全 文 ：芸薹属蔬菜作物的遗传转化研究进展
杨　龙天1 　徐碧玉2 　金志强2
(1　中 国 热 带 农 业 科 学 院 园 艺 所　海南儋州　571737;
2　中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室　海口　571101)
摘要　从再生体系的建立 、转化方法 、导入的外源基因以及植物基因型等方面介绍芸薹属蔬菜
作物遗传转化的研究进展 ,并对研究中存在的问题进行讨论。
关键词　芸薹属　蔬菜作物　遗传转化
中图分类号　S 63
　　大白菜(B .pek inensis Rupr)、小白菜
(B .chinensis L.)、芜菁(B .campestris var.
rapa L.)、甘蓝(B.oleracea L.)、菜心(B .
parachinensis Bailey)等在日常生活中的大
众蔬菜均属罂粟目(Rhoeadales)十字花科
(Cruci ferae)芸薹属(Brassica)作物。应用
常规育种方法进行品种改良已经取得较大
的成就 ,但这种方法因种质资源而受到限
制。植物基因工程技术在理论上可以突破
种的界限 ,在不同的种间实现优良目的基因
的转移 ,实现远缘杂交 ,从而为有效地改良
芸薹属蔬菜作物 ,实现品种的更新换代提供
了新的途径。此类作物的许多种对组织和
细胞培养技术较为敏感[ 1] ,因此其遗传转化
技术研究进展较快 。其中 ,农杆菌介导法 、
基因枪法 、显微注射法等转化方法应用广
泛 ,并且在多数种或变种上建立了转化体
系。但在转化过程中同时发现许多因素如
植物基因型 、转化受体 、农杆菌株系(染色体
背景 、毒性基因 、接种方法 、靶细胞的生理状
态及转化程序等)都对转化过程和转基因植
株的再生产生影响 。现就此方面的研究进
行概述 ,以期为芸薹属蔬菜作物的遗传转化
技术提供理论和技术的借鉴。
1　建立高效的转化体系
高效的转化体系是遗传转化的前提之
一 。尽管芸薹属蔬菜作物具有较好的组织
培养基础 ,但不同种 、变种 、品种之间因生态
型 、基因型不同而存在较大差异 ,而且外植
体种类 、年龄 、培养基的组成成分等多种因
素的影响也很大 。因此建立高效 、重演性强
的再生体系一直是芸薹属蔬菜作物遗传转
化研究的重点之一 。科研工作者为建立良
好的再生体系作了诸多有效的探索 。
1.1　基因型的影响
研究表明 ,甘蓝及其变种(B.oleracea)
较白菜种(B .Campestris)容易再生 ,白菜种
的菜心(B .parachinensis Bail)芽再生频率
低 ,易在愈伤组织上先形成根而抑制芽的生
第 9卷 第 1期　　　　　　　　　　华 南 热 带 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　2003 年 3 月
　Vol.9 No.1　　JOURNAL OF SOUTH CHINA UNIVERSIT Y OF TROPICAL AGRICULTURE　　Mar.2003　
成[ 2] 。Murata 等[ 3] 研究认为调控芽形成的
基因可能位于 C 基因组 ,故具有 C 基因组
的甘蓝(Var .capitata)和花椰菜(Var.
