全 文 ：·研究论文 ·
芸墓属作物油酸脱饱和酶基因 (A F五理 )拷贝数和序列变异分析 *
李柱刚 ’ ,2 马荣才 ’ * 曹鸣庆 ’ 崔崇士 2
(l
. 北京农业生物技术研究中心 ,北京 10 00 89 ;2 . 东北农业大学园艺学院 ,哈尔滨 150 30)
摘要 :利用拟南芥 ( A用 b记叩` is 山a加n a )脂肪酸合成途径中的油酸脱饱和酶 ( F A D Z )基因序列的保守区设计 CP R 引物 ,
对芸盆属 (B邸ic a )作物 3 个基本种和 3 个复合种进行了标记 ,并且克隆了白菜 ( B . 几甲月 s sP . p e k in en s is ) 、 甘蓝型油菜 ( .B
n aP us ) 和埃塞俄比亚芥菜 ( B .
~
a 纽 )三种作物的 P c R 产物 ,对 F A D Z基因部分序列进行了分析。 研究结果表明 , 拟南芥和芸
盆属作物基因组中具有 1一 2 个拷贝的 F汽刀口基因 , 所测定的芸墓属 F A石呛基因序列与拟南芥 FA DZ 之间高度同源 , 它们所编
码的氨基酸序列的同源性达 8 .7 %~9 .8 8 % 。 这些序列与其它植物的 F A石咬对应位置的氨基酸序列同源性较低 , 从 50 . 0 % 一
8 .6 0 %
。 研究结果为探讨芸签属作物之间的进化关系提供了一定的分子水平证据 。
关扭词 :芸签属 ;脂肪酸合成 ;油酸脱饱和酶 ; 系统发育关系
S e qu e
n e e an d C o P y Nu m b
e r V iar at i o
n o f O l e at e
D e s a tu r a s e G e n e (以砚 ) In B ar s s i e a S P e e i e s
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一
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一
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, * * C A O M i n g- Q i n g
, C UI C h o n -g Sh i
Z
( 1
.
B e ij i n g A gr o
一
biot e ehn o lo gy R e s e acr h C
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r , B e ij in g 100 08 9
,
Ch in a ; 2
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C o ll e g e o f H o in e u ltU r a 1 S e ie n e e s
,
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,
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,
Ch in a )
人加加以: D e g en e ar et d P C R P ir m e sr d e ir v e d for m ht e e o n s e vr at iv e n cu le o t id e s e qu e n e e s o f o le a t e d e as tIJ 旧巧 e (FA D Z) o f
乃用b油平 515 功 a l万an a w e er 姗 d t o an a l yZ e ht e e op y n um b e r v iar at io n o f F AD Z g e n e am o n g s ix B门 s s ics spe c ie s , an d ht e am P liif e d
FA DZ 罗 n e afr gm e n ts w e er fu d五e r s equ e n e e d a n d a n a ly z e d .
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一
t e n l l in u s o f F A刀反厂n , e er s u lst i n d ie a et d ht at A . 叻 a ial n a an d
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n o a e i d s e q u e n e e id e n it yt w as be wt e e n 88
.
7% 一 98 .
8%
.
A n d ht e B拍 s isC a F A D 2 a m ion ac id s e q u e n e e s d isP la ye d lo we r i d e n t iyt ofr m 50
,
0% t o 86
.
0% w ith t h o se o f o th e r Pla n ts
.
