全 文 ：DNA条形码基因 ITS·ITS2 及 rbcL在苍耳属可采用相同的 PCＲ条件
胡伟毅，汪连军，盛志超 (连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042)
摘要 ［目的］为植物 DNA条形码标准基因筛选研究提供参考，减少植物 DNA条形码研究中的工作量。［方法］对 7种苍耳属植物 ITS、
ITS2及 rbcL基因采用相同的扩增条件( 95 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环; 72 ℃ 10 min，4 ℃保存) 。［结果］3种
DNA条形码基因同时成功扩增。［结论］这说明植物 DNA条形码基因中 ITS、ITS2及 rbcL的 PCＲ条件存在合并可能性。
关键词 DNA条形码;苍耳属; ITS; ITS2; rbcL
中图分类号 S459 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 16 －07070 －02
DNA Barcoding Genes ITS，ITS2，rbcL Adopting the Same PCＲ Condition in Xanthium
HU Wei-yi et al ( Lianyungang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang，Jiangsu 222042)
Abstract ［Objective］To provide reference for plant DNA barcoding standard gene screening，reduce workload of plant DNA barcoding re-
search． ［Method］DNA barcoding genes ITS，ITS2，rbcL were amplified in 7 species in Xanthium under the same PCＲ condition ( 95 ℃ 4 min;
94 ℃ 30 s; 52 ℃ 45 s; 72 ℃ 45 s］; 35 cycles: 72 ℃ 10 min; 4 ℃ storage) ． ［Ｒesult］The DNA barcoding genes ITS，ITS2，rbcL all can be
amplified successfully． ［Conclusion］This shows that the conditions for plant DNA barcoding genes ITS，ITS2，rbcL may be integrated．
Key words DNA barcoding; Xanthium; ITS; ITS2; rbcL
基金项目 江苏出入境检验检疫局科技项目( 2012KJ54) 。
作者简介 胡伟毅( 1984 － ) ，男，河北宣化人，硕士，从事港口外来有害生
物截获工作，E-mail: 94087540@ qq． com。
收稿日期 2013-05-10
植物 DNA条形码技术是针对植物基因组中的特定基因进
行片段扩增、测序发现其碱基变化规律的技术手段，该概念由
加拿大科学家 Hebert于 2003年正式提出［1］，该技术在动物的
CO1基因应用较为成熟，但由于 CO1基因在植物种中变化保
守，不能做到很好的区分作用，使得植物 DNA条形码技术的研
究重点，仍在通用基因片段的搭配、筛选上［2］。尽管如此，植物
DNA条形码技术还是在保护濒危物种、药品食品监督、中草药
资源鉴定及生态学调查等诸多领域起到了突破性的作用，发挥
了以前形态学研究所无法产生的威力［3］。在植物 DNA条形码
的研究中，ITS、ITS2、rbcL基因最为常用［4］，在不同研究中往往
都要进行大量的 PCＲ反应，但在实际研究中一般均采用不同
的 PCＲ条件［6 －7］，笔者在苍耳属3种基因的扩增中摸索出相同
的 PCＲ扩增条件，反映出植物 DNA条形码技术中 ITS、ITS2及
rbcL的 PCＲ条件存在合并可能性，如果该条件也同时能在其
他植物种类中应用，必会降低植物 DNA条形码技术中 PCＲ反
应的工作量及工作时间，同时也可为植物 DNA条形码标准基
因的搭配、筛选提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 7种苍耳属植物:北美苍耳(Xanthium chinese)、
苍耳(Xanthium sibiricum)、刺苍耳(Xanthium spinosum)、西方
苍耳(Xanthium occidentale)、巴西苍耳(Xanthium brasilicum)、
美丽苍耳(Xanthium speciosum)、宾州苍耳(Xanthium pensyl-
vanicum)。以上外来苍耳均为 2012年在进口大豆中截获，并
由中国检验检疫科学院鉴定的样本。
DNeasy Plant mini Kit、2 × Taq master mix、琼脂糖、gold-
enview I等试剂耗材。
ITS引物:
ITSf:5-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3
ITSr:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
