全 文 ：第1 2卷 遗传学专辑 云南大学学报 (自然科学版)
离用于遗传图谱构建的分子标记 十分困难 , 至今
全基因组标定的分子标记也只有 520 多个 , 且分
布不均 。 因此 以小麦为材料进行染色体微切割 、
微分离 , 并建立染色体 D N A 文库具有重大意 义 ,
它可为小麦染色体精细遗传图谱的构建提供大量
的探针 。
取新制备的小麦 ( T r i : , e。 n : a s t i v u m L . ) “ 中
国春 ” 染色体标本 , 在显微镜下准确辨认 出 6 B
染色体后 , 用激光微束将其分割成 了 4 段 , 切割
染色体时激光微束所用参数为波长 53 O mn , 脉宽
10 n s
, 输出能量 10 时 。 然后利用微玻璃针借助
显微操作器将各片段分离 出来 , 并分别放入 E p -
ep n d o r f 管中 , 每管中各放 了 4 个 目标染色体区
段 。
分离 的 染 色 体 片 段经 过 蛋 白酶 K 消 化 、
aS u3 A 酶切及 加接头 后 , 进行 了两轮连接引物
( l in k e : 一 a d a p ot r
, 认 ) 一 P以 扩增。 结果除阴性
对照无信号外 , 阳性对照及其它各染色体片段的
扩增产物 电泳均显示 200 一 2 00 0 b p 左右的弥散
带。 以核 1) N A 为探针 与其进行 oS ut h er n 杂交的
结果与电泳带型基本吻合 。
在加人 1 . 25 拜g 小麦 D N A 作为竞争 D N A 的
条件下 , 分别以区段 1 , 2 , 3 , 4 的扩增产物为探
针进行染色体原位抑制杂交 , 结果均能重新定位
在原先分离的染色体区段上 , 即只在 目标染色体
片段上有杂交信号 。 这些结果充分说明 , 微分离
的 6 B 染色体区段确实被成功扩增 , 并 且没有其
它染色体区段 的污染 。 同时 , 利用 已定位于小麦
“ 中国春 ” 上的一套微卫星探针为引物 , 以不同染
色体片段的 L A 一 P C R 扩增产物为模板进行扩增 ,
扩增结果也证明 L A 一 P C R 扩增产物的确来自目
标染色体区段 。
验证各染色体区段的第 2 轮 P C R 扩增产物来
源后 , 分别将其克隆至 p G E M T 一 ve ct or 中建立
了 4 个 D N A 文库 。 挑取克隆子提取质粒后 , 进
行酶切和点杂交分析 , 结果表明 , 这 4 个染色体
区段特异性文库在基本特性方面相 近 , 克隆子数
目在 2 10 0 0 一 29 3 000 个之间 , 插人片段大小主
要分布在 300 一 1 800 b p , 平均大小在 8 50 b p 左
右 ; 单 、 低拷贝序列占 4 2 % 一 4 7 % , 中 、 高拷贝
序列在 4 3% 一 4 8 % 之 间 , 质粒空载率均 约为
10 %
。 与已有的染色体或染色体片段文库相 比 ,
在插人片段长度上明显优于 以前的报道 , 其他特
性近似 。 这些文库可提供大量小麦 6 B 染色体区
域特异的探针 , 为该染色体或染色体特定区段高
密度遗传图谱及精细物理图谱构建奠定了基础 。
用 F IS H 技术研究芸菱属重要物种的亲源进化关系
党本元 , 张丽华 , 陈正华
(中国科学院遗传研究所 , 北京 10 0 10 1)
芸墓属 ( B ar s s诬ca ) 是 十字 花科 ( C r u e i fe r -
ac e ) 植物 30 0 余个属 中最为重要的一个属 , 是重
要的油料 、 蔬菜和饲料作物 。 其物种生态类型较
多 , 既包括 了染色体组从 二 = 7 到 。 二 12 的二倍
体基本种 , 又包括 `了由二倍体基本种相互杂交而
成的双二倍体复合种 。 研究芸荃属物种间的亲源
进化关系不仅有助于从理论上 了解物种的进化起
源 , 而且也有助于对芸墓属物种基因组和分子育
种的研究 。 G I SH 是这一研究领域的一项重 要技
术, 在对种 间杂种 、 附加系 、 易位系等外源基因
组成分的鉴定分析方面具有较大的应用价值 。 编
码 18 5 一 5 . 8 5 一 2 65 的 到RN A 基因 , 已在多种植物
中进 行 过 研 究 ( M uk a i 等 , 19 9 1 ; eL i t e h 等 ,
1 9 9 2 )
。 由于该基因为高度重复序列 , 在近缘物种
中发生着位于染色体上的位点以及同一位点基因
拷贝数多少的变化 , 因而通过 IF SH 技术对其在染
色体上分布的位置 、 位点以及拷贝数多少进行比
较研究 , 可以研究近缘物种的亲源进化关系及起
源 。 本研究分别选用芸荃属二倍体物种基因组和
rR N A 基因为杂交探针 , 对芸墓属重要物种之间
的亲源进化关系进行 了较为详细的 G IS H 和 IF SH
研究 。 以 B . 爪g ar 的 B 基 因组 为杂交探针 , 用
云南大学学报 ( 自然科学版 ) 第 21 卷 遗传学专辑
B
. 。 le ar c。 或 B . 。。 ,:加 N tr i: 的 C 或 A 基 因 组
D N A 进行封阻 , 与 B . 。 a r i ,: a t。 和 B . z ` , , : c e。 前中
期 (中期 ) 染色体进行 G IS H 杂交 , 结果发现当
封阻 D N A 的浓度为探针浓度的 2( ) 倍时 , 杂交信
号 主 要 集 中 于 16 条染 色 体上 , 其余 18 条
( B
. 。 a ; 一 : , ; a t e ) 或 20 条 ( B . z “ ,: 〔` ae ) 染色体基本
上无杂交信号 。 以 B . ca , ,: eP 、 tr 艺、 的 A 基因组 为探
针 , 用 B . ole ar 二 的 C 基因组 D N A 进 行封阻 ,
与 B . ,。 P u 、 前中期 (中期 ) 染色体进行 G ISH 杂交 , 结果表明所有的 38 条染 色体都出现 了较强的
杂交信号 。 提高封阻 D N A 的浓度 , 为探针 的 30
倍时 , 所有的染 色体仍都出现杂交信号 。 我们也
曾 以 B . ol e ar o ae 的 C 基 因 组 为 探 针 , 用
B
. 〔
a1
, eP 对 r诬、 的 A 基因组作为封阻 D N A 进行 r
上述研究 , 其结果与上述基本相同。 用 rR N A 基
因作为探针进行 FJ SH 杂交 , 其结果分别为 : 二
倍体的 B . 。 a , ,: p e s t r艺s , B . 。 l e ar c e a 和 B . ? : ig ar 中
分别 出现 6 , 3 和 2 对杂交信号 ; 双二 倍体的
B
.
