全 文 ：　[收稿日期] 　2010-02-28;2010-08-14修回
　[基金项目] 　国家“ 863”计划课题“甘蓝型油菜类黄酮途径功能基因克隆及黄籽性状代谢工程研究”(2006AA10Z110和 2008AA10Z152);
重庆市科技攻关项目“油菜分子育种及品质检测技术研究”(CSTC 2009AB1030)
　[作者简介] 　闫　楠(1984-),女 ,在读硕士 ,研究方向:植物分子生物学。 E-mai l:y nyann an@126.com
　＊通讯作者:柴友荣。 E-mai l:chaiyourong1@163.com
遗传育种 ·种质资源·生物技术 [ 文章编号] 1001-3601(2010)09-0559-0001-04
芸薹属查尔酮合酶基因家族 RNA干扰载体的构建
闫 楠 , 刘 琼 , 马丽娟 , 柴友荣＊
(西南大学 农学与生物科技学院 , 农业部生物技术与作物品质改良重点实验室 , 重庆市作物品质改良重点实验
室 ,重庆市油菜工程技术研究中心 , 重庆 北碚 400716)
　　[摘　要] 采用 PCR法克隆芸薹属 CHS 基因家族的 RNAi片段 ,经 T-载体克隆并测序后 ,用特定的双酶切方案将其反义片段 、正义片段分别亚克隆到平台载体 pFGC5941M 的启动子与间隔区 、间隔区与终止子
之间 ,形成 RNAi载体 ,转化大肠杆菌 ,完成复合 PCR鉴定 ,然后转化根癌农杆菌 。结果表明:经测序 ,以甘蓝型油菜 BnCHS 1基因为模板克隆的芸薹属 CHS 基因家族的 RNAi片段 BCHS I 为 831 bp ,采用 Nco+
Aat和BamH +Xba分别将其反义和正义片段亚克隆到 pFGC5941M 中;经复合 PCR鉴定 , 11 814 bp 的
RNAi载体 pFGC5941M-BCHSI(简称 pBCHSI)构建成功 ,并获得了根癌农杆菌 LBA4404的工程菌株 。芸薹属 CHS 基因家族 RNAi载体的成功构建 ,将促进甘蓝型油菜 、白菜 、甘蓝等芸薹属物种类黄酮性状的研
究与修饰 。[关键词] 芸薹属;类黄酮;查尔酮合酶(CHS);RNA 干扰(RNAi);载体构建[中图分类号] S565.9 [文献标识码] A
Construction of RNA Interference Vector of Chalcone
Synthase Gene Family in Brassica
YAN Nan , LIU Qiong , MA Li-juan , CHA I You-rong＊
(Chongqing Center f or Rapeseed Engineering Technolog y , Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement ,
Key Laboratory of Biotechnology &Crop Quality Improvement , Ministry of Agriculture , College of Agronomy and
Biotechnolog y , Southwest Universit y , Beibei , Chongqing 400716 , China)
　　Abstract:The 831-bp RNA interference(RNAi)f ragment of Chalcone synthase(CHS)gene family in
Brassica was cloned by PCR and then the antisense and sense f ragments w ere inser ted into the promo ter-
spacer and spacer-termina to r of RNAi basic vector pFGC5941M using NcoI +AatI I and BamHI +XbaI
double digestions respect ively .T he compound PCR identification showed that the 11814-bp RNAi vecto r
w as pFGC5941M-CHSI (pBCHSI) and LBA4404 Agrobacterium tume f aciens st rain w as obtained
successfully , which can promote research and modif ication of f lavonoid t rai t in B rassica .
