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表 3 大棚栽培年限对黄瓜硝态氮含量的影响响
处理 硝态氮含量(g /kg) 维生素 C(mg /100g)
1 年 20． 20 3． 24
4 年 23． 23 3． 33
7 年 25． 12 2． 91
10 年 31． 06 2． 16
露地 19． 05 2． 95
维生素 C是蔬菜产品的主要品质指标之一，它是人体不
能合成也不能积累但每天须摄取最重要维生素之一。体内维
生素 C不足是导致坏血症的直接原因，维生素 C 还与多种疾
病防治有关，因此维生素 C对人体有重要作用。从表 3 可知，
1、4 年大棚栽培的黄瓜维生素 C 含量较高，分别是露地栽培
黄瓜维生素 C含量的 1． 10、1． 13 倍;而 7、10 年棚龄黄瓜的维
生素 C 含量分别比露地黄瓜维生素 C 含量低，分别降低了
1. 4%、26． 8%。大棚栽培初期土壤的条件有利于黄瓜体内维
生素 C的合成与积累，但是随着种植年限的延长，大棚土壤
出现次生盐渍化，导致维生素 C的合成受阻。
3 结论
大棚年限对黄瓜生长发育有显著影响，株高、叶片数、叶
面积随着棚龄的增加，各指标出现先高后低趋势，在 4 年棚龄
内种植时达到最大值。可溶性蛋白质和可溶性糖随着大棚年
限的增加也表现先高后低的变化规律，以 4 年棚龄内种植时
含量达最大值。黄瓜硝酸盐的含量则随棚龄的增加逐年明显
上升，10 年棚龄达最高峰。黄瓜维生素 C含量总体上随栽培
年限的增加逐年下降，4 年棚龄的略高于 1 年棚。
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拟堇花兰属植物 Ionopsis utricularioides
叶片原生质体分离条件研究
李 智1，2，杨光穗2，尹俊梅2，黄明忠2，冷青云2
(1．海南大学农学院，海南海口 570000;2．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737)
摘要:以 Ionopsis utricularioides试管苗叶片为材料进行原生质体分离，研究了酶液组合、酶解时间、甘露醇浓度、预
处理方法等因素对原生质体的产量及活力的影响。结果表明，Ionopsis utricularioides 试管苗叶片在含有 0． 5%果
胶酶 + 2． 0%纤维素酶(绿色木霉)+(11% ～ 12%)甘露醇 CPW 溶液的混合酶液中，在 25 ℃黑暗环境下静置酶解
3 h，原生质体分离效果最佳。
关键词:拟堇花兰;原生质体;兰花;花卉
中图分类号:Q26 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)09 － 0153 － 03
收稿日期:2012 － 02 － 28
基金项目:国家科技支撑计划(编号:2007BAD45B06) ;中央级公益性
科研院所基本科研业务费专项(编号:PZS067)。
作者简介:李 智(1986—) ，男，浙江绍兴人，硕士研究生，研究方向
为热带花卉种质创新。E － mail:sundaylee1986@ foxmail． com。
通信作者:尹俊梅，研究员，主要从事热带花卉种质资源创新利用及
高产栽培技术研究。E － mail:yinjunmei2004@ yahoo． com． cn。
Ionopsis utricularioides 是兰科(Orchidacea)拟堇花兰属
(Ionopsis)多年生草本植物，为文心兰近缘种，原产于中南美
洲。I． utricularioides具有着花数量繁多、花色明亮等优点，观
赏价值较高，且 I拟堇花兰为原生种，可育性较栽培品种强，
可作为兰花育种的优良亲本。
原生质体是指除去细胞壁的仅由质膜包裹的裸露“细
胞”［1］。原生质体具有完整细胞的生理特性，可作为单细胞
系研究材料，观察细胞壁的再生、细胞分裂、分化等生长发育
过程［2］。原生质体还可以作为外源基因导入的对象［3］，在基
因表达、遗传改良、启动子分析等领域得到广泛应用［4 － 7］。同
时，分离高质量的原生质体是体细胞融合研究的必要前提。
因此，I． utricularioides原生质体分离技术的研究对拟堇花兰
