全 文 ：　[收稿日期] 　2010-11-06;2011-01-06修回
　[ 基金项目] 　国家自然科学基金项目“甘蓝型油菜原花青素途径种皮特异表达基因的克隆和表达抑制”(30771237);国家“ 863”计划课题“甘
蓝型油菜类黄酮途径功能基因克隆及黄籽性状代谢工程研究”(2006AA10Z110)和“油菜品质和杂种优势利用相关基因的克隆
与功能分析”(2006AA10A113);重庆市科技攻关项目“油菜分子育种及品质检测技术研究”(CSTC 2009AB1030)
　[作者简介] 　陈　艳(1985-),女 ,在读硕士 ,研究方向:作物遗传育种。 E-mai l:chenyan.smi le@163.com
　＊通讯作者:柴友荣(1968-),男 ,研究员 ,博士生导师 ,从事功能基因研究和分子育种工作。 E-m ail:chaiyourong1@163.com
遗传育种 ·种质资源·生物技术 [ 文章编号] 1001-3601(2011)03-0141-0001-04
芸薹属 TT19 基因家族 RNA干扰载体的构建
陈 艳1 , 2 , 3 , 4 , 柴友荣1 ,2 ,3 ,4＊ , 张 迪1 ,2 ,3 ,4 , 冯 瑜1 , 2 , 3 , 4
(1.西南大学 农学与生物科技学院 , 重庆 400716;2.农业部生物技术与作物品质改良重点实验室 , 重庆 400716;
3.重庆市作物品质改良重点实验室 , 重庆 400716;4.重庆市油菜工程技术研究中心 , 重庆 400716)
　　[摘　要] 为构建芸薹属 T T19 基因家族的 RNAi载体 ,为芸薹属植物的种皮色素 、观赏色彩等性状的研究和修饰打基础。利用 PCR克隆芸薹属 TT19 基因家族的 RNAi片段 ,采用双酶切将其反义片段和正义
片段分别从 T-载体亚克隆到平台载体 pFGC5941M 的启动子与间隔区之间和间隔区与终止子之间 ,形成
RNAi载体 ,转化大肠杆菌并完成 PCR鉴定 ,再转化根癌农杆菌 LBA4404得到工程菌株 。结果表明:克隆
得到 200bp(含人工酶切位点)的芸薹属 T T19 基因家族 RNAi 片段 BTT19 I , 其对应于甘蓝型油菜
Bn TT19-1mRNA 的 363 ～ 540bp ,其反义和正义片段分别被 NcoI+Aat II 和 BamHI+XbaI双酶切亚克隆到 pFGC5941M 中 ,得到 10552bp的 RNAi载体 pFGC5941M-BT T19I(简称 pBT T19I)。成功构建了芸薹
属 TT19 基因家族的 RNAi载体。[关键词] 芸薹属;RNA干扰(RNAi);TT19 ;载体构建[中图分类号] S565 [文献标识码] A
Construction of RNA Interference Vector of TT19
Gene Family in Brassica
CHEN Yan1 , 2 , 3 , 4 , CHAI You-rong1 , 2 , 3 , 4＊ , ZHANG Di1 , 2 , 3 , 4 , FENG Yu1 , 2 , 3 , 4
(1.College of Agronomy and Biotechnology , Southwest Universit y , Chongqing 400716;2.Key Labortary
of Biotechnology and Crop Qualit y Improvement o f Ministry of Agriculture , Chongqing 400716;3.
Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement , Chongqing 400716;4.Chongqing
Rapeseed Technology Research Center , Chongqing 400716 , China)
　　Abstract:The RNAi f ragment o f B rassica TT19 gene family is cloned by PCR fi rst , and then its sense
and antisense f ragments are respectively sub-cloned into betw een promote r and space r , and between spacer
and terminator in platfo rm vecto r pFGC5941M fo r forming RNAi vector and finally the RNAi vector is
t ransfo rmed into Ag robacterium tumefaciens st rain LBA4404 af te r PCR identif ication to lay a foundation
fo r research and modification of testa pigment and o rnamental colo r characters.The sequence re sults
show ed that the RNAi fragment (BT T19 I)w ith 200 bp o f Brassica T T19 gene fami ly w as cloned , which
co rresponds to 363 ～ 540 bp o f BnT T19-1 mRNA , it s sense and antisense f ragments w ere respectively sub-
cloned into pFGC5941M by N coI+AatI I and BamHI+XbaII double dige stion and pFGC5941M-BTT19 I ,
a RNAi vector wi th 10 552 bp w as obtained .