, : a P“ 5 , B
.
j ;` ,: c。 和 B . 。 a r i , : a t。 中则分别出现
6
,
6 和 4 对杂交信号 。 每一位点杂交信号的强弱
表现较大差异 , 这就表明各位点 r R N A 基因拷贝
数存在差异 。 根据上述研究结果 , 可 以说明 ( 1)
芸墓属双二倍体复合种系二倍体基本种杂交而成 ;
( 2) 芸蔓属双二倍体物种在长期 的进化过程中二
倍体物种的基因组之间发生着 D N A 片段的交换
和重排现象 , r R N A 基因位点发生 了物种间的融
合或丢失现象 ; ( 3) B . , il g ar 的 B 基因组与
B
. 。 le ar cae 或 B . 。 a n : 加 st 月 、 的 C 或 A 基因组亲源
关 系 较 远 , 而 B . ca 川 eP s tr i、 的 A 基 因 组 和
B
.
ole ~
的 C 基因组则具有较近的亲源关系。
高效抗虫转基因水稻的培育
朱 祯 , 邓朝阳 , 吴 茜 , 徐鸿林
(中国科学院遗传研究所 , 北京 1 0( ) 101 )
水稻是我国重要 的粮食作物 , 种植面积超过
3 丫 10 7 h澎 , 年产稻谷 2 亿 t , 占我国粮食总产量
的 3 8 % 。 虫害是制约水稻生产的主要问题 , 据统
计 , 虫害造成的损失占稻谷 总产量 的 5 % 以上 ,
每年损失约为 10 0 万 t 。 其中 , 最 主要的水稻害
虫为二化螟 、 三化螟等鳞翅 目害虫 。 因此 , 有效
地控制水稻鳞翅 目害虫对水稻增产具有非常重要
的意义 。
通过转基因方式培育抗虫水稻新 品种已成为
可能 , 广泛使用 的可 豆胰蛋 白酶抑制剂 ( C p T )I
基因是一个有效的抗虫基因 。 然而 , 在某些情况
下由于 C p T I 在转基因植物 中的表达 水平较低 ,
影响 了转基因植物的抗虫性 。 我们在体外对 C p T I
基 因 进 行 了改 造 , 获 得 了修饰 的 C p T I 基 因
( SC K 基因 ) , 并构建 了CS K 基 因单子叶植物转
化载体用于水稻的转化实验 。 我们使用基因枪转
化法对水稻进行转化 , 共获得 了数百株转基因水
稻 , 从中筛选出大量 的抗虫性优异的株系。 对转
基因水稻检测的结果表明 , 修饰的 S CK 基因与未
经修饰 的 C p T I 基 因相 比 , 外源抗虫蛋 白的积累
量 、 胰蛋白酶抑制剂活性和抗虫性均有 了大幅度
的提高。
我们这里使用的关键技术是外源蛋白细胞内
定位的技术 , 我们在 C p T I基因的 N 一端和 C 一端
分别添加 了信号肤和 内质网定位信号编码序列 ,
使其编码的蛋白最终定位于寄主细胞的内质网及
其衍生的蛋白体中 , 而不是之前的细胞浆内。 通
过改变在寄主细胞内的定位方式 , 抗虫蛋白的 自
身稳定性大为增强 , 并表现为在寄主细胞内的积
累量的显著上升 , 进而使转基因植物的抗虫性明
显提高。 上述实验结果表明我们的设计已达到 了
预期的目标。 除水稻外 , 在我们所获得的转基因
棉花 、 烟草和 白菜中也得到 厂进一步的验证 。 此
项工作已申请 了专利 , 并已被专利局接受 。
我们与福建省农科院 、 四川农业大学等育种
单位密切进行合作 , 已将修饰的 C p T I 基因转人
了著名的三系杂交水稻恢复系明辉系列和蜀恢系
列中 , 以及两系杂交水稻 的恢复系 中 , 并已获得