botryt is)容易再生 ,而缺少 C 基因组的大白
菜(B.campestris)等(具 AA 基因组)则困
难得多 。Narasimhulu S.B.等[ 4] 亦有类似
的报道 。Dunw ell[ 5] 的研究表明 ,在 3 种芸
薹属蔬菜作物中 ,大白菜(B .campestris)、
根用芸薹(B.napus)(具 AA 基因组)以及
甘蓝(B .oleracea),以大白菜的再生最为困
难。并且指出 ,子叶外植体的再生受培养环
境和植物基因型两种因子影响较大 ,而且后
者影响可以通过前者(培养基成分与激素)
进行调节 。Zhang F .L 等[ 6] 以从日本和中
国收集的 123份大白菜为材料的子叶外植
体诱导芽再生 ,发现芽的再生率变化范围相
当大 ,Gaokang45 、Tukikaze等 8个品种没有
再生芽 ,而 Huayang No.3 、No93-3等的再
生芽频率则高达 97.5%。
1.2　转化受体的影响
转化受体通常是植物的原生质体及外
植体组织(下胚轴 、子叶-子叶柄 、茎段 、叶
片)。目前研究较多的外植体主要是下胚轴
和子叶-子叶柄 。Pua E C[ 7] 用茎段和下胚
轴进行再生苗分化率的研究认为茎段再生
能力通常比下胚轴高 ,而 Damgaard[ 8] 的研
究认为子叶柄的转化率比下胚轴高。在共
培养期间进行了细胞学观察 ,发现子叶柄切
面上有广泛的细胞分裂活性 ,而在下胚轴切
面上却没有。同时外植体切面上愈伤组织
的快速拓展是成功转化的必要条件 ,而在愈
伤组织中具有转化和再生活性的只占少数。
子叶柄分化苗的速度比下胚轴快 ,这使得愈
伤的生长期缩短 ,并降低了转化细胞被其他
非转化愈伤的排挤。Moloney[ 9] 建立了一种
农杆菌高效转化方法 ,他认为子叶柄切面的
薄壁细胞具有高效再生能力 ,且很易受农杆
菌感染 ,无需外加乙酰丁香酮及附加外源毒
性启动子对毒性区进行诱导。利用子叶外
植体进行芽再生的报道较为广泛 , Minoru
M urata 等[ 8 , 10] , Hachey 等[ 1 1] , Narasimhulu
等[ 12] 都有报道 ,并且获得了转化植株 ,但转
化率极低。子叶外植体具有简便 、快速等优
点 ,但其再生株易为嵌和体 ,基因型也可能
是杂合的。Y.Xiang 等[ 13] 则利用下胚轴为
外植体 ,农杆菌介导 ,获得了转 BT 抗虫基
因的菜心(B .campestris ssp .prachinensis)
植株 ,并进行了 PCR扩增 , Southern印迹和
Western印迹检测 ,证明获得转化体。张鹏
等[ 14] 对菜心 3种外植体(子叶 、子叶-子叶
柄 、下胚轴)的再生能力研究表明 ,子叶-子
叶柄再生能力强 ,再生频率达 80%以上;子
叶切块反应次之 ,频率为 40%～ 50%;下胚
轴反应最为迟钝 ,愈伤组织大量增生并被以
根毛 ,难以分化出芽 。外植体插植使子叶柄
充分接触培养基 ,有利于芽的再生。而平放
的外植体常因膨大卷曲而不能充分接触培
养基 ,玻璃化而逐渐褐化死亡。4 ～ 5 d 苗
龄的子叶-子叶块具较高的再生能力。组
织学观察表明 ,子叶柄切口端较深层的皮层
微管组织的薄壁细胞的细胞质增浓 ,生长活
跃并进行旺盛分裂 ,致使切口端显著膨大。
由于分生细胞分裂而形成分生细胞团 ,与此
同时 ,分生细胞团以外的薄壁细胞分裂形成
少量愈伤组织 ,在附加AgNO 3 和ABA的培
养基上能促进分生细胞团的生长 ,抑制愈伤
组织的增殖 ,在分生细胞团未形成分生组织
前 ,愈伤组织生长占优势 ,但随着分生细胞
14　　　　　　　　　　华 南 热 带 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　　　　第 9卷
团的旺盛增殖 ,分生细胞团的生长逐渐取代
了愈伤组织增殖 ,且通过新形成的微管组织
与外植体微管组织相连 ,随后分生团的表面
形成了长有叶原基的不定芽 ,因此不定芽是
由外植体薄壁细胞启动 ,分裂后形成的分生
细胞团产生。外植体苗龄显著影响再生频
率 ,4 ～ 5 d 苗龄的其菜心发芽迅速;甘蓝和
花椰菜发芽慢得多 ,多采用 6 ～ 7 d 苗龄。
王志明等[ 15] 以甘蓝为材料发现 , 尽管苗龄
相差非常小 ,但对于下胚轴芽分化频率影响
非常大 ,5 d 苗龄时 ,再生频率仅18.07%,而