耳盯 , 回山: 习门 s f ca ; af yt ac i d b io s yn ht e s i s ; o le at e d e as ut n场 e ; Ph y lo g e n e t ie re lat io n s h i P
芸墓属作物共有 3 个基本种和 3 个复合种 , 多 加快芸蔓属种间的基因转移 。
年来对它们之间的遗传关系已经从细胞学 、 遗传学 模式植物拟南芥 ( A用 b id( , 5 15 ht al 俪。 )和芸墓
和分子生物学等水平进行了广泛的研究 。早在 20 世 属之间亲缘关系较近 , 根据拟南芥和芸墓属之间的
纪 30 年代 , 日本科学家虞长春等提出了 U ’ 只角来 D N A 序列的高度保守性 ,可以相互了解它们之间共
表示它们的关系 l[] 。 细胞学研究和杂交种分析都证 有的遗传信息 I圳。 在过去的几年中 , 芸墓属植物和
实芸墓属种之间的 U ’ 三角关系 ,但是由于研究精度 拟南芥之间以及芸墓属植物之间的比较基因组学研
的限制 , 一直没有能够充分认识这些基因组之间的 究充分揭示了下列现象卜 , , l : ( l) 芸墓属植物与拟南
关 系 。 正 确 理 解 芸 墓 属 各 个 单染 色 体组 种 芥之间的比较作图确证各个种之间存在着大量的染
( m on og en
o m ic sP ce ise ) 之间的基因组关系不仅有 色体片段重复 、倒位 、易位 、缺失等 。 ( 2) 在各个种之
助于解释芸墓属各个种之间的进化 , 而且将促进和 间存在许多高度共线性的区域 。 ( 3 )芸墓属染色体
* 基金项目 :北京市科委科技合同项目 ( N o . 95 4 10 90 0 )资助 。
李柱刚 : 现在工作单位 , 上海交通大学生物医学博士后流动站 。 E一 am :il l<汕 u gan g@ ho tln ial . co m > .
二 通讯作者。 A u th o r of r e o能 s即n d en e e . E一m a i l: < m aor n邵 ia @ b a fs . ne t . e n > .
收稿日期 : 20 3 一 1 一 10 接受日期: 20 3一 12 一24
农 业 生 物 技 术 学 报 0 204年
重排的速率远远大于其它物种的染色体重排速率 。
(4 )染色体片段的重排是芸墓属基因组进化的主要
原因。 (5 )在二倍体芸签属物种中 ,拟南芥即 L P探
针检测到 2 % ~ 35%的位点重复 3 次 ,说明拟南芥或
者另一相关物种基因组的多倍化是芸墓属基因组形
成的基本原因 。近几年来 ,随着拟南芥基因组序列分
析的发展 , 又开展了芸墓属和拟南芥之间更精细范
围内的基因结构和功能的比较研究lr[ 闹 。
本实验根据 G e血Ban k 中拟南芥脂肪酸代谢途
径基因 F冷工咬序列 ,参照 B~ l等
团的实验方法 ,依
其外显子的保守区设计简并引物 , 然后以芸墓属植
物基因组 D N A 为模板扩增其同源基因片段 , 对芸
茱属 3 个基本种和 3 个复合种中控制脂肪酸代谢的
F A刀2 基因进行分子标记和序列变异分析 。
1 材料和方法
,
.
, 实验材料
如 表 1 所 示 。 在 本 实 验 中 以 拟 南芥
(A拍 ib dop s括功 a l俪。 )哥伦比亚生态型 ( c ol . )作为
对照 ,植物材料均种植于温室内 。 种子用纱布包好 ,
70%酒精漂洗 30 5 ,然后用无菌水冲洗 2一3 次 ,再用
.2 5%次抓酸钠消毒 7 m in ,无菌水洗 3 次 。 将处理后
的种子接种到灭菌的 M S 培养基中培养 , 待长到
-4 5 片真叶时提取 D N A o
1
.
2 植物 O NA 提取
采用 C T BA 方法 lN[ 。
,
.
3 FA DZ 基因片段的体外扩增和检测
1
.
.3 1 引物设计 根据 G e h B a kn 中拟南芥 FA D Z
基因外显子的保守区 , 依其编码的氨基酸序列设计
简 并 引 物 , 利 用 D N A s姗 (L A s EGR EN’E
S O FTW A R五 , D N A STAR nI .c ) 软件辅助设计
, 引物
由上海生工生物工程公司合成 。
引物序列为: s ,一e G A C T A e e ^ ^ TG co T N G A Y G左 3 , ;
5
,一
C T T C C C T G T CC G G T I
,
C A N C R T
一
3
, 。
简并引物字母 N ( A G C T ) 、 Y ( C T ) 、 R ( A G )代
表碱基 。 所扩增的 尸冷刀2 片段对应于拟南芥 F A石咬
( eG nB
a nk A e e
.
N o
.
NM
一
1 12 04 7
, 全长 38 3a ) 的 C -
端编码区 (长度 2 12 a ) 。
1
.
3
.
2 Pe R 反应体系 0 . 2 mrn o比 dN T p , 1
.
