全 文 ：or f 224基因与芸薹属种间杂种雄性不育性的相关性
王永飞1 ,马三梅1 ,张鲁刚2 ,王　鸣2
(1. 暨南大学生物工程学系 ,广东 广州　510632;
2. 西北农林科技大学园艺学院 ,陕西 杨陵　712100)
　　摘要:or f 224是在甘蓝型油菜(Brassica napus)波里马(Po lima)胞质中发现的一个与细胞质雄性不育(Cy toplasmic
male ste rility , CMS)相关的线粒体基因. 大白菜(B. campestrisssp. pekinensis)CMS 系 CMS3411-7 是由 Polima 不育系和
大白菜自交系 3411-7 杂交后 , 以 3411-7 为轮回亲本经多代回交选育得到的. 以 CMS3411-7 为母本分别与小白菜(B.
cam pestrisssp. chinensis)自交系 S71 、大白菜自交系 K 1和菜心(B. campestrisssp. chinensis va r. utilis)自交系 B1杂交得到
3 个杂交种 CS71 、CK 1和 CB1 .以 CMS3411-7 、CS71 、CK 1和 CB1为材料 , 以 Po lima 为对照 ,利用多聚酶链式反应(Polymer-
ase chain reaction , PCR)技术与田间实验育性观察相结合的方法 ,研究了 or f 224 与几个芸薹属种间杂种雄性不育性之间
的相关性. 结果显示:在这 4 个材料中尽管均含有 or f 224 基因 , 但 CMS3411-7 和 CB1表现为雄性不育 , CS71和 CK 1表现
为雄性可育. 这就表明 , or f 224 虽是 CMS 的因子 , 但它必须和核基因进行互作才能发挥作用.
　　关键词:or f 224基因;细胞质雄性不育;PCR;芸薹属;杂种
　　中图分类号:S 634:Q 945　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-4315(2006)05-0036-04
The cor relation of the or f 224 gene with cy toplasmic male sterility of
several interspecific and inter-subspecific hybrids in the genus Brassica
WANG Yong-fei1 ,MA San-mei1 ,ZHANG Lu-gang2 ,WANG Ming2
(1. Department of Bio technolo gy , Jinan Univer sity , Guang zhou 510632;2. Co lleg e of H o rticulture , Nor thw est
Science and Technolog y Univ ersity of Ag riculture and Fo restry , Yang ling 712100 , China)
　　Abstract:or f 224 is a mito chondrial g ene discove red in Polima cy toplasm of rape seed (Brassica na-
pus),which is considered to be associated w ith cy toplasmic male sterility (CMS). CM S line CM S3411-7 of
Chine se cabbage(B . campestris ssp. pekinensis)was produced by cross pollination and repeated backcro sses
between Polima and Chinese cabbage inbred lines 3411-7 as recurrent male parent. Using CM S3411-7 as fe-
male parent , three F 1hybrids CS71 ,CK 1 and CB1 were derived f rom the cro ss o f CM S3411-7 w ith Pakchoi
(B. campestris ssp. chinensis)inbred line S71 ,Chinese cabbage inbred line K 1and flow ering Chinese cabbage
(B. campestris ssp. chinensis var. ut il is)inbred line B1 , respect ively. In this paper , using CMS3411-7 , CS71 ,
CK 1 and CB1as materials , Polima as control , the co rrelation of the or f 224 gene w ith cytoplasmic male steri l-
i ty of several interspecific and inter-subspecific hybrids in Brassica w as studied by means of PCR and pollen
fert ility obse rv ation. The results showed that all the four materials contained or f 224 gene , but CMS3411-7
and CB1 were male sterile , CS71 and CK 1were male ferti le. These results indicated that or f224 w as one of the
facto rs of CMS ,but or f224 must interact w ith nuclear gene to produce function.