Key words:Brassica;f lavonoid;Chalcone synthase(CHS);RNA interference (RNAi);vecto r con-
st ruction
　　类黄酮物质是广泛存在的高等植物各种组织中
的次生代谢物 ,分为黄烷酮 、黄酮醇 、花青素苷 、原花
青素 、异黄酮等类型 ,具有多种植物生理学功能[ 1-3] 。
首先是形成植物的特征性着色 ,花青素苷使花和茎
叶显红色 、蓝色和紫色 ,黄酮醇 、橙酮则使花 、茎叶 、
种仁等显黄色 ,原花青素的聚合物(缩合单宁)则使
种皮显黑褐色[ 3] 。其次 ,类黄酮物质普遍具有保护
植物免受紫外线灼伤[ 5] 、抵御病原菌[ 6] 、防御害虫[ 7]
等防卫功能 ,尤其是豆科植物的异黄酮 ,是一类典型
的植保素[ 8] 。再次 ,类黄酮物质广泛参与植物的生
长发育 ,如异花授粉 、种子散播 、根瘤共生 、生长素极
性运输与侧向生长等[ 1-2 , 8] 。此外 ,黄酮醇 、花青素
苷 、原花青素 、异黄酮等多种类黄酮化合物对人体具
有抗氧化 、杀菌 、扩张血管 、抗癌 、抗哮喘 、类雌激素
等保健作用 ,提高农产品或药用植物中的这些保健
性类黄酮物质具有积极意义 ,但是有些作物的品质
改良则需要降低一些类黄酮物质的含量[ 1-2] 。
查尔酮合酶(Chalcone synthase , CHS)是植物
类黄酮途径的第一个关键酶 ,催化一分子 4-香豆酰-
CoA 与三分子丙二酰-CoA 缩合形成柚配基查尔
酮 ,然后用于合成各种类黄酮物质[ 9] ,因此 , CHS 影
响所有的类黄酮性状。CHS 基因经重复-歧化就形
成了基因家族 ,且家族成员常发生假基因化 、亚功能
化 、新功能化 、基因互作等遗传学效应[ 10] 。
十字花科芸薹属(B rassica)含有多种重要的农
作物 ,尤其是禹氏三角物种甘蓝型油菜(B .napus)、
白菜(B .rapa)、甘蓝(B .oleracea)、芥菜(B .juncea)
等 ,它们是重要的油料 、蔬菜或观赏园艺作物。类黄
酮物质影响芸薹属物种的多种重要性状 ,这些重要
的芸薹属作物均是典型的异花授粉植物 ,花中的黄
　贵州农业科学　2010 , 38(9):1～ 4　Guizhou Ag ricultural Science s
酮醇等可能是影响异花授粉的重要因素[ 11] 。黄籽
性状可赋予油菜籽种皮薄 、纤维素低 、饼粕和油色素
污染少 、饼粕蛋白质含量高等优点 ,是油菜的一个重
要优质性状 ,但油菜黄籽性状研究急需阐明黄籽机
理和开展分子育种[ 1 , 12] 。研究类黄酮途径是研究种
皮色泽性状的关键 ,比如拟南芥 CHS 基因突变后
就变成了黄籽 ,取名为透明种皮 4(tt4)[ 1-2] 。另外 ,
提高芸薹属蔬菜(大白菜 、甘蓝 、青菜 、榨菜等)中的
保健性类黄酮物质的含量[ 13] ,改进观赏性芸薹属植
物(羽衣甘蓝 、油菜花等)的色彩 ,提高芸薹属植物体
内的防卫性类黄酮物质含量等 ,也具有重要意义。
本课题组已完成了甘蓝型油菜 、白菜 、甘蓝的
CHS/ TT4基因家族各主要成员的克隆(待发表)。
本研究在此基础上 ,设计和构建了芸薹属 CHS/
TT4 基因家族的 RNA 干扰(RNA interference ,
RNAi)载体 ,将促进通过基因沉默技术来研究芸薹
属的类黄酮性状的机理和探索分子育种 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌菌株 DH5α、根癌农
杆菌菌株 LBA4404和含 BnCHS 1全长 cDN A的重
组 T-载体(pMD18-T-BnCHS1)均由本实验室提供 。
pMD19-T 载体购自大连宝生物(TaKaRa)。pF-
GC5941M 是本课题组最近改造而成的植物 RNA
干扰基础载体[ 14] 。
1.1.2 酶 、试剂盒及生化试剂 限制性内切酶为
Roche 产品;DNA 连接试剂盒和 λ-HindIII DNA
marke r购自 TaKaRa;Easy-Taq DNA 聚合酶及其
他 PCR试剂 、DL2000plus DN A marker 为北京全
式金产品;胶回收试剂盒 、小量质粒抽提试剂盒为上
海华舜产品;氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、
利福平(Rif)、链霉素(Str)等试剂购自上海生工;引
物合成和测序由上海英骏公司完成 。
1.2 芸薹属 CHS 基因家族干扰片段的克隆