5
un
o比
M gC I
、
aT q D N A 聚合酶 1 . S U , D N A S小 l o gn ,反应
总体积为 50 卜L 。 94 ,C下 5 m i n 变性后 ,按照 94 ℃ l
m l n
,
5 2 ℃ 1 m in , 7 2 ℃ Zm in 循环条件 , 共计进行 35
个循环 。 72 ℃延伸 5 m in , 4 ℃保存 。
1
.
.3 3 P C R 产物凝胶电泳 P C R 产物分别在 1%琼
月剖疮凝胶和 s od/ 卜变性聚丙烯酞胺凝胶中电泳检测 。
,
.
.3 4 第二轮 PC R 扩增体系 在聚丙烯酞胺凝胶
电泳分析后 , 在紫外灯下用微量移液器吸头挑取目
的 D N A 条带 , 将 D N A 转移人装有 20 林L Hp 的
衰 1本实脸中所使用的拟南芥和芸 , . 植物材料
T ab l
e I A拍玩 dop s招比 a l万an a an d B ar岛允 a s户父 i e s sue d in ht is e xP e ir m e n t
学名 墓因型 种或品种名称 编号
cS i即 d反
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B
. 口脚 SP .娜恤即 幻` A A ( Zn = Z x = 20) 佳白二号大白菜 BJ
hC in se ca b b ag
e j ia
一
b a i N o
.
2
B
.
, 脚 SP . ch in~
A人 (2 n二 x2 = 20 ) 矮脚黄白菜型油菜 A w
Y u b ia咖 pak ch io 川 · iJ ao 一 Haun g
B
.
, 脚 s sP . 呷万企 . 人 A (2下 x2 = 20 ) 欧洲芜普
T
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i P W J
B
. 。 姆几 B以 Z n心 x = 16) 尤嫩斯黑芥 HJ
B l鱿 k m su 扭闭 Y o un u n s i
B
. 。七门` “ C q Z护 x2 = 18) 中甘十一甘蓝 . zG
C ab b
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.
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日 . j un二 八人丑 B ( Zn科 x = 3 6 ) 抱子芥 a Z
B n叹吸奸卜 m喊一月玄研川
B
.
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sp su A A C C ( Z n叫 x = 3 5 ) 甘蓝型油菜 G x
以 ls e de ar pe
B
.
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. B B C C ( Z
n
=4 护 34 ) 埃塞俄比亚芥 AJ
E ht lioP an
~
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A口 b油护 5 15 比 aI 初口 a Z , 10 哥伦比亚生态型 RA
C o
un
o n
m
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se -aer
e r e s s C o l um bi
a ce o t习姆
第 5期 李柱刚等 :芸! 属作物油酸脱饱和酶基因 ( A F刃呀 )拷贝数和序列变异分析
P CR反应管中 , 进行 P C R 重扩增 。 PC R反应体系为 :
.0 2
~ 比
d N T P
,
1
.
5
~
。比 M gC 12 , aT q D N A 聚
合酶 1 . 5 u , ND A 5-0 l o gn
, 反应总体积为 50 林L 。
P C R 循环条件为 : 94 ℃ 4 m in , 循环中 94 ℃ 1 m in ,
52 ℃ 45 5 , 72 ℃ 1 m l n , 共计 30 个循环 。 72 ℃延伸
4 m in
,
4 oC保存 。
1
.
4 以2D 基因片段的克隆
本 实验用 第 2 轮 CP R 产 物直接 与 p U m
T
一
ve
c ot : (上海生工公司) 连接 , 克隆 P CR 产物 ,采用
CP R 反应分析阳性克隆 。
,
.
5 FA DZ 墓因片段的测序
以阳性克隆质粒 D N A为模板 , 在本实验室的
B Ec KM A N
一
C OU L T E R 公司 C EQ侧 80 0xL 测序仪
上进行测序 。
1
.
6 S o u th e m 杂交
使用 oR hc e 公司的地高辛标记和检测试剂盒
( D IG D N A 肠 be lign 众 , C at . N o . 1 17 5033 和 D IG
L uj m in e sc e in D e t e ct ion 幻 t fo r N u e l ie c A e ids , C at . N o .