属及其近缘种属细胞学水平的研究具有重要意义。目前，关
于拟堇花兰属原生质体分离条件的研究还未见报道。本试验
以 I． utricularioides试管苗叶片为材料，对其原生质体分离条
件进行研究，探讨了酶液组合、酶解时间、甘露醇浓度、叶片材
—351—江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 9 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.09.133
料预处理等因素对原生质体分离的影响，以期为后续的原生
质体培养、遗传转化、细胞融合等细胞学水平的相关研究作出
贡献。
1 材料与方法
1． 1 材料
试验材料为 I． utricularioides试管苗，取自中国热带农业
科学院热带作物品种资源研究所热带花卉种质资源保存库。
选取 1． 5 ～ 2． 0 cm 长度的试管苗叶片，用手术刀横向切成
0． 5 mm左右厚度的薄片备用。
1． 2 方法
1． 2． 1 混合酶液处理叶片材料 在含 13%甘露醇的 CPW
溶液(CPW配制参照张晓丽等的方法［8］)中添加不同浓度组
合的果胶酶、纤维素酶(绿色木霉) ［Cellulase(Trichoderma
vride G) ］、纤维素酶(黑曲霉) ［Cellulase (Aspergillus niger) ］，
配制混合酶液，pH 值 5． 5。酶液用磁力搅拌机搅拌 1 h，
2 000 g 离心 3 min除去不溶性杂质，取上清液用 0． 22 μm针
头过滤器过滤除菌。在直径 6 cm 的培养皿中加入 10 mL 酶
液，将切成薄片的试管苗叶片置于培养皿中，每个培养皿 1 g
材料。在 25 ℃黑暗环境下静置酶解 2 h，酶解期间每隔
30 min 轻轻晃动培养皿 1 次，使酶液充分渗透进入叶肉组织。
酶解完成后需要对原生质体进行纯化，将原生质体悬浮
液经 400 目细胞过滤筛过滤，取滤液，100 g 离心力离心
5 min，弃上清液，用含 13%甘露醇的 CPW 溶液清洗 3 次，最
终定容至 1 mL。在 10 mL离心管中加入 5 mL含 20%蔗糖的
CPW溶液，将原生质体悬浮液缓慢滴加到蔗糖溶液上方，
100 g 离心 5 min。离心后，在甘露醇溶液和蔗糖溶液的两相
界面上形成一条绿色的原生质体带，而密度较大的晶体细胞
及组织碎片沉入管底，密度较小的细胞碎片悬浮在甘露醇溶
液中。用 200 μL移液器轻轻吸出原生质体，并在 100 g离心
力下离心 5 min，弃上清液，用含 13%甘露醇的 CPW 溶液清
洗 2 次。
纯化得到的原生质体用血球计数板统计产量，以每克鲜
重的初始材料分离得到的原生质体个数(个 / g)来表示。用
二乙酸荧光素(FDA)法测定原生质体存活率，经 FDA 染色后
具有活力的原生质体在蓝色光激发下发出绿色荧光，无绿色
荧光的则为死细胞。原生质体存活率计算公式:存活率 =
(发出绿色荧光的原生质体个数 /原生质体总数)× 100%，观
察 10 个视野，取平均值。
1． 2． 2 酶解时间的优化 用筛选出的最佳混合酶液在 25 ℃
黑暗环境下静置处理 I． utricularioides 叶片材料，处理时间设
置 5 个梯度，分别为 1、2、3、4、5 h。处理后统计原生质体产量
及存活率，并作出比较。
1． 2． 3 甘露醇浓度的优化 用上述试验中筛选出的最佳混
合酶液处理叶片材料，其中甘露醇浓度设置 5 个梯度，分别为
9%、10%、11%、12%、13%，酶解后统计原生质体产量及存活
率，并作出比较。
1． 2． 4 叶片材料预处理 将 I． utricularioides 叶片材料进行
4 种预处理，分别是:(1)试管苗在黑暗中预培养 24 h;(2)将
已切成薄片的叶片材料置于酶液中，并抽真空 30 min;(3)叶
片材料在 4 ℃低温下预处理 24 h; (4)叶片材料在 13%甘露
醇溶液中质壁分离 30 min。预处理后的材料用上述试验得到
的最佳分离条件进行原生质体分离，试验结果与空白对照
比较。
1． 2． 5 数据处理 以上试验每个处理设置 3 个重复，结果用
“平均值 ±标准差”表示，做邓肯氏新复极差测验。
2 结果与分析