Key words:Brassica;RNA interference (RNAi);T T19 ;vector construction
　　芸薹属(B rassica)包含许多有重要经济价值的
油料 、蔬菜 、饲料和观赏作物。油菜是芸薹属中以收
获种籽榨油为主的一类作物总称 ,包括甘蓝型油菜
(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa ssp .olei f era)和
芥菜型油菜(B .j uncea)3个栽培种。甘蓝型油菜是
世界上种植最为广泛的油菜类型 ,在相同遗传背景
下 ,黄籽油菜具有较黑籽油菜的种皮薄 ,含油量及蛋
白质含量高 ,油质透明 ,饼粕木质素及单宁含量低等
优点[ 1] 。但甘蓝型油菜因缺乏黄籽基因型 ,表型不
稳定 ,育种难度大[ 2] ,急需克隆黄籽相关基因 ,研究
其分子机理和开展分子育种。
模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和芸
薹属十字花科 ,经连锁图比较发现 ,两者之间的共线
性较高[ 3] ,为芸薹属的功能基因研究提供了重要参
考 。拟南芥原花青素(PA)的研究中筛选到许多透
明种皮(TRANSPAREN T TES TA , T T)基因 ,其
中 , TT19(At TT19 / AtGS TF12)基因编码一种谷胱
甘肽 S-转移酶(g lutathione S-t ransferases ,GST s),
将花青素和原花色素转运到液泡 ,对种皮色素的形
成有重要的作用 。GST 在每种植物中均以基因超
家族的形式出现 ,如拟南芥中有 47 个成员 ,水平同
源基因间在多数区段上保守 ,但功能各异 ,主要表现
在底物特异性和转运靶向(液泡 、胞外等)不同。
AtT T19 、 AtGS TF11 、大豆 GST22 、柑 桔 GST
(DQ207360.1)、矮牵牛 AN9 (Y07721)、宽叶菜豆
GS T(AY099257)、水稻 GS T(NM 193840)和玉米
　贵州农业科学　2011 , 39(3):1～ 4　Guizhou Ag ricultural Science s
Bz2 等基因组成一个同源群 ,功能较难根据同源性
来确定[ 4-5] 。 TT19 、AN9 与B z2 间虽然同源性并不
高 ,但均转运花青素等类黄酮物质并定向液泡 。矮
牵牛 AN9 转化 T T19 突变体后恢复了花青素的积
累 ,但种皮中没有褐色色素的积累 。T T19还转运
PA
[ 6] ,介于它们中间的 AtGS TF11 则被推断有可
能转运硫代葡萄糖苷[ 7] 。研究 T T19 基因有助于揭
示油菜种皮颜色形成的分子机制 ,其基因沉默可用
于创造黄籽性状 。
RNA 干扰(RNA interfe rence , RNAi)是由双
链 RNA 所引发的靶基因 mRNA 降解而导致的序
列特异性基因沉默 ,特异 ,高效 ,易于操作。构建可
转录为 dsRNA 的植物表达载体是应用该技术阻断
特异基因表达的关键环节 ,可应用于基因功能鉴定
和基因工程[ 8-10] 。据报道 ,甘蓝型油菜(AACC)是
由基本物种白菜(AA)和甘蓝(B.oleracea , CC)通过
天然远缘杂交和染色体加倍而来的异源四倍体物
种[ 11] 。本课题组此前采用 RACE 技术已克隆了甘
蓝型油菜 T T19 基因家族 、白菜 TT19 基因家族和
甘蓝 T T19 基因家族的全长 cDNA 和基因组序列
(待发表),并将植物 RNAi基础载体 pFGC5941 改
造为 pFGC5941M [ 12] 。本研究在此基础上克隆了芸
薹属 T T19 基因家族的 RNAi 片段 ,将正向和反向
亚克隆到 pFGC5941M 中形成了 RNAi载体 ,可用
于研究芸薹属种皮色素合成机理与修饰 。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌菌株 DH5α(空白菌
株和含有 pFGC5941M 的菌株)、根癌农杆菌菌株
LBA4404 、含 BnT T19-1全长 cDNA 的重组 T-载体
质粒(pMD19-T-BnT T19-1),均由本课题组保存。
1.1.2 试剂 pMD19-T 载体 、DNA Ligat ion Ki t