6 d 苗龄时则为 64.52%。另有研究表明 ,
极性是影响芽再生的重要因素之一。一般
认为 ,近根端容易产生根 ,远根端容易产生
芽。在花椰菜上也发现 ,下胚轴远根端容易
产生芽 ,且芽数量多 ,近根端芽再生较难 ,且
多产生在愈伤组织上 。钟蓉等通过对不同
品种不同外植体类型研究得出不同生长期
的无菌苗对芽的分化率有较大影响 ,说明外
植体的生理状态对转化效率也有关联。
1.3　激素影响
适当的激素配方是提高芽再生频率的
重要途径 。不同品种 、不同外植体对激素要
求差异较大。BA 和 NAA 是芸薹属蔬菜作
物转化中常用的激素 。Y.Takahata等采用
5.0 mg L BA +0.5 mg L NAA +2 mg L
AgNO3配方进行农杆菌介导的大白菜转化
时 ,转化率分别是 CR shinki 2.3%, Beijing
No.80 1.6%, Chihiri No.2.7%。一般认
为 ,BA 和 NAA 结合使用优于单独使用的
效果 。张鹏等在进行菜心离体植株再生频
率研究时发现 , 培养基中 BA 或者仅含
NAA 时 , 植 株 再 生 频率仅为 7.8%和
5.5%,两者同时使用再生频率提高 4倍 ,且
BA 2 mg L +NAA 1 mg L 为最佳激素配
比 。同时发现 , 培养基中附加 4 mg L
AgNO 3和 0.5 mg L ABA 时“49-19”菜心
再生频率高达 89%,与单独附加 AgNO 3 或
ABA相比都高。相应的组织学研究表明 ,
这一培养条件下愈伤组织的生长受到抑制 ,
同时促进分生细胞团分裂 , 直接形成不定
芽 。
1.4 　乙烯活性抑制剂的影响
乙烯在植株形态发育中起着重要作用。
乙烯活性抑制剂 AgNO3 、AVG 和多胺影响
芸薹属蔬菜作物的芽再生 。Palmer(1992)
研究表明 ,大白菜 R500只有在附加 AgNO 3
(10 mg L)的条件下 , 以子叶为外植体 ,才
能获得较高的芽再生频率 , Y.Takahata
(1998)则报道大白菜“Beijing New No.2”在
2 mg L AgNO3 存在时获得 84%的芽再生
率 。张松等研究指出 ,尽管生长素和细胞分
裂素对分化有重要作用 ,但不是唯一的控制
因素 ,AgNO3对愈伤组织的诱导影响不显
著 ,但随着浓度增高 ,愈伤组织的生根率下
降 ,芽分化频率大幅度提高。当 AgNO 3浓
度为 4 ～ 8 mg L 时 ,芽分化频率达 64.47 ～
71.86%,但当其浓度高于 12 mg L 时 ,对芽
分化产生抑制作用 , 产生畸性芽 。AgNO 3
之所以促进植物培养物的再生 ,主要因为起
了乙烯活性抑制剂的作用。植物组培过程
中产生的大量乙烯 ,影响多种芸薹属蔬菜作
物的分化发育。Ag+可以竞争乙烯作用部
位而促进器官发生和体细胞胚胎发生 。另
外 ,Ag+与乙烯及多胺的生物合成代谢有密
切关系 。乙烯抑制器官发生而多胺则促进
他们的发生 。乙烯的生物合成与多胺生物
合成中的重要酶 AOC 和 SAMDC 活性有
15第 1期　　　　　　　杨　龙天 等:　芸薹属蔬菜作物的遗传转化研究进展　　　　　　　　　
关 ,而 AgNO 3抑制乙烯在这方面的作用 ,从
而促进体细胞发生 。然而 Chi等研究认为
AgNO3 不是抑制乙烯合成 ,而是促进 ACC
合成酶和ACC 的积累 ,与 AVG的作用完全
不同。另外 ,也有研究认为 , Ag+在促进植
株再生上与多胺代谢无关 。Ag+抑制乙烯
活性 ,可能是通过竞争结合细胞上的乙烯受
体蛋白 ,起到组织或降低乙烯作用的效果。
因而关于 AgNO3 的作用机理有待深入研
究。
2　转化方法的确定
芸薹属蔬菜作物是农杆菌的良好宿主 ,
因此 ,农杆菌介导的遗传转化研究较为广
泛。农杆菌有根癌农杆菌和发根农杆菌两
种 ,前者称 Ti质粒 ,感染植株产生瘿瘤 ,后
者称 Ri质粒 ,感染植株产生毛状根。两者
的结构大致相似 ,均可使 T -DNA 插入植
物基因组从而使植物体发生转化并在细胞
中稳定存在 。Ti质粒在芸薹属蔬菜作物的
转化中已广泛作为导入外源基因的载体。
Y.Xing 等(2000)报道利用农杆菌介导 ,将
Bt (Baci llus thuringiensis)Cry1Ac 和
Cry1Ab基因整合到菜心基因组中 ,并获得
转基因植株 。Y.Xing等(2000)报道利用农
杆菌介导 ,以大白菜子叶为外植体进行转化
