全 文 ：收稿日期:2004-03-30
资助项目:国家自然科学基金(30070702)和广东省自然科学基金(020738)资助项目。
作者简介:丘劲(1980-), 男 ,硕士研究生 ,研究方向:变态反应学。
通讯作者:刘志刚(1959-), 男 ,医学博士 ,教授 , 研究方向:免疫学 , 变态反应学。
蒿属花粉抗原对扁桃体
淋巴细胞因子及细胞增殖的影响
丘　劲1 ,刘志刚1 ,刘　明2 ,卢永田3
(1.深圳大学生命科学学院 ,广东 深圳 518060;
2.深圳市第一人民医院耳鼻咽喉科 ,广东 深圳 518020;
3.深圳市红会医院耳鼻咽喉科 ,广东 深圳 518029)
摘要:目的　研究蒿属花粉过敏体质者与非过敏对照者扁桃体淋巴细胞在特异性抗原刺激下细胞因子的动态变
化以及细胞增殖情况。方法　采用淋巴细胞分离液分离扁桃体淋巴细胞 , 1640 培养液进行培养;经蒿属花粉抗原
刺激后 ,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中 IL-4、IL-5、IFN-γ水平 ,MTT测定淋巴细胞增殖情况。结果　蒿属
花粉过敏体质者扁桃体淋巴细胞经特异性抗原刺激后 IL-4、IL-5 水平明显升高 , 而 IFN-γ水平明显降低 , 与非过敏
对照者细胞因子水平相比较有显著差异(P<0.01)。此外 , 过敏体质者淋巴细胞在抗原刺激后细胞增殖明显(P<
0.01),而对照组无显著性变化(P>0.05)。结论　过敏体质者扁桃体的淋巴细胞在蒿属花粉特异性抗原刺激下 ,
Th2 型细胞因子分泌升高 ,而 Th1 型细胞因子分泌下降 , Th1向 Th2 漂移。
关键词:扁桃体;淋巴细胞;蒿属花粉;细胞因子;MTT
中图分类号:R592.12　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-2294(2004)04-0001-03
The Dynamic Changes of Cytokines Produced by
Tonsil Lymphocytes after Stimulated by Artemisia Pollen Antigen
QIU Jin
1 , LIU Zhi-gang1 , LIU Ming2 , LU Yong-tian3
(1.College of Life Sciences , Shenzhen University ,Shenzhen 518060 , China;
2.Department of Otolaryngology , Shenzhen People s Hospital , Shenzhen 518020 , China;
3.Department of Otolaryngology ,Shenzhen Real Cross Hospital , Shenzhen 518020 , China)
ABSTRACT:Objective　To investigate the proliferation and the dynamic changes of cytokines in tonsil lym-
phocytes in Artemisia pollen-atopic people and nonatopic people after stimulated by the specific antigen.Meth-
ods　Tonsil lymphocytes were collected by lymphocytes separation medium and incubated with Artemisia pollen
antigen.The levels of IL-4 , IL-5 , IFN-γwere measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The
proliferation of lymphocytes were detected with MTT method.Results　The levels of IL-4 , IL-5 in tonsil lym-
phocytes in Artemisia pollen-atopic people after stimulated by specific antigen were higher than nonatopic con-
trols ,but the levels of IFN-γwere lower than those in nonatopic controls(P <0.01 , respectively).Obvious pro-
liferation were observed in atopic group after stimulated by the specific antigen(P<0.01),but there were no
significant changes in control group.Conclusion 　The cytokines of Th cell in tonsil lymphocytes from
Artemisia pollen-atopic people after specifically stimulated by Artemisia pollen antigen lost the balance , indi-
cating that Th1 drifts to Th2.