136 35 14 )
, 以拟南芥 F冷D Z 基因片段为探针进行
S o u ht e m 杂交和检测 1M[ 。
1
.
7 序列同源性比较和系统发育树的构建
将 测 定 的 D N A 序 列 在 eG nB a kn 中 进 行
B LA S T
x 搜索后 , 用 D N A M A N 软件进行氨基酸序
列 比 对 。 采 用 距 离 系 数 法 中 的 邻 接 法
( en ihg b
o
-rj
。运访9 me hot d ) 构建氨基酸序列系统发
育树 。
2 结果
2
.
1 芸 , 属植物 . FA D Z位点的 PC R扩增和凝胶电
泳检测
拟南芥和芸荃属植物 F A￡` 基因片段 Pc R扩
增结果如图 IA所示 。
为了验证扩增结果 , 在研究中首先从拟南芥基
因组 D N A 中扩增出 F冷刀2 基因片段 , 并进行序列
分析 , 然后利用该片段进行 so u th e m 杂交检测 , 杂
交结果证实了 P C R 扩增的正确性 (图 I B ) 。
F A刀2 基因编码油酸脱饱和酶 , 该酶位于内质
网 , 催化油酸 ( 18 :l ) 脱氢生成亚油酸 ( 18 : 2) 侧 。
从 P C R 结果看 ,该基因在芸墓属作物中的分布较为
单一 。 它在 A 基因组 (大白菜 、 芜普和矮脚黄油
菜 ) 、 B 基因组 ( 黑芥 ) 、 C 基因组 (甘蓝 ) 和 B B C C
基因组 (埃塞俄比亚芥 ) 中均为单拷贝 , 在 A A B B
(抱子 芥 ) 和 A A C C 基因组 (甘蓝型油菜 ) 中为两
个拷贝。 在拟南芥基因组中也是单拷贝 , 大小同 A
基因组非常相似 。
苗 AR JB 姗 U HJ 那 B Z XG 幻
.
F汽刃叹基因片段 5%非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( A )
和 S o u ht e m 杂交 ( B )分析
1
.
5% on n衣 n a tUJ irn g队 G E (A )叨 d So ul 由ern b】o币 n g毋 )
an
lys i s o f P C R
一山m p liif e d FA D Z g e n e 加 gln e snt 丘. m
再月 bi山)P s招比a加口 a an d het 8 B n 助翻 ca
s
ep
c ies s h own in T ab le l
M
,
m ul ec ul ar s扭口山川 s ( 1 kb D N A lad d er , G任屺仆BRL ).
芸 , 属作物 FA D Z基因部分 O N A序列的同派
即.igr2
性比较分析
本实验从大白菜 ( AW和 BJ ) 、 甘蓝型油菜
( 6 X I和 6叉 2 )和埃塞俄比亚芥菜 ( AJ I和 A刀 )
中共分离出 6个 F汽石吹基因片段 (图 2 )。 从图 2和
表 2中可以看出 , 所克隆的芸荃属 F八D Z基因编码
的氨基酸序列之间高度同源 , 序列 同源性达到
9 .0 0%一 9 8
.
8%
。 这些序列与其它植物 F遴工呀对应位
置的氨基酸序列之间同源性较低 ,从 50 % 一 86 . 0% 。
同一物种的不同拷贝基因编码的氨基酸序列有着极
高的同源性 , 甘蓝型油菜中为 94 . 3% ,而埃塞俄比亚
芥中达到 98 .0 % 。
各个 F AD Z氨基酸片段的系统进化树如图 3 所
示 。 芸墓属作物的 F A D Z和拟南芥中的 F A D Z聚为
一类 。 由此可以看出 , FA D Z序列在芸婆属植物进化
过程中较为保守 , 它们的分化出现在拟南芥和芸鑫
属作物的分化以后 。 十字花科中的 F A D Z序列与其
它植物的 F A D Z亲缘关系较远 。 由于本研究中所扩
增的脂肪酸 F A工吩基因片段的编码区约为全长的
农 业 生 物 技 术 学 报 2《犯 4年
图 2.大白菜 ( AW和 J B)、甘蓝型油菜 ( 6 XI和 6】 2)和埃塞俄比亚芥菜 ( J AI和 A刀 )中 F人刀口基因序列编码的
端氨基酸序列与其它植物中的 F冷刀 2序列比较
F i g
.
