA条形码技术研究规
范［J］． 植物分类与资源学报，2012，34(6):592 － 606．
［11］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al． MEGA5:molecular evolu-
tionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary dis-
tance，and maximum parsimony methods［J］． Molecular Biology and
Evolution，2011，28(10) :2731 － 2739．
［12］强 胜，曹学章． 外来杂草在我国的危害性及其管理对策［J］．
生物多样性，2001，9(2):188 － 195．
［13］刘宇婧，刘 越，黄耀江，等． 植物 DNA条形码技术的发展及应
用［J］． 植物资源与环境学报，2011，20(1):74 － 82，93．
［14］Kress W J，Erickson D L． DNA barcodes:genes，genomics，and
bioinformatics［J］． Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America，2008，105(8) :
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
櫄
殮
殮
殮
殮
2761 － 2762．
百草枯禁用存隐忧
展望 2014 年，业界均对百草枯行情表示看好，并称价格优势有上升空间，但禁用仍是隐忧。
需求为百草枯后市提供支撑。由于 2014 年 7 月 1 日起将撤销百草枯水剂等级和生产许可并停止生产，但目前市场
并未出现能够替代百草枯的高效低价农药，因此市场对百草枯的需求短时间不会下降，需求仍处高位并继续拉高产品价
格，延续行业景气度。
禁用对百草枯也存在风险。政府、协会已经明令指出不会延迟禁用时间，即百草枯退出市场是必然，因此市场必定会
出现能够替代百草枯的产品，后期百草枯需求可能会因此萎缩，但从目前来看，短期出现替代产品不太可能，禁用对百草
枯产业来讲只能称得上隐忧。
成本将继续推动百草枯价格再上涨。受反倾销影响，现在上游吡啶的价格上涨的很快，吡啶国内市场平均价格由 3．
4 万元 /吨上涨至 3． 6 万元 /吨，涨幅达 5． 56%。因此，成本将成为百草枯价格上涨的有力支撑。
龙头企业在此受益最多。尽管市场开工率下降很多，但大厂开工率仍有 8 ～ 9 成，现在国内百草枯产品大多在大厂手
中，未来将以什么价格出售也不清楚，但肯定会高于现在 3 万元 /吨的价格，大企业的利润不会太差。
业内人士分析，2014 年春耕旺季对百草枯是机遇，需求有望刺激百草枯价格继续上涨。 (李大智)
—61— 杂草科学 2013 年第 31 卷第 4 期