KEYWORDS:tonsil;lymphocyte;artemisia pollen;cytokine;MTT
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　　T 辅助细胞(Th)作为静止 T 细胞激活后的表型
细胞 ,在细胞免疫应答反应中起重要作用 。根据所
分泌细胞因子的不同 ,Th 细胞可分成 Thl和 Th2两
个细胞亚群 。近年来大量研究表明 ,Thl/Th2的平衡
状况与过敏性疾病发生有关[ 1] 。Walker等[ 2]发现过
敏性哮喘病人外周血中 Th1/Th2细胞及相关细胞因
子发生平衡飘移 。于兰等[ 3]报道过敏性鼻炎患者外
周血Th亚群也发生变化 。但目前大多数研究主要
针对外周血单个核细胞(PBMC)的 Th亚群以及 IL-
4 、IL-5 、IFN-γ水平的变化 ,而针对人免疫器官 Th亚
群及相关细胞因子变化的研究国内外尚未见报道 。
本文就蒿属花粉过敏与非过敏个体外周免疫器官扁
桃体的淋巴细胞经特异性过敏原刺激后分泌细胞因
子的变化和细胞增殖情况做了进一步研究 ,现将结
果报告如下。
1　对象与方法
1.1　对象
根据蒿属花粉抗原皮试将 15例扁桃体摘除患
者分为蒿属花粉过敏体质(Atopic)者和非过敏患者 。
(1)过敏体质者(8例):男 5例 ,女 3例 ,年龄 13 ～ 35
岁 ,平均年龄 25.8岁 。蒿属花粉抗原皮试均为阳性
(++)以上 ,同时皮试用组胺和生理盐水作为阳性
和阴性对照 。(2)非过敏患者(7 例):男 3 例 ,女 4
例 ,年龄 17 ～ 26岁 ,平均年龄 23.4岁 。过敏原皮试
均为阴性 。两者性别与年龄相比无显著差异 。扁桃
体组织均系取自单纯扁桃体肿大切除术 ,样本来自
深圳市人民医院 、深圳市红会医院耳鼻咽喉科 。
1.2　实验方法
1)　扁桃体淋巴细胞的分离与培养:取手术切
除后的扁桃体组织 ,浸于 1640培养液(含:青霉素 1
000 U/ml ,链霉素 1 000U/ml)溶液中1 h 。将扁桃体
剪碎 , 100目不锈钢网上研磨过滤 ,加入 1640培养
液 ,用淋巴细胞分离液2 500 rpm离心25 min分离淋
巴细胞 ,台盼蓝计数(活力>95%)。调整细胞浓度
至 2×106 ml[ 4] 。取细胞悬液加入 24 孔培养板 , 1
ml/孔 ,每个样品 3个复孔 。淋巴细胞分为四组:蒿
属花粉过敏体质组(简称单纯过敏组)、抗原刺激过
敏组(过敏组+蒿属花粉抗原)、非过敏对照组 、抗原
刺激非过敏组(非过敏对照组+蒿属花粉抗原)。
2)　蒿属花粉抗原的制备:花开季节在江西南
昌市郊采集蒿属花粉 ,晾干后经 200 目网筛分离纯
花粉 ,蒿属花粉抗原制备参见刘志刚(2003)方法进
行[ 4] 。
3)　酶联免疫吸附试验(ELISA)测定上清液中
IL-4 、IL-5 、IFN-γ水平:采用双抗体夹心 ELISA 法 ,试
剂盒由深圳晶美公司提供 ,按说明书严格操作。在
已包被一抗的酶标板上设标准孔 8孔 ,其中第 8孔
为空白对照。标准孔每孔加样总量为 100μl ,8孔中
标准曲线使用浓度梯度为:1000 、500 、250 、125 、62.5 、
32 、16和 0.0 ng/L。待测品孔中每孔加入待测样品
100 μl。反应终止后用酶标仪(型号:BIO-RAD550 ,
日产)在 450 nm波长处测吸光度(A)值 ,在标准曲线
上查出相对应的细胞因子含量。
4)　MTT 法检测淋巴细胞增殖:将扁桃体分离
稀释好的淋巴细胞悬液加入 96孔培养板中 ,100 μl/
孔 ,3 复孔 。加入蒿属花粉抗原 , 37℃、5%CO2 培养
72 h ,加入20μl ,10 mg/ml MTT液再培养4 h ,小心弃
上清液 ,再加 100 μl 二甲基亚砜混匀 , 15 min 后在
BIO-RAD550酶标仪上读取样品的A570值。
5)　统计学处理:数据用 SPSS10.0软件处理 ,
资料均采用均数±标准差(x ±s),两组间比较用 t
检验 ,以 P<0.05判断结果的显著性。
2　结果
2.1　蒿属花粉抗原刺激后 IL-4 、IL-5 、IFN-γ水平的
比较
四组扁桃体淋巴细胞上清液经 ELISA测定后结