2
.
M l ui P t lei a l n gm e nt of C
.
e t n ni ns uS e qe u
e n os of h te6 P ua t6 v eF滩刃吩日 m山 。 a ci d“ 沟 ue ne s ce l n oe d加 m Bn裂拙 i C a几 P Ia s ub S P .
户级勿 e ni ( s A wa nd扭 ), B . n aP uS (6 万 1 an d G月夕 ) ,幼d B . 。翻n ” . 扭 (刀 1 an d 乃2J ) , iw ht ht o se of o ht e r p俪 st hs own in T ab le Z
黑色区域为完全一致的序列 ,灰色表示同源性 60 % 以上的序列 。
hT e bl aC k 曲。 w s id翻 it因 , 叼 u en 侧留助 d het 『勺 比。 ws h o m o of gy o f 扣n o代印% 砚铆u . a地 ·
60%
, 不能代表完整的基因 , 而且所选取的植物
F A D Z基因序列数目有限 , 所以上述各个序列之间
的进化关系并不能完全反映完整 F A D Z序列之间的
关系 。
3 讨论
通过对亲缘关系密切的植物重要代谢途径基因
进行比较分析和功能基因标记 , 能够探讨近源物种
第 5期 李柱刚等: 芸盆属作物油酸脱饱和酶基因(A FZ D )拷贝数和序列变异分析 1 59
衰2 芸 , 属和其它植物中 15 个 F A D Z同源片段氮甚酸序列比较
T ab l
e 2 H o om of gy m
a itr x o f ht e 15 Pu iat ve FA D Z am ion 朗 i d se qu e n e e s
BJ GX I GX Z D E S AB】 A T 声 J I AJ Z AW C O PC PA 51 GA AH Z T RTO LE
JB IX() %
OX I 9.7 7% 10 %
口粥二 9 6. 7% 9 5 . 6% lX() %
D E S AB J 9 4
.
9% 94
.
0% 9 2
.
5% 10() %
A T 9 0
.
6% 9 .0 3% 8 .8 7% 9 1
.
7% 10 %
幻 1 9 8. 6% 9 8 . 7% 9 6 . 9% 9 5. 9% 9 1. 7% l0() %
幻 2 9 6 . 9% 9 8. 6% 9 5 . 1% 9 3. 7% 8 8` 9% 9 8名% 10() %
AW 9 8
.
1% 96
.
5% 9 5
.
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.
2% 8 7
.
3% 9 8石% 9 7 . 2% 10 0%
C O 74 .2% 74
.
1% 7 .3 2% 7.2 2% 74 .4% 6 8
.
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.
7% 6 0 8% 10%
PC 7 6
.
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.
7% 7 5 1% 7 6
.
2% 7 5
.
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.
1% 6 5
.
1% 60
.
8% 7 9
.
9% l 0() %
PA 8 0 3% 79
.
9% 7 9
.
3% 7 9
.
4% 7 9
,
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.
8% 7 3
.
8% 7 0 6% 7 6
.
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.
8% l 0() %
5 1 82 2 % 8 0
.
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.
2% 8 0 4% 7 9
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0% 69 石% 7 7 . 6% 7 9 .4% 7 8 . 5% l仪妈乞
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.
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.
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.
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.
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n 许O L E 6 7 .7% 6 . 5% 6 5 . 9% 6 3 . 5% 6 3 、 3% 6 3 .2% 5 4 . 5% 50 .0% 64 . 1% 6 5 .5% 64 . 8% 6 8. 5% 6 3 . 6% 6 5 . 5% 1加 ,`
C O
,
C日 en du al (G 即8L 阴 k A c c . oN
.人于34 306 匀 ; CP , eP的韶I山um nC 印 “ m (G e n B an k A c . oN . U 860 7 2) ; A T , 月用七心叩`招功目祖创功 (G既 BL . 止人“ . No .
A C 06 9 4 7 3) : D E SA B J
,
B n ” is ca j un cea (C即 B an k cA e
.
N o
.
X 9 1 13 9 ) ; PA
,户侧刀 us 田湘 l e n 扭Ca (C e n B a l , k A c c . N o决 f O7 1 8 9 2 ) ; 5 1 , S留山刀帅 山山 C吻
(G en B
a n k A c
.