Ver.2.0 和 λ-Hind III DNA marker 为大连宝生物
(TaKaRa)产品;Easy-Taq DNA 聚合酶及 buf fer 、
dN TPs 、DL2000 plus DNA marker 和琼脂糖等为
北京全式金(Transgen)产品;Bio spin胶回收试剂盒
和 Biospin 质粒小量提取试剂盒为杭州博日
(BioFlux)产品;限制性内切酶及 Buf fer 为 MBI
Fermentas 产 品;用 于克 隆干扰 片段 的引 物
FB T T 1 9 I (ggatccgacg tccag tg ggctgatg ttgag )、
RBT T19 I (tctag accatg gaaccgg ttcg aagcaagc)、载体
鉴定的引物(FBnPAP2I2 、RBnPAP2I2 、F35S3N 、
ROCS T5N)[ 12] 和测序由上海英骏(Invi tro gen)商业
完成;氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平
(Rif)和链霉素(Str)等购自上海生工。
1.2 方法
1.2.1 芸薹属 T T19 基因家族 RNAi片段的扩增
多重比对甘蓝型油菜 、白菜 、甘蓝和拟南芥 T T19 基
因家族各成员的全长 cDNA ,选择在 TT19 基因家
族特异保守且与其他GS T 基因有显著差异性的区
段 ,设计引物 FBT T19I 和 RBT T19I ,以 pMD19-T-
BnTT19-1质粒为模板进行 PCR扩增。标准 50μL
体系含 0.1μL模板和 1.5U Taq DNA聚合酶和其
他成分 , PCR 循环条件为:94℃预变性 2min ;94℃
变性 1min , 60 ℃退火 1min , 72℃延伸 30 sec , 35个
循环;最后 72℃延伸 10min 。PCR产物经 1%琼脂
糖凝胶电泳 ,GoldView 染色和照相后 ,在紫外观测
仪中切下目的条带 , 进行胶回收 。将回收片段与
pMD19-T 采用 T 4DNA 连接酶于 16℃条件下 10μL
标准体系连接 12 h , 构成重组载体 pMD19-T-
BTT19 I ,转化用 CaCl2二次重悬法制备的 DH5α感
受态细胞 , 通过 Amp(100mg/ L)抗性和 IPTG/X-
gal蓝白斑筛选[ 13] , 白色菌落克隆子的菌液采用
PCR鉴定送阳性克隆子测序。
1.2.2 载体骨架的制备和反义片段的插入 将含
有 pFGC5941M 和 pMD19-T-BTT19I 质 粒 的
DH5α单克隆培养到对数晚期 ,均抽取质粒 。用
NcoI+AatII同时双酶切 pMD19-T-BT T19I和 pF-
GC5941M ,酶切体系均为 50μL ,其中 ,含质粒 DNA
20μg 、2种限制酶(均为 10U)和 1×Tango buffe r ,
37 ℃酶切过夜 ,酶切完全后进行电泳 ,胶回收反义片
段 BTT19A 和开环的 pFGC5941M 骨架 。连接重
组条件同上 ,转化 DH5α,以抗 Kan(100mg/ L)的单
克隆菌落的培养菌液为模板进行 PCR鉴定 ,引物组
合 为 F35S3N + FBT T19I、 RBT T19I + RBn-
PAP2I2 ,选取全阳性克隆子提取重组质粒 ,命名为
中间载体 pFGC5941M-BT T19IA 。
1.2.3 中间载体的酶切和正义片段的插入 培养
含有 pFGC5941M-BT T19IA 的菌株 ,抽提质粒 。用
BamHI+XbaI 完全双酶切 pMD19-T-BT T19I 和
pFGC5941M-BTT19IA质粒 ,体系同前 ,电泳后回
收正义片段 BT T19 IS 和开环的中间载体 。将其用
10μL 标准体系连接 ,转化 DH5α,以抗 Kan的单克
隆菌落的培养菌液为模板 ,引物组合分别为 FBn-
PAP2I2 + RBTT19I、 ROCST5N + FBTT19I、
F35S3N +RBnPAP2I2 、FBnPAP2I2 +ROCST5N
进行 PCR检测 ,全阳性克隆子命名为 pFGC5941M-
BT T19I(简称 pBT T19I)。
1.2.4 RNAi载体转化根癌农杆菌 根癌农杆菌
LBA4404感受态细胞的制备同 DH5α,采用液氮冷