果见表 1。抗原刺激过敏组扁桃体淋巴细胞分泌的
IL-4 、IL-5水平比单纯过敏组和非过敏对照组及抗
原刺激非过敏组要显著升高(P<0.01), IFN-γ水平
比其它 3组要明显降低(P <0.01),而抗原刺激非
过敏组 IL-4 、IL-5 、IFN-γ水平较单纯过敏组及非过
敏对照组相比无显著性差异(P >0.05),说明蒿属
花粉过敏患者免疫器官(扁桃体)淋巴细胞在特异性
抗原刺激下 Th1细胞因子分泌减少 , Th2类细胞因
子产生增多 , 而过敏患者扁桃体淋巴细胞在单纯培
养情况下 ,所分泌的 IL-4 、IL-5与 IFN-r 与对照组无
显著变化(P>0.05)。
表 1　各组扁桃体淋巴细胞分泌 IL-4 、IL-5、IFN-γ水平(pg/
ml)
组别 IL-4 IL-5 IFN-γ
单纯过敏组 13.52±2.11 120.73±17.50 849.70±37.40
抗原刺激过敏组 42.29±4.49＊ 229.45±20.62＊ 358.96±25.74＊
非过敏对照组 12.46±1.83 128.60±21.25 862.35±39.63
抗原刺激非过敏组 15.50±3.13＊＊ 137.02±32.59＊＊ 841.04±32.43＊＊
　　＊与单纯过敏组 、非过敏对照组 、抗原刺激非过敏组相比较 , P<0.01
＊＊与单纯过敏组和非过敏对照组相比较 , P>0.05
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2.2　扁桃体淋巴细胞增殖试验的比较
4组扁桃体淋巴细胞经蒿属花粉抗原刺激后
MTT 法测定细胞增殖 ,结果显示抗原刺激过敏组(0.
4084±0.0139)与单纯过敏组(0.2283±0.009)和非
过敏对照组(0.2280±0.0189)相比较细胞增殖明显
增强(P <0.01),抗原刺激非过敏组(0.2377±0.
0154)与单纯过敏组和非过敏对照组相比较细胞无
明显增殖(附图)。
附图　4组蒿属花粉抗原对扁桃体淋巴细胞增殖的影响
3　讨论
扁桃体作为人体免疫系统的外周淋巴器官 ,富
含大量淋巴细胞 。国内外研究表明 ,扁桃体组织中
B淋巴细胞约占整体扁桃体淋巴细胞的 60%,T 细
胞占 30%, T 细胞中又以 CD4+细胞为主[ 5] 。而
CD4
+Th细胞在被激活后可分化为功能不同的 Th1
和Th2效应细胞 , Th1细胞分泌 IL-2 、IFN-γ,主要介
导细胞免疫应答 , Th2细胞产生 IL-4 、IL-5 、IL-13等
细胞因子 ,介导体液免疫应答 。一般而言 ,根据释放
细胞因子的多少可以反映出 Th 细胞的数量 。在正
常状态下机体Th细胞释放细胞因子的相对量是彼
此约束的 ,Th1和 Th2 细胞处于一种动态平衡状态
之中 。有研究表明过敏性疾病患者或过敏体质者受
到特异性抗原刺激后 Th细胞因子分泌会发生变化 ,
Th1/ Th2比例失衡 ,这说明过敏性疾病与Th细胞的
平衡状态有一定的相关性[ 6] 。
据报道过敏体质者 PBMC 其特异性 Th2免疫应
答显著增高 ,表现为过敏原特异性 Th2细胞因子的
明显升高及Th1/Th2细胞因子比例的下降[ 7] 。本研
究结果显示蒿属花粉过敏体质者扁桃体淋巴细胞在
蒿属花粉特异性抗原刺激下 , IL-4 、IL-5水平比非过
敏对照组要显著升高(P<0.01),而 IFN-γ水平较非
过敏对照组要明显降低(P<0.01)。在过敏原刺激
组中Th1类细胞因子分泌下降 ,Th2类细胞因子产
生增多 ,Th1向 Th2偏移 ,这与抗原再次诱发过敏反
应密切相关。此外 ,过敏组扁桃体淋巴细胞在特异
性抗原刺激下细胞增殖情况较其余组有明显升高
(P<0.01)。这可能由于蒿属花粉过敏体质者扁桃
体淋巴细胞经抗原刺激后特异性 Th2细胞被活化释
放出大量 IL-4 , IL-4不仅促使 T 细胞增殖 ,使 Th0细
胞向 Th2 分化 ,还可使 B细胞发生增殖[ 8 ,9] 。而抗
原刺激非过敏组无明显细胞增殖 ,与非过敏者缺少
特异性淋巴细胞及相关细胞因子有关 ,与 ELISA 结
果相一致 。
目前众多学者通过研究 PBMC来探讨过敏性疾
病患者或过敏体质者细胞因子和 Th1/ Th2 的变化