N .o FA 19 2 4 86)
; G A刀加勿 e m a x (O e n B an k A c . N .o 4L 3 9加) ; A H , 月月hc 括七男拟邵 e8 (G优旧朗 k A e e . N .o A f 0 3 0 3 19 ), T RT O LE ,
及辉句沁” 允朋汉川朗相功 (G改旧 aI 止 A “ N .o x 94 94 ) 。 本研究中克隆的 6 个 FA D Z序列分别用粗体字表示 ;其余序列分别来自于表 1所列物
种 。 hT e s ix FDA Z阴 q u e n c e s e l o in g in ht is e x eP n m ent iw ht b lac k le t esr ;hT e o ht er eS q u en e es aer 加m s衅ie s hs own in Tab le 1 .
FA D ZA W
FA D ZG X I
FA D ZA J Z
F A D ZD E S A B j
FA D Z八t
F A D Z CO
图 3 . 芸! 属和其它植物中 巧 个 F A刃咬基因编码的
部分氨基酸序列的系统进化树
Fi g
.
3
.
Ph y l o g e n et i e etr e o f ht e Pu at it v e am i
n o ac id
s e q u e n e e s o f 15 FA DZ ge
n e h o m o lo go us se qu e n e e s
加m B几 IS s ica an d o ht e r P lan st
序列的名称见表 2说明。 数字表示该分支的 B o st lat P 支持
率 。 hT e F八D Z , 月 u e n c e ~ es 眼 ils tde in Tab le 2
.
N切 nr 加“
in ht e能 e b n nL c h e s in di cat e th e b o st atr P via u e s .
下A D Z P C
FA D Z丫R下O L.
l一月0 . 0 5之间的亲缘关系及分子进化情况仪 3 1。 本研究 , 利用
拟南芥脂肪酸合成途径 尸滩石夕基因序列对芸垄属作
物中的该基因进行了分子标记 , 而且是首次对白菜
两个品种中的 F AD Z基因进行了标记 , 获得了部分
核昔酸序列 。 FA DZ 基因在芸墓属中存在着从单拷
贝到两个拷贝的分布 。本实验在开始时使用 0 . 8%琼
脂糖凝胶电泳分离各个芸墓属物种的 F A石吃 P C R
产物 , 结果表明在拟南芥和芸 ! 属植物中 , 所有-
P C R 产物都是大小一致的单一产物 ( 图片略 ) 。 但
是在 5% 非变性聚丙烯酞胺凝胶中 , 芸墓属植物却
具有大小不同的 F A刃咬基因片段 , 这与两种凝胶的
分辨率有关 。
本研究中所克隆的芸墓属 F A石咬基因片段编码
的氨基酸序列具有很高的保守性 。 因为所克隆的
5 2 0农 业 生 物 技 术 学 报4 2 0 0年
P CR产物只是F A f咬基因片段 , 为了正确认识芸墓
属作物之间 F A刃咬基因的系统发育关系 , 有必要分
离各个全长基因 , 包括内含子序列 。利用拟南芥中的
已知序列扩增共有基因 , 将是研究芸墓属植物的有
效标记方法 。这种标记与基因功能相联系 ,对于认识
芸! 属植物的表型变异的分子基础具有重要意义 。
参 考 文 献
1 G u o ijn g
一
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o f m o l ce u lar m曰 kr e r er s e aj rC h o n ht e axt o n o m y
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报) , 20 1 , N o . I : 2 -6 3 0 ( in C h ine se )
2 P a te n 旧 n A H J滋 n T H , A m as ino R, et at . B n IS s ica ge on cun
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152 3~ 15 39
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199 8
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13 G加nL t M 民 M c D o w e l l J M , hS 山币e A G , et ia l n de P e n de n t
d e le t io n s o f a P a th o g e n
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A用 bid( )P 5 15 . P rco N iat A e ad S e i U SA , 19 98 , 9 5 :
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14 O sbo m T C
,
K o le C
,
P出 t i n 1 A P , e t a l . C o m Pa n so n o f
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A . bi d op s is ht al 殆nL a . G e n e it e s , 19 7 , 146 : 1 12 3一 12 9
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18 oR g
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H a比旧 r 肠bo ar to yr P r e s , 198 .9
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