2． 1 不同酶液组合对原生质体分离的影响
由表 1 可以看出，纤维素酶(黑曲霉)酶解得到的原生质
体产量显著少于纤维素酶(绿色木霉)酶解得到的原生质体
产量。纤维素酶(黑曲霉)的酶解能力差，应选用纤维素酶
(绿色木霉)。由表 1 中处理 1 ～ 9 的试验结果可以看出，随
着纤维素酶(绿色木霉)浓度升高，原生质体产量相应增加，
浓度为 2． 0%时产量最高。果胶酶浓度在 0． 5% ～1． 0%之间
时，原生质体产量差异不显著;当果胶酶浓度由 1． 0%升高至
1． 5%时，原生质体产量有所下降;当果胶酶浓度由 0． 5%升
高至 1． 0%时，原生质体活力有所下降。综合考虑，原生质体
分离最佳酶液组合为:0． 5%果胶酶 + 2． 0%纤维素酶(绿色
木霉)。
表 1 不同酶液组合对 I． utricularioides叶片原生质体分离的影响
编号
果胶酶
浓度
(%)
纤维素酶
(绿色木霉)
浓度(%)
纤维素酶
(黑曲霉)
浓度(%)
原生质体产量
(万个 / g)
存活率
(%)
1 0． 5 0． 5 0 43． 89 ± 2． 00e 91． 57 ± 1． 49a
2 1． 0 0． 5 0 42． 78 ± 1． 47e 85． 27 ± 1． 20bc
3 1． 5 0． 5 0 39． 67 ± 1． 20f 84． 05 ± 1． 33cd
4 0． 5 1． 0 0 60． 55 ± 1． 47bc 89． 62 ± 1． 52a
5 1． 0 1． 0 0 59． 44 ± 0． 56cd 85． 52 ± 1． 24bc
6 1． 5 1． 0 0 57． 22 ± 1． 47d 82． 13 ± 0． 50cd
7 0． 5 2． 0 0 66． 67 ± 0． 96a 88． 61 ± 0． 70ab
8 1． 0 2． 0 0 65． 33 ± 0． 88a 83． 79 ± 1． 38cd
9 1． 5 2． 0 0 62． 33 ± 0． 88b 81． 08 ± 1． 37d
10 0． 5 0 0． 5 0． 00 —
11 1． 0 0 0． 5 0． 00 —
12 1． 5 0 0． 5 0． 00 —
13 0． 5 0 1． 0 1． 05 ± 0． 15g —
14 1． 0 0 1． 0 1． 27 ± 0． 05g —
15 1． 5 0 1． 0 0． 84 ± 0． 03g —
16 0． 5 0 2． 0 2． 72 ± 0． 15g —
17 1． 0 0 2． 0 2． 97 ± 0． 10g —
18 1． 5 0 2． 0 2． 55 ± 0． 05g —
注:表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P ＜ 0． 05)。下表
同。
2． 2 酶解时间对原生质体分离的影响
叶片材料在 0． 5% 果胶酶 + 2． 0% 纤维素酶(绿色木
霉)+ 13%甘露醇 CPW混合酶液中分别酶解 1、2、3、4、5 h。
由表 2 可知，随着处理时间的延长，原生质体产量有所提高，
但当处理时间由 4 h增加到 5 h时，原生质体产量反而下降。
酶解处理 4 h时原生质体产量最高，且与酶解处理 3 h处理差
异不显著。当酶解时间在 1 ～ 3 h 之间时原生质体存活率差
异不显著，但酶解时间由 3 h增加到 4 h时原生质体存活率下
降。综上所述，最佳酶解处理时间为 3 h。
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表 2 酶解时间对 I． utricularioides叶片原生质体分离的影响
编号
处理时间
(h)
原生质体产量
(万个 / g)
存活率
(%)
1 1 26． 11 ± 1． 11c 91． 03 ± 1． 93a
2 2 67． 22 ± 1． 47b 88． 76 ± 1． 35ab
3 3 78． 89 ± 2． 42a 90． 40 ± 1． 74a
4 4 79． 45 ± 1． 47a 84． 98 ± 0． 84bc
5 5 70． 00 ± 1． 67b 82． 97 ± 1． 18c
2． 3 甘露醇浓度对原生质体分离的影响
将叶片材料置于 0． 5%果胶酶 + 2． 0%纤维素酶(绿色木
