全 文 ：遗传 HEREDITAS(Beijing)20 (增刊):78 ～ 81 1998
海甘蓝与芸薹属属间杂交的研究①
王幼平　蓝乐夫　罗　鹏
(四川联合大学生物系 , 成都 610064)
摘　要　对海甘蓝和芸薹属属间杂交亲和性的研究发现 , 甘蓝型油菜和白菜型油菜与海甘蓝杂交存在受
精前不亲和 , 而芥菜型油菜与海甘蓝属间杂交杂种胚出现败育 。通过常规杂交 , 结合胚胎挽救方法 , 首次
获得芥菜型油菜与海甘蓝的属间杂种 。杂种的诱导率为 2.1%;花粉的育性很低 , 有活力的花粉平均为
18.5%;F1体细胞染色体数介于双亲染色体数之间 , 花粉母细胞具有 63I ;杂种 F1代的同工酶具有父本的
特征酶带 。
关键词　海甘蓝 , 芸薹属 , 杂交亲和性 , 属间杂种
中图分类号　Q37 , S635
Studies on the Intergeneric Hybridization Between
Genus Brassica and Crambe abyssinica
WANG Youping　LAN Lefu　LUO Peng
(Department of Biology , Sichuan Union University , Chengdu 610064)
　　海甘蓝与芸薹属同属芸薹族 (Brassiceae), 但前者为短角果 , 开白花 , 花小;而后者皆属长角果 , 多数开黄
花〔1〕 。本试验以海甘蓝为父本 , 分别与芸薹属的三大类型 (甘蓝型 、白菜型 、芥菜型)油菜进行广泛的杂交;通
过 ABF (aniline blue fluorescence)法来了解远缘杂交受精前的亲和性;对杂种进行胚胎发育各个阶段的观察 , 找出
属间杂交胚胎败育发生的时期和原因;并适时摘取正在发育的杂种子房进行离体培养 , 即通过胚胎挽救的方法 ,
首次获得了芥菜型油菜与海甘蓝的属间杂种幼苗 , 并进一步对所获的杂种幼苗进行了细胞学和同工酶的鉴定 。
1材　料　和　方　法
1.1 材料
　　父本海甘蓝 (C.abyssinica , 2 n=90)由美国农业部提供 , 经多年在成都试种 , 单株选育出的品系 。母本包括
芸薹属的三大类型 , 其中甘蓝型 (B.napus , 2n=38)“云油 31号” 由云南省农业科学院提供 , “文油 6号” 由四
川省农业科学院提供 。白菜型 (B.campestris , 2n =20)“凤仪油菜” 由四川省农业科学院提供 , “玉溪周永达”
由云南省农业科学院提供 。芥菜型 (B.juncea , 2 n=36)“泸州四棱油菜” 和 “棱角油菜” 由宜宾农业科学研究
所提供 , “南充油菜” 由本室所保存 。
1.2 方法
1.2.1 杂交的亲和性　　取开花前 2 ～ 5 d幼蕾进行杂交和自交 , 去雄 、授粉和套袋等操作方法与常规杂交育种相
同 。分别取授粉后 3 、 8 、 24h 、第 2和第 3d的雌蕊 , 每次每处理各取 2个花序约10枚 , 用FAA 固定 , 固定 24h后
保存于70%酒精中 。雌蕊用 6mol/L NaOH处理 12h , 水洗后用含 0.1mol/L KPOF4的 0.1%水溶性苯胺蓝溶液浸泡
1昼夜 , 然后在荧光显微镜下观察花粉的萌发 , 柱头乳突细胞的胼胝质反应和花粉管生长情况 。授粉后第 4 、 7和
① 国家自然科学基金资助的项目。
DOI :10.16288/j.yczz.1998.s1.025
10 d , 各取 5 ～ 10个子房 , 14 ～ 25 d分别取 5个子房中的胚珠 。并以各自母本自交为对照 。用 FAA 固定 , 然后转
入 70%酒精中保存 。采用常规石蜡切片方法〔2〕 , 厚度 8 ～ 10μm , 采用 PAS+爱氏苏木精方法染色 , 观察胚性细胞
发生及发育过程中多糖物质的分布与积累 , 观察胚和胚乳的发育及杂种胚的败育过程 。
1.2.2 胚胎挽救　　海甘蓝与芥菜型油菜杂交 1周后 , 油菜子房逐渐膨大 。取其角果消毒后直插于 MS + 2mg/L