　　Key words:or f 224 gene;cy toplasmic male steri li ty (CMS);PCR;Brassica;hybrid
作者简介:王永飞(1972- ),男 ,山西省壶关县人 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师.主要从事植物遗传育种与分子生物学的研究. E - mail:w yfmsm
@163. com
资助基金:暨南大学博士启动基金(编号:692016)和广东省重点科技攻关项目(编号:2002A2070605).
收稿日期:2005- 11- 25
2006 年 10 月
第 5 期 36～ 39
甘　肃　农　业　大　学　学　报
JOURNAL OF GANSU AGRICU LT URAL UNIVERSITY
第 4 1 卷
双 月 刊
　　细胞质雄性不育(Cy toplasmic male sterility ,
CMS)是一种不能产生有功能花粉的母性遗传性
状.它在杂种优势利用和研究核质互作方面具有重
要的理论和实际意义[ 1] . 波里马(Po lima)不育系是
由华中农业大学傅廷栋院士于 1972年在甘蓝型油
菜中发现的一种 CMS 胞质. 因其不育性彻底 、稳
定 ,现已在油菜及十字花科等蔬菜作物上得到了广
泛的应用[ 2] .近年来在 Polima 胞质中发现了一个可
能与不育性相关的基因 or f 224 , 序列分析表明 ,
or f 224是由线粒体基因 or f B 编码区 5′端的 174个
核苷酸和另外 501个未知来源的核苷酸组成 ,并和
atp6 基因共转录[ 3] .利用探针杂交试验和限制性酶
切图谱试验证实or f 224是唯一可能与Polima CMS
有关的区域[ 4] .但有关 or f 224与芸薹属种间杂种雄
性不育性之间的相关性研究 ,目前尚未见报道. 为
此 ,本文以大白菜 CMS 系 CMS3411-7和其保持系
3411-7及 3个种间杂种为材料 ,以 Polima不育系为
对照 ,利用 PCR技术与田间实验育性观察相结合的
方法 ,研究了or f224与几个芸薹属种间杂种雄性不
育性之间的相关性.
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料　Polima 由华中农业大学傅廷栋
院士提供;CMS3411-7和保持系3411-7由西北农林
科技大学园艺学院柯桂兰等选育[ 5] .
1. 1. 2　菌种和质粒　大肠杆菌(Escherichia coli)
DH 5α由热带作物生物技术国家重点实验室提供 ,
pGEM-T Easy 载体购自 Promega公司.
1. 1. 3　主要化学试剂及酶　限制酶和修饰酶购自
华美生物工程公司;X-Gal 、IPTG 购自 Promega 公
司;PEG8000 ,溴化乙锭购自 Sigma 公司.
1. 2　方法
1. 2. 1 　杂交种的获得及其田间育性观察 　以
CMS3411-7为母本 ,分别以小白菜自交系 S71 ,大白
菜自交系 K 1 、菜心自交系 B1为父本进行杂交 ,得到
3个杂交种 CS71 、CK 1 、CB1 .第 2年将 3个杂交种播
种于田间 ,按柯桂兰等[ 6] 的方法观察并记载其育性
情况.
1. 2. 2　大白菜和油菜及杂种 DNA 的提取 　挑选
成熟度好 ,饱满且表面光滑的种子.先用 70 %乙醇
处理 30 s ,然后用质量分数为 0. 1 % HgCl2消毒
15 min ,用无菌水冲洗 5次后 ,播于固体 MS 培养基
上.在 25 ℃, 16 h光照 ,光强 1 500 lx 条件下培养 2
周后 ,取 2. 0 g 幼嫩的叶片 ,用SDS法提取 DNA [ 7] .
1. 2. 3　寡核苷酸引物的设计合成及目的基因的扩
增　根据 L , HommeY等[ 3] 报道的 or f 224序列[ 8] ,
设计下列引物 , 由中国科学院微生物研究所在
ABI381型 DNA 合成仪上合成.