提取 pMD18-T-BnCHS1质粒为模板 ,采用引
物组合 FBCHSI +RBCHSI进行扩增 , 50μLPCR体
系含 0.1μL 模板和 1 .5U TaqDNA 聚合酶 。PCR
扩增参数为:94℃预变性 2min;94 ℃变性 1min ,
60 ℃退火 1min , 72℃延伸 1min , 30个循环;最后于
72 ℃保温 10min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电
泳 、GoldView 染色后 ,切下目的条带进行胶回收 ,然
后与 pMD19-T 连接成重组载体 pMD19-T-BCH-
SI ,转化用 CaCl2法制备的 DH5α感受态细胞 ,经
Amp(100mg/L)抗性和 IPTG/X-gal蓝白斑筛选 ,
白色菌落的菌液采用 PCR鉴定(程序同上),送 2个
阳性克隆子测序。
1.3 芸薹属 CHS 基因家族 RNA 干扰载体的构
建与鉴定
用于载 体鉴 定的 引物 FBnPAP2I2 、RBn-
PAP2I2 、F35S3N 、ROCST5N 的序列见参考文献
[ 14] 。
取 pMD19-T-BCHSI 和 pFGC5941M 质粒 ,均
进行 N coI +AatI I 完全双酶切 ,电泳后分别回收反
义片段 BCHS IA 和开环的 pFGC5941M 骨架 ,采用
T 4DNA 连接酶将二者于 16 ℃连接 12h ,得到重组
质粒 pFGC5941M-BCHSIA , 转化 DH5α, 抗 Kan
(100mg/L)的单克隆菌液进行PCR鉴定 ,引物组合
为 F35S3N +FBCHSI 和 RBCHSI +RBnPAP2I2 ,
体系及程序同前 ,选取全阳性的克隆子提取重组质
粒 。
采用 BamH I +XbaI 分别对 pMD19-T-BCHSI
和 pFGC5941M-BCHSIA 进行完全双酶切 ,电泳后
分别 回收 正义片 段 BCHS I S 和 开环 的 pF-
GC5941M-BCHSIA 骨架 ,采用 T 4DNA 连接酶将二
者于 16℃连接 12 h ,得到重组质粒 pFGC5941M-
BCHSI(简称为 pBCHSI),将其转化 DH5α,采用复
合 PCR检测抗 Kan的单克隆菌液 ,全阳性的克隆
子含有 pBCHSI 。
1.4 工程菌株的获得
从鉴定无误的大肠杆菌单克隆提取 pF-
GC594 1M-BCHSI质粒 , 用液氮冷激法转化根
癌农 杆 菌 LBA44 04 (感 受 态 细 胞 制 备 同
DH5α), LB 平板 和单 克隆 菌液 均采 用 Kan
(100 mg/L)、Rif(40mg/L)和 Str(20 mg/L)三
重筛选 ,菌液 PCR鉴定同1 .3 ,阳性单克隆培养
后作为植物转化的工程菌株 。
2 结果与分析
2.1 芸薹属 CHS 基因家族干扰片段的克隆
以 pMD18-T-BnCHS1 质粒为模板 ,用引物组
合 FBCHSI +RBCHSI 进行扩增 ,得到与预期一致
的特异条带(图 1)。经胶回收 、TA 克隆 、转化
DH5α后 ,挑选菌液 PCR阳性的 2 个单克隆测序得
到的 BCHS I 为 831bp(图 1),与 BnCHS1 基因序
列(待发表)在对应区段完全一致 。
·2· 　　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2010 , 38卷
2.2 芸薹属 CHS 基因家族 RNA 干扰载体的构
建与检测
pMD19-T-BCHSI 经 NcoI +AatII 完全双酶切
后(图 2A),除 T-载体条带外 ,产生了与预期 817bp
一致的条带 ,另有一条 500 bp左右的杂带[ 14] ,特异
回收该 BCHS I 反义片段 , 记为 BCHS I A。 pF-
GC5941M 经 NcoI +AatI I 完全双酶切后 ,得到开
环的载体骨架(图 2B),将其回收 。BCHS IA 与 pF-
GC5941M 骨架连接 , 得到 pFGC5941M-BCHSIA ,
将其转化 DH5α,采用引物组合 F35S3N +FBCHSI
和 RBnPAP2I2+RBCHSI 对抗 Kan的单克隆菌液
进行 PCR鉴定 ,分别扩增出了与预期的 935bp 和
998 bp一致的条带(图 2C 和图 2D),说明 ,反义片段
以正确方向插入到启动子与间隔区之间 ,形成了中
间载体 pFGC5941M-BCHSIA 。
采用 BamHI +XbaI 对 pMD19-T-BCHSI 和