状态 ,而直接研究人体免疫器官(扁桃体)淋巴细胞
的国内外尚未见报道 。可能是由于 PBMC 容易获
取 ,且含有大量 T 细胞 , 细胞因子水平较易检测。
Gallo等[ 10]报道扁桃体中释放 IL-4 的 CD4+细胞比
例要比 PBMC 中的 CD4+细胞比例高 ,而释放 IFN-γ
的CD4+细胞在扁桃体中的比例与其在 PBMC 的比
例相似;就释放 IL-4 的能力而言 ,扁桃体淋巴细胞
与 PBMC没有显著性区别 ,而且扁桃体中 IL-4 、IL-5
和 IFN-γ的生成要比 PBMC 更为频繁。本研究结果
表明过敏体质者的扁桃体作为外周免疫器官其淋巴
细胞在受特异性抗原刺激后细胞因子动态变化与
PBMC的研究结果相似 ,即 IL-4 、IL-5分泌增加 , IFN-
γ分泌减少 ,提示过敏体质者活化后扁桃体淋巴细
胞中 Th1向 Th2漂移。这可能由于过敏体质者淋巴
小结产生记忆性淋巴细胞 ,参加淋巴细胞再循环 ,当
在体外再次遇到相应的抗原刺激时 ,即再分化为效
应细胞释放细胞因子以及发生细胞增殖。
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(下转第 6页)
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较大 ,且高浓度好 , Ts的影响次要 ,中浓度较好 ,因
此提示以 Tau840 mg/kg 、Ts320 mg/kg为最佳组合 。
3　讨论
对中药丹参的药理学研究已经比较透彻 。丹参
对实验动物及人体多个系统都有影响。丹参的作用
主要有:①减慢心率 ,其作用类似维拉帕米;②一定
地抗心肌缺血和梗死作用 ,该作用与清除自由基和
减轻钙超载 、扩冠和改善外周血液灌流有关;③抗
内 、外凝血系统和促进纤溶作用 ,还可通过提高 2 ,3-
DPG含量和抑制钙调蛋白(CaM)功能稳定红细胞膜
而抗溶血;④提高心脑细胞 ATP 含量等作用发挥其
耐氧作用和减轻脑缺血性损伤;⑤另外还有护肝 、保
护Ⅱ型肺泡上皮细胞作用等[ 1] 。
牛磺酸的作用:①营养心肌 ,抗脂质过氧化 ,稳
定细胞膜免受降解 ,增加心肌肌膜和腺粒体 Na+-
K+-ATP 酶 、镁++-ATP 酶 、钙++-ATP 酶 、减轻钙超
载 、使异常的引起最大钙电流的膜电压正常化;②抗
心率失常;③护肝 、兴奋呼吸作用等[ 2] 。黄南洁等[ 3]
发现牛磺酸能提高小鼠运动能力 ,减轻运动衰竭小
鼠心肌结构的异常改变 ,提高运动小鼠心肌组织的
SOD活力并降低脂质过氧化产物(MDA)的含量 ,对
运动衰竭小鼠心肌有保护作用 。
本实验发现 , Tau+运动衰竭组 、Ts+运动衰竭
组较衰竭组的游泳时间有显著延长(P<0.05),Tau
+运动衰竭组和 Ts+运动衰竭组小鼠血清中 CPK
活力明显低于单独运竭组(P <0.05),说明 Tau 、Ts
均能提高小鼠游泳的能力 ,抗心肌损伤;统计结果还
表明 ,各种浓度的 Tau 、Ts组合对小鼠游泳时间较衰
竭组(不用 Tau 、Ts处理)有非常明显的差异(P<0.
01);各种浓度组合的实验组小鼠的平均游泳时间较
单独用Tau 、Ts有明显差异(P <0.05),说明联合运
用 Tau ,Ts较单独用 Tau或 Ts有更好的心肌保护作
用。高浓度 Tau 与中浓度 Ts 对小鼠的游泳能力影
响最大 ,因此提示以 Tau840 mg/kg 、Ts320 mg/kg 为
最佳组合 。
丹参与牛磺酸已用于临床多年 ,且副作用小 ,丹
参与牛磺酸无配伍禁忌 ,所以笔者主张在造成心肌
损害的疾病治疗中 ,适当加入一定量的丹参和牛磺
酸 ,对心肌有更好的保护 ,甚至修复作用。对于丹参
和牛磺酸对心血管疾病中的运用细节(如用药时间 、
最佳用量等)还待进一步研究 。
参考文献:
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(责任编辑:罗芳)
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(责任编辑:徐亚利)
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