　　引物 1:5′GC T ↓CTAGA
XbaI
　ATG 　CCT 　
CAA　CTG　GA T 　AAA　T TCAC3′
　　引物 2:5′GC G↓AGCTC
SacI
　TCA 　GCG 　
AAA　GAG　ATC　AAG　GA TC3′
　　目的基因的扩增在 PE 公司生产的 480 型
DNA Thermal Cycle r扩增仪上进行[ 8] .扩增体系为
50. 0μL ,其中含有 10×Taq酶反应缓冲液 5. 0 μL ,
dNTPs(2. 5 mmol /L)5. 0 μL ,引物 (10 μmol /L)
2. 5μL ,模板 DNA 200 ng , Taq酶 3U , 加水补至
50. 0 μL ,再加 50. 0 μL 矿物油覆盖反应液. 94 ℃预
变性 5 min ,然后按 94 ℃1 min ,50 ℃1 min ,72 ℃
2 min的条件进行 35个循环.循环结束后再于72 ℃
下继续延伸 10 min.然后取 5. 0 μL 扩增产物在质
量分数为 1. 5 %的琼脂糖凝胶上电泳 , 电压为
5 V /cm ,电解缓冲液为 1×TAE(40 mmol /L T ris
- 乙酸 ,1 mmo l /L EDTA),凝胶中含有质量分数为
0. 05 %的溴化乙锭 ,以 PCR M arkers 作为分子量
标记 ,在紫外透射仪上观察照像.
1. 2. 4　or f 224的克隆和 DNA 序列测定　PCR产
物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后 ,将其克隆到
pGEM-T Easy 载体上并转化大肠杆菌 DH 5α经蓝白
斑选择 ,酶切鉴定 ,筛选出含有插入片断的重组质
粒.重组质粒经 PGE8000 纯化后 , 采用 ABI 公司
PRISM TM Ready Reaction Dye DexoyTM Terminato r
Cycle Sequencing 试剂盒反应 ,以 T7和 SP6为通用
引物 ,在 ABI全自动序列分析仪上进行了正反方向
测序[ 8] .
2　结果与分析
2. 1　大白菜异源胞质雄性不育 CMS3411-7和其保
持系 3411-7及 3个杂交种的选育
　　利用常规的育种方法来选育 CMS 系通常是由
37第 5 期　　　　　　　　　　　王永飞等:or f 224 基因与芸薹属种间杂种雄性不育性的相关性　　　　　　　　　　　　
亲缘关系较远的 2个亲本杂交和多代回交得到. 由
于油菜和大白菜都属于十字花科芸薹属 ,因此 ,柯桂
兰等[ 5] 以 Polima 胞质为供体 , 与大白菜自交系
3411 - 7 杂交后 ,再以 3411-7 为轮回亲本 ,经多代
回交后得到了含有 Polima 胞质的大白菜异源胞质
雄性不育系 CMS3411-7 ,3411-7就为其相应的保持
系.我国蔬菜育种家李家文[ 9] 将大白菜和小白菜分
为 2个亚种 ,而菜心列为小白菜亚种的一个变种.以
CMS3411-7为母本分别与小白菜自交系 S71 、大白
菜自交系 K 1和菜心自交系 B1杂交得到 3个杂交种
CS71 、CK 1和 CB1 .田间育性观察结果发现 , CB1表现
为雄性不育 ,CS71和 CK1表现为雄性可育(图 1).
　　油菜 Po lima不育系×大白菜 3411-7　CMS3411-7×小白菜 S71 　CMS3411-7×大白菜 K1 　CMS3411-7×菜心 B1
　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　F1 ×3411-7　　　　　　　　CS71 　　　　　　　　　CK1 　　　　　　　　　　CB1
　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　(雄性可育)　　　　　　　(雄性可育)　　　　　　(雄性不育)
　　　　　　　　　　F1BC1 ×3411-7
　　　　　　　　　　　　　↓(多代回交)
　　　　　　　　　　　CMS3411-7
　　　　　　　　　　　(雄性不育)
图 1　CMS3411-7 和 3 个杂交种的选育过程
F ig . 1　The breeding of CMS3411-7 and thr ee F 1 hybrids
2. 2　orf224基因的扩增
　　以 Polima 不育系 、CMS3411-7和 3411-7 及 3
个杂交种的 DNA 为模板 ,进行 PCR扩增 ,然后进
行电泳 ,发现除 3411-7外从其余 5个材料中都扩增
出了 680 bp左右的 DNA片段.