ITS2引物:
ITS2f:5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3
ITS2r:5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3
rbcL引物:
rbcLf:5-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3
rbcLr:5-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3
以上各引物均由北京中美泰和公司合成。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA的提取。采用改良后的 DNeasy Plant mini Kit
试剂盒法提取 DNA:①将苍耳属样品用植剪剖开，将种子部分
放入研钵中研磨;②将研磨好的样品分别放入 2 ml 的离心管
中，加入 400 μl Buffer AP1及4 μl ＲNase A，摇匀，在65 ℃中进
行裂解 30 min;③在裂解液中添加 130 μl Buffer AP2，冰浴，继
续裂解 20 min;④将裂解液放入离心机中，14 000 r /min，5 min;
⑤将离心后的上清液添加入 QIAshredder spin column中，放入
离心机中，14 000 r /min，2 min;⑥将离心管中的液相层转移入
新的离心管中，添加 1． 5倍的 Buffer AP3 /E，混匀;⑦将 650 μl
混合液放入 DNeasy mini spin column 中，8 000 r /min，离心 1
min;⑧重复上一步直至混合液被处理完;⑨将 DNeasy mini
spin column放入新的 2 ml collection tube中，加入500 μl Buffer
AW，8 000 r /min，离心 1 min，弃去液相层;⑩再加入 500 μl
Buffer AW，14 000 r /min，离心 2 min，弃去液相层;瑏瑡将 DNeasy
mini spin column放入2 ml离心管中，加入100 μl Buffer AE，培
育 5 min后，8 000 r /min，离心1 min;瑏瑢重复上一步，可得到200
μl DNA样品，－20 ℃冰箱保存。
1． 2． 2 PCＲ反应体系与扩增条件。PCＲ反应使用中美泰和
公司 2 × Taq master mix进行扩增，反应采用 25 μl体系，包括:
DNA模板 3 μl，引物1 1 μl，引物2 1 μl，2 × Taq master mix 12． 5
μl，ddH2O 7． 5 μl。PCＲ扩增程序为:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，52
℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。
1． 2． 3 琼脂糖凝胶制备与电泳。称取 1． 5 g regular agarose
G-10于锥形瓶中，加入 100 ml ddH2O，2 ml 50 × TAE buffer，
责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(16):7070 － 7071
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.16.005
高火微波 4 min，将锥形瓶置于75 ℃水浴中5 min，加入10 μl
goldenview I，摇匀，静置10 min，倒于凝胶模具中，放置30 min
后使用。取 PCＲ产物 4 μl 点样电泳，100 V、45 min，将凝胶
放入凝胶成像系统拍照，得到电泳图谱。
注:1．宾州苍耳;2． 西方苍耳;3． 巴西苍耳;4．美丽苍耳;5．苍耳;
6．刺苍耳;7．北美苍耳;8．空白对照。
图 1 ITS基因扩增结果
注:1．宾州苍耳;2．西方苍耳;3．巴西苍耳;4．美丽苍耳;5．苍耳;6．
刺苍耳;7．北美苍耳;8．空白对照。
图 2 ITS2基因扩增结果
2 结果与分析
由 7种苍耳属植物的 ITS、ITS2及 rbcL电泳图谱(图 1 ～
3)可看出，在试验所用 PCＲ反应条件下，7种苍耳属植物均
注:1．宾州苍耳;2．西方苍耳;3．巴西苍耳;4．美丽苍耳;5．苍耳;6．
刺苍耳;7．北美苍耳;8．空白对照。
图 3 rbcL基因扩增结果
可成功得到扩增，特别是在 ITS及 ITS2区域的电泳条带较厚
实，说明该条件在 ITS及 ITS2区域有着很好的扩增效果。
3 讨论
扩增片段的选择对于植物 DNA条形码技术仍是瓶颈阶
段，ITS、ITS2及 rbcL可共用一个相同的 PCＲ条件，不仅可给
试验操作带来便利，也可为将来植物 DNA 条形码标准扩增
片段的选择提供指导意见。但是，由于研究范围所限，试验
仅局限在菊科苍耳属植物当中，在其他科属的适用性还有待
于进一步的验证。
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170741 卷 16 期 胡伟毅等 DNA条形码基因 ITS·ITS2 及 rbcL在苍耳属可采用相同的 PCＲ条件