霉)+甘露醇 CPW混合酶液中，酶解处理 3 h，甘露醇浓度设
置 5 个梯度(表 3)。由表 3 可知，甘露醇浓度为 11% ～ 13%
时原生质体产量较高，当甘露醇浓度由 12%升高至 13%时原
生质体存活率下降。故 11% ～ 12%为原生质体分离的最佳
甘露醇浓度。
表 3 甘露醇浓度对 I． utricularioides叶片原生质体分离的影响
编号
甘露醇浓度
(%)
原生质体产量
(万个 / g)
存活率
(%)
1 9 67． 78 ± 1． 47c 93． 90 ± 1． 11a
2 10 72． 78 ± 2． 00bc 94． 13 ± 1． 11a
3 11 78． 89 ± 1． 47a 93． 18 ± 0． 75a
4 12 77． 78 ± 2． 42ab 92． 98 ± 0． 86a
5 13 79． 45 ± 1． 47a 89． 64 ± 0． 77b
2． 4 预处理对原生质体分离的影响
将用于原生质体分离的材料分别进行了 4 种不同的预处
理(表 4) ，并在 0． 5% 果胶酶 + 2． 0% 纤维素酶(绿色木
霉)+ 11%甘露醇 CPW混合酶液中酶解 3 h。由表 4 可以看
出，各处理结果与对照之间差异不显著，表明预处理对拟堇花
兰原生质体的产量及存活率提高无影响或作用有限。
表 4 叶片材料预处理对 I． utricularioides原生质体分离的影响
编号 预处理方法
原生质体产量
(万个 / g)
存活率
(%)
1 黑暗预培养 78． 33 ± 0． 96a 91． 57 ± 1． 62a
2 抽真空 78． 89 ± 2． 42a 93． 05 ± 0． 74a
3 低温 76． 67 ± 1． 67a 92． 57 ± 1． 39a
4 质壁分离 80． 56 ± 2． 00a 92． 00 ± 1． 88a
5 对照 79． 44 ± 2． 42a 93． 62 ± 1． 18a
3 讨论与结论
获得高品质的原生质体是细胞融合、遗传转化、原生质体
培养等后续研究的必要前提，而酶的种类及浓度组合是影响
原生质体分离效果的重要因素。本试验对不同酶液组合的酶
解效果进行观察，发现不同来源的纤维素酶作用效果完全不
同，选择适宜的纤维素酶种类至关重要。试验表明，增加纤维
素酶(绿色木霉)的浓度可以显著提高 I． utricularioides 叶片
原生质体产量，且对原生质体活力影响不显著，在后续研究中
可以考虑适当增加纤维素酶(绿色木霉)浓度以进一步提高
原生质体产量。果胶酶通常含有 RNA 酶、蛋白酶等杂质，对
原生质体有一定的毒害作用，当果胶酶浓度过大时会降低原
生质体的品质。因此，在不影响原生质体产量及存活率的情
况下，果胶酶浓度应尽可能低。
酶解时间是影响原生质体品质的又一重要因素，酶解时
间短原生质体产量少，而酶解时间过长，则酶液的毒害作用导
致原生质体破损、存活率下降。在原生质体分离试验中，应掌
握好最佳酶解时间。
原生质体没有细胞壁，需要依靠外界溶液的渗透压来维
持其稳定性。外界溶液渗透压过低会导致原生质体膨胀破
裂，渗透压过高会导致原生质体过度失水皱缩，活力降低，影
响后续研究。本试验选用甘露醇作为渗透压稳定剂，探讨了
不同甘露醇浓度对原生质体分离的影响，发现选择适宜的甘
露醇浓度可提高原生质体的产量及活力。
黑暗预培养、抽真空、低温、质壁分离等预处理在石斛
兰［9］、拟南芥［10］、木薯［11］、洋葱［12］等多种植物的原生质体分
离过程中可提高原生质体的产量及活力。但在本试验中以上
4种预处理方法均未对 I． utricularioides叶片原生质体分离产
生影响，表明预处理对原生质体分离的影响在不同植物之间
差异较大。
总之，I． utricularioides叶片原生质体的品质受到酶液组
合、酶解时间、甘露醇浓度等诸多因素的影响。本试验通过对
一系列酶解条件的优化，得出如下结论:I． utricularioides 试管
苗叶片原生质体分离的最佳酶液组合为 0． 5%果胶酶 + 2．
0%纤维素酶(绿色木霉)+ 11% ～ 12%甘露醇 CPW 溶液，最
佳酶解时间为 3 h。
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