研究 ,经过组织化学进行 GUS 基因检测 ,
PCR扩增和 Southern印迹分析证明获得了
转化体 。Moloney(1989)报道用根用芸苔
(Brassica napus)的子叶外植体与农杆菌共
培养 ,对获得的植株进行点杂交(dot blot-
ting)检测到 NPTII 活性 , Southern杂交证
明获得转化株。周光宇(1978 ,1988)在开展
远缘杂交的基础上 ,提出 DNA 片段杂交假
说 ,该方法在芸薹属蔬菜作物转化研究中尚
未见报道。当前报道导入芸薹属蔬菜作物
的外源基因主要有:苏云金芽孢杆菌的 Bt
基因 ,病毒外壳蛋白基因 ,蛋白酶抑制剂基
因 ,雄性不育抑制基因等。这些基因的导入
为快速有效的进行芸薹属蔬菜作物的品种
改良提供了有效手段。其中应用苏云金芽
孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt基因)的抗虫
植物基因工程研究最为广泛 、最具潜力和应
用前景[ 16] 。
3　遗传转化过程中存在的问题
3.1　再生成苗率低
芸薹属蔬菜作物中组培基础较好的报
道主要集中在花椰菜 、甘蓝等几个种类上 ,
而大白菜 、小白菜 、菜心等作物由于基因型
的影响 ,芽分化频率极低 ,需要进一步研究
影响芽再生的诸多因素 ,以建立一个完善的
再生体系。
3.2　遗传转化率低
转化受体 、植株苗龄 、激素配比等许多
因素都影响转化结果 ,甚至由于转化受体的
生理状态不同 ,即使是同一作物其转化率也
存在很大差异 ,而使转化重复性差。如何提
高转化率 ,建立高效重复性好的转化系统仍
是研究重点 。
3.3　基因沉默
目前 ,限制转基因植物向商品化 、实用
化方向发展的一个重要因素就是转基因的
沉默。它与转基因在受体植物中甲基化状
况 、转基因的拷贝数 、插入位点等因素有关。
有效的防止转基因的沉默 ,提高转化率是建
立完善转化体系的重要研究内容。
3.4　转化株的性状变异
16　　　　　　　　　　华 南 热 带 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　　　　第 9卷
遗传转化植株性状变化除由无性变异
引起外 ,还由于外源基因的导入破坏了受体
基因的活性 ,影响了受体植株正常的代谢 ,
表型发生改变。所以应根据育种目标 ,积极
辅以杂交 、回交 、组培等育种手段 ,创造优良
性状 ,真正达到遗传转化的目标。
参 考 文 献
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17第 1期　　　　　　　杨　龙天 等:　芸薹属蔬菜作物的遗传转化研究进展　　　　　　　　　
The Progress of Genetic Transformation Research
on Brassica Vegetable Crops
Yang Yan
1 　Xu Biyu2　Jin Zhiqiang2
(1　The Horticulture Inst itute , CATAS , Danzhou , Hainan , 571737 ;　　　　　　　　　
2　National Key Biotec hnology Laboratory for Tropical Crops , CATAS , Haikou ,571737)
Abstract　This paper expounds the progress of genetic transformation research on brassica veg-
etable crops in terms of the const ruction of regeneration system , t ransformation techniques , ex-
ogenous genes and genotypes , and discusses some common problems that exist in the w ay of the
research.
Key Words　brassica　　vegetable crops　　genetic　　transformation
18　　　　　　　　　　华 南 热 带 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　　　　第 9卷