激法转化 pFGC5941M-BTT19 I[ 14] ,涂布于含 Kan
(100mg/ L)、Rif(40mg/L)和 Str(20mg/L)的 YEB
平板 , 28℃倒置培养 2 d至长出直径 2mm 的菌落 ,
挑取抗性菌落接种于含有与前面相同抗生素的
YEB液体培养基中培养 ,菌液 PCR检测同 1.2 .3。
2 结果与分析
2.1 干扰片段的克隆
以 pMD19-T-Bn TT19-1质粒为模板 ,用引物
·2· 　　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2011 , 39卷
图 1 B T T19 I 的 PCR 扩增产物电泳图(左)及其序列(右)
Fig.1　The electropho resis pattern and sequence of PCR amplified products o f B TT19 I
组合 FBTT19I+RBT T19I 进行 PCR扩增 ,得到与
预期一致的特异条带(图 1), 含人工酶切位点的
BTT19I为 200bp ,将其回收 ,与 pMD19-T 连接 ,转
化 DH5α,挑选菌液 PCR 阳性的 2 个单克隆测序 ,
得到的 BT T19 I 为 200 bp(图 1),与 BnT T19-1 基
因序列(待发表)在对应区段完全一致。
2.2 芸薹属 TT19 基因家族 RNA 干扰载体的构
建与检测
采用 NcoI + Aat I 完全双酶切 pMD19-T-
BT T19I 后产生了与预期一致的 186bp 的干扰片
段 BT T19 IA(图 2A),但伴随 1 条 500 bp左右的杂
带;采用 NcoI+AatI完全双酶切 pFGC5941M 后产
生了与预期一致的 10 kb 左右的开环载体骨架(图
2B)。回收两个目标片段 , 连接后得到了 pF-
GC5941M-BTT19IA ,转化 DH5α,抗 Kan单克隆菌
液采 用引物 组合 RBnPAP2I2 + RBTT19I 和
F35S3N +FBT T19I 进行 PCR鉴定 ,分别扩增出与
预期 367 bp 和 304 bp 一致的条带(图 2C 、图 2D)。
说明 ,反义片段已按正确方向插入到启动子与间隔
子之间 ,形成了中间载体 pFGC5941M-BT T19IA 。
　　A , NcoI+Aa tII 双酶切 pMD19-T-BT T19I;B, NcoI+Aa tII 双酶切 pFGC5941M ;C ～ D , pFGC5941M-BT T19IA 的克隆子菌液 PCR检测
(引物组合为 RBnPAP2I2 +RBT T19I 、F35S3N +FBT T19I);E , BamH I +X baI 双酶切 pM D19-T-BT T19I;F , BamH I +X baI 双酶切 pF-
GC5941M-BT T19IA;G ～ H , pFGC 5941M-BTT19I 的克隆子菌液 PCR检测(引物组合依次为 FBnPAP2I2 +RBTT19I 、ROCST 5N+FBT T19I 、
F35S3N+RBnPAP2I2 、FBnPAP2I2+ROCST 5N);M , marker。
　　A , NcoI+Aat II doub le diges tion of pMD19-T-BT T19I;B , NcoI+AatII double digest ion of pFGC 5941M ;C ～ D:PCR checkin g of pF-
GC5941M-BT T19IA colony culture (p rimer pai rs RBnPAP2I2 +RBT T19I and F35S3N +FBT T19I);E , B amHI +X baI double digestion of
pMD19-T-BTT19I;F , BamHI+X baI double digestion of pFGC5941M-BT T19IA;G ～ H , PCR checking of pB TT19I colony cul tu re(p rimer pairs
FBnPAP2I2+RBT T19I , ROCST5N+FBT T19I , F35S3N+RBnPAP2I2 and FBnPAP2I2+ROCST 5N);M , m ark er.