图 2　orf 224基因的 PCR扩增
F ig . 2　PCR amplification o f or f 224 gene
　　注:M 为 PCR Markers;1 为 Polima 不育系;2 为 CMS3411-7;3
为 3411-7;4为 CS71;5为 CK 1;6为 CB1 .
2. 3　PCR产物的克隆和 DNA序列测定
　　PCR产物的克隆 、测序结果表明 ,从 5 个材料
中扩增得到的片段序列均与报道的 or f224基因序
列[ 3 , 4] 完全一致 ,都是由 675 个核苷酸组成 ,编码
224个氨基酸组成的多肽.
2. 4　orf224与 CMS的关系
　　从以上研究结果可以地看出 , CMS3411-7及 3
个杂交种的 or f 224 是来源于 Po lima 胞质的. 虽然
在这 4 个材料中都含有 or f224 ,但 CMS3411-7 和
CB1表现为雄性不育 ,CS71和 CK 1表现为雄性可育.
这就表明 ,or f 224虽是 CMS 的因子 ,但它必须和核
基因进行互作才能发挥效果;也就是说 ,or f 224的
表达与否是受核基因控制的.在保持基因存在的情
况下 ,or f 224基因被表达 ,植株表现为雄性不育;在
恢复基因存在的情况下 , or f224 的表达受到抑制 ,
不育性的表型被抑制 ,表现为育性恢复.这种不育基
因的表达受到抑制的现象 ,在玉米的 T 型 CMS 基
因 or f13 上也有类似报道[ 10] .
3　讨论
　　目前关于 or f224引起 CMS 的可能原因主要
有 2 种假说[ 4] :一种认为 or f224 与其下游基因
atp6 的共转录减少了 atp6 转录而减少 A TP6蛋白
量 ,从而损伤了线粒体的正常生理功能 ,引起花粉败
育;另一种假说认为 or f 224 可能产生出一个毒性
蛋白 ,引起不育.但有关 or f 224如何引起 CMS 的机
制现在还不清楚. 为了确定 or f 224是否编码蛋白及
该蛋白质的性质 , 王迎春等[ 11] 将 or f 224 克隆到
PBV220载体上 ,研究or f224在大肠杆菌中的表达
情况 ,结果表明 , PBV220系统表达的特异蛋白虽然
用 SDS-PAGE检测不到 ,但重组菌株在诱导条件下
的生长受到了明显的抑制.检测不到特异蛋白的可
能原因主要有以下几个方面:
　　1)　or f 224可能产生出一种毒性蛋白 ,该毒性
蛋白影响了 PBV220系统的高效表达 ,从而产生的
38　　　　　　　　　　　　　　　　甘 肃 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　　　　　　　 　2006 年
特异蛋白很少;
　　2)　or f 224基因编码的蛋白质为不溶性的 ,该
蛋白质定位在细胞的不溶性膜组分中;
　　3)　or f 224基因编码的蛋白质产物极易降解 ,
或转录的 mRNA 极不稳定.
　　这些研究为确定 or f 224蛋白的生理功能提供
了实验证据.另外 ,我们构建了 or f224植物表达载
体[ 12] ,欲将 or f 224 转化到芸薹属植物中来研究
or f 224基因在植物体内的表达情况 ,这将为进一步
研究 or f 224基因的作用机制奠定基础.
　　致谢:本实验所用的油菜 Polima由华中农业大
学傅廷栋院士惠赠 ,在此深表谢意.
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39第 5 期　　　　　　　　　　　王永飞等:or f 224 基因与芸薹属种间杂种雄性不育性的相关性