pFGC5941M-BCHSIA 质粒进行双酶切 ,前者产生
了与预期 829bp一致的正义片段 BCHSIS(图 2E),
后者产生了与预期一致的 pFGC5941M-BCHSIA
开环骨架(图 2F),将二者回收 ,连接重组 ,得到干扰
载体 pFGC5941M-BCHSI(简称为 pBCHSI),将其
转化 DH5α。抗 Kan单克隆菌液采用引物组合 FB-
nPAP2I2+RBCHSI 和 ROCST5N +FBCHSI 进行
检测 ,扩增出了与预期的 1012bp 和 950bp 一致的
条带(图 2G),说明 ,正义片段已按正确方向插入到
间隔区与终止子间。同时 , 对单克隆菌液还采用
F35S3N +RBnPAP2I2和 FBnPAP2I2+ROCST5N
进行 PCR ,再次验证反义片段和正义片段插入的位
置和大小 , 结果分别扩增得到与预期 1 102 bp 和
1 131 bp一致的片段(图 2H)。表明 , BCHS I A 和
BCHS IS 的插入大小和方向均正确 , RNA 干扰载
体构建成功(图 3)。
图 3 RNAi载体 pFGC5941M-BCHSI 的质粒图
　　Fig.3　The plasmid diag ram of RNAi vector
pFGC5941M-BCHSI
·3·　第 9 期 闫　楠 等　芸薹属查尔酮合酶基因家族 RNA 干扰载体的构建
2.3 重组载体转化根癌农杆菌及鉴定
提取 2 .2中鉴定正确的 DH5α单克隆的质粒 ,
采用冻融法导入根癌农杆菌菌株 LBA4404 ,获得抗
Kan 、Rif 和 Str 的菌落 ,抗性单克隆的菌液采用与
2.2一样的复合 PCR鉴定 ,取得完全一样的结果 ,
表明 ,干扰载体 pBCHSI 已成功转入到 LBA4404
中 ,载体结构保持完整 ,形成了工程菌株 ,可用于植
物转化。
3 结论与讨论
试验克隆了 831 bp的芸薹属 CHS 基因家族的
RNAi片段 BCHS I ,将其反义和正义片段亚克隆到
pFGC5941M 中 , 构建了 11 814 bp 的 RNAi 载体
pFGC5941M-BCHSI(简称 pBCHSI), 获得了工程
菌株 ,将促进甘蓝型油菜 、白菜 、甘蓝等芸薹属物种
类黄酮性状的研究与修饰 。
CHS 是研究最多的类黄酮基因 ,并已成功地用
于矮牵牛 、洋桔梗等植物的花色修饰[ 15-17] 。拟南芥
CHS 基因突变后种皮变成了透明种皮[ 1-2] ,说明 ,操
作 CHS 基因也可以修饰种皮色泽。由于 CHS 是
类黄酮途径的第一个关键酶 ,因此 ,推测对其操作同
样可以用于其他类黄酮性状的改良 。
RNAi是一种高效 、特异性强的基因沉默技术 ,
既可用于对植物基因家族不同成员进行分别沉默 ,
也可用于对整个家族进行有效沉默 ,在多倍体植物
基因功能研究和分子育种中同样有效[ 18] 。植物
CHS 通常以多基因家族的形式出现 ,本课题组此前
的研究证明了这一点 ,已克隆了甘蓝型油菜的 8 条
CHS 基因(BnCHS1 ～ BnCHS8)、白菜的 4 条
CHS 基因(B rCHS1 ～ BrCHS4)、甘蓝的 4条 CHS
基因(BoCHS 1 ～ BoCHS4)。BnCHS 1 ～ BnCHS8
分别来自 B rCHS1 、BoCHS1 、BrCHS2 、BoCHS 2 、
BrCHS3 、BoCHS3 、B rCHS4 、BoCHS4。3 个物种
的 16 条 CHS 基因之间在编码区的一致性为
82.5 %～ 100 .0%, RNA 干扰片段 BCHS I 与其
mRNA 的一致性达到 83 .0%～ 100.0%,因此 ,理论
上推测干扰载体 pFGC5941M-BCHSI 可用于甘蓝
型油菜 、白菜 、甘蓝等多个芸薹属物种的转基因 ,介
导整个 CHS 基因家族的高效沉默 。由于 CHS 基
因与非 CHS 基因之间在核苷酸水平上无显著同源
性 ,因此 ,该载体不会引起对 CHS 以外的其他基因
的非靶向沉默。
理论上来讲 , CHS 基因家族具有冗余性 ,但由
于CHS 是一个极重要的关键酶 ,所以 ,芸薹属 CHS
基因家族的冗余度如何 、是否有成员产生了功能上
的退化或异化 ,还有待于设计单个成员的特异性沉
默载体进行研究 。
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(责任编辑:彭　艳)
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