图 2 RNAi载体 pFGC5941M-BTT19I构建中的酶切和 PCR鉴定电泳图
Fig.2　Enzymic dige stion and elet rophoresis pattern of PCR identification in construction o f RNAi vecto r pFGC5941M-BTT19I
　　采用 BamHI+XbaI双酶切 pMD19-T-BTT19I
和 pFGC5941M-BT T19IA 后 ,分别产生了正义干扰
片段 BTT19IS(图2E)和 pFGC5941M-BT T19IA 开
环骨架(图 2F),回收 2个目的片段 ,连接重组后得
到干扰载体 pFGC5941M-BTT19I ,转化 DH5α。以
抗 Kan 单克隆菌液为模板 , 采用引物组合 FBn-
PAP2I2 + RBTT19I 、ROCS T5N +FBTT19I 和
F35S3N +RBnPAP2I2 、FBnPAP2I2 +ROCS T5N
分别进行检测 , 扩增出了与预期 381 bp 、319 bp(图
2G)和 471 bp 、500bp(图 2H)一致的条带。说明 。
BnT T19 IS 片段在间隔子与终止子之间正义插入且
BnT T19 IA 片段在 35S 启动子与间隔子之间反义
插入 ,2个片段的插入方向均正确且大小完整。
2.3 重组载体转化根癌农杆菌及鉴定
提取鉴定正确的阳性克隆子的质粒 ,通过液氮
冷激法转化农杆菌菌株 LBA4404 ,挑取抗 Kan 、Str 、
Rif 的单克隆子进行液体培养 ,采用与图 2G 和图
2H 相同的引物组合进行菌液 PCR检测 ,得到与预
期一致的结果 ,表明 , RNA 干扰载体 pFGC5941M-
TT19I(简称 pBT T19I)构建成功(图 3)。
图 3 RNAi载体 pFGC5941M-BTT19I质粒图
　　Fig.3　The plasmid map of RNA i vecto r pFGC5941
M-BT T19I
·3·　第 3 期 陈　艳 等　芸薹属 T T19 基因家族 RNA 干扰载体的构建
3 结论与讨论
1)研究克隆了 200 bp的芸薹属 T T19 基因家
族的 RNAi片段 BT T19I ,将其反义和正义片段亚
克隆到 pFGC5941M 中 ,构建了 10 552bp的 RNAi
载体 pFGC5941M-BTT19I(简称 pBT T19I),获得
了工程菌株 ,将促进芸薹属花青素苷 、原花青素性状
的研究与修饰。
2)在 TaKaRa 的 pMD19-T 载体的 TA 克隆
位点的 M13F 一侧的 500 bp上游存在 1个 Aat II 切
点 , 所以当采用 Nco + Aat 从重组 pMD19-T-
BTT19I上切下目标基因片段时 ,会伴随有 1 个
500 bp左右的载体片段 ,但是该杂带在研究中没有
妨碍对目标基因的判断。
3)RNAi是生物体中普遍存在的一种现象 ,代
表了一种古老的细胞反应通路。同时 , RNAi 作为
一种基因阻断技术 ,在基因组基因功能研究 、遗传病
的基因治疗和蛋白质功能研究方面已显示出巨大的
应用前景[ 15] 。RNAi作为基因沉默技术之一 ,其稳
定性好 ,且效率比反义 RNA 高得多[ 16] 。植物界基
因家族现象很普遍 , RNAi既可用于对不同成员进
行分别沉默 , 也可用于对整个家族进行有效沉
默[ 17-18] 。本课题组经过克隆 , 甘蓝型油菜有 4 条
TT19 基因(BnT T19-1 ～ BnT T19-4), 亲本物种白
菜有 2条 T T19 基因(BrT T19-1 和B rT T19-2),甘
蓝有 2 条 T T19 基因(BoT T19-1 和 BoT T19-2)。
BnT T19-1 、Bn TT19-3 起源于Br T T19-1 、Br TT19-
2 ;Bn TT19-2 、 BnT T19-4 起 源 于 BoT T19-1 、
BoTT19-2 ;来自 3个物种的 8条 T T19 基因之间在
全长 mRNA 水平的一致性为 84.1 %～ 100%,RNA
干扰 片 段 BT T19 I 与 Bn TT19-1 、 BnT T19-2 、
BnT T19-3 、 BnT T19-4 、 B rT T19-1 、 BrT T19-2 、
BoTT19-1 和 BoTT19-2 在 mRNA 水平的一致性
分别达到 100.0%、94 .9%、84.8%、84 .3%、100.
0%、84.8 %、94.9%和 84 .3%。因此 ,理论上推测
干扰载体 pFGC5941M-BTT19I 可用于甘蓝型油
菜 、白菜和甘蓝等多个芸薹属物种的转基因 ,可以介
导 T T19 基因家族的高效沉默。设计时 , BT T19 I
位于编码区的特异性保守区 ,与 GST 超家族的其他
功能基因无显著同源性 。因此 ,该载体不会引起对
TT19 以外的其他GS T 基因的非靶向沉默 。
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(责任编辑:杨　林)
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