IAA+0.5mg/L KT(激动素)培养基中 , 培养条件:日光照 12 ～ 16 h , 光强 2 000 lx , 温度 20 ～ 25℃。培养 4周后 ,
取出种子中的幼胚 , 置于MS+6 mg/L 6-BA +0.1mg/ L NAA 培养基中 。2 ～ 3周后 , 子叶伸长或长出丛生芽;转接
到MS+0.1 mg/L NAA+2mg/ L 6-BA , 一个月后即可分化出大量芽簇 , 然后用 MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-
BA培养基继代培养 , 待移栽前转接到 1/2 MS或 1/2 MS+0.5 mg/L IBA 生根培养基中 。
1.2.3杂种的鉴定　　(1)体细胞染色体数目的观察:取以上组织培养苗诱导出的根尖 , 用 0.002mol/L 8-羟基喹
啉水溶液预处理 4 h , 用卡诺氏液固定6 ～ 12 h , 压片前用 1 mol/L HCl于 60 ℃水解12 min。用改良苯酚品红染色 、
压片、镜检 , 统计 20个幼苗的根尖 。(2)花粉母细胞减数分裂的观察:取经体细胞鉴定 , 栽于大田的组培植株花
蕾 , 用卡诺氏液固定 12 ～ 24h , 1%醋酸洋红压片镜检 , 检查花粉母细胞减数分裂中期 Ⅰ的染色体行为 , 并统计减
数分裂四分体阶段四分体 、三分体 、二分体和单分体的频率 。(3)花粉形态观察:材料取自当年栽培植株的新鲜
花粉 , 用 Erdtman醋酸酐分解法处理〔3〕 , 用以制片供光学显微镜观察 , 每种花粉测量 20粒 , 取常见值和变化幅度 。
(4)花粉育性观察:在上午 10 ～ 12时 , 取将开花植株的花药 , 用荧光素二醋酸酯 (FDA)法在荧光显微镜下鉴定
花粉的育性 , 根据荧光反应 , 统计 500个花粉粒的育性 。(5)脂酶同工酶的研究:取栽培于大田的植株中幼嫩的花
蕾 , 放在预先冰冻的研钵中 , 加入 pH 8.0的缓冲液 (0.1 mol/ L Tris-HCl∶0.45 mol/L 蔗糖∶6 mmol/L 维生素 C∶6
mmol/L L-Cys∶2 mmol/L EDTA-NaF2∶14 mmol/L β-巯基乙醇)冰浴匀浆 。离心 (7 500 r/min), 取上清液用作电泳
分析 , 采用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳法 , 酯酶同工酶的染色方法见参考文献 〔4〕。Rf =酶带迁移距离/溴酚蓝迁
移距离 。
2实　验　结　果
2.1 芥菜型油菜×海甘蓝属间杂种的胚胎发育及异常
芥菜型油菜 (泸州四棱)与海甘蓝属间杂交能正常完成受精 , 但授粉后 4 d , 在随机检查的 20张制片中发现
只有 10%的卵已完成受精 , 多数卵未受精;已受精的卵体积开始膨大 , 细胞核极性加强 , 有的 2个极核开始融合 ,
少数已形成游离的胚乳核 。授粉 7 d后 , 卵细胞开始分裂 , 偶见 2细胞原胚的形成 , 基细胞还未分裂 , 游离的胚乳
核开始形成 。在授粉后第 10 d , 胚体为 2 ～ 4细胞的原胚 , 胚柄为 2 ～ 3细胞 , 游离的胚乳核分布在胚囊的中央 。有
的胚体开始退化 , 游离的胚乳核已解体 , 珠心组织已消失 , 珠被绒毡层开始退化 (图版 I , 1), 而此时自交胚珠心
组织发达 , 约 5 ～ 7层细胞 , 细胞中有丰富的淀粉粒 , 珠被绒毡层发育正常 。在授粉后的第 14 d , 正常发育的杂种
胚为 32 ～ 64细胞的原胚 , 大小为 21 ～ 42μm , 胚柄具 3 ～ 6细胞 , 胚乳细胞从珠孔端开始形成 , 合点端仍为游离核
状态 。授粉 18 d后 , 胚体为多细胞球形胚 , 大小为 63μm , 胚乳细胞由胚囊的边缘向内形成 (图版 I , 2);而自交胚
乳细胞的形成是在心形胚时期 (图版 I , 3);在个别胚囊中 , 还观察到精子在卵中没有完成受精的现象 。授粉 25 d
后 , 胚乳细胞开始解体 , 球形胚体开始退化 。
表 1对芥菜型油菜自交及其与海甘蓝杂交胚的发育状况进行比较 , 从中可发现杂种胚出现下列异常情况:对
于较早败育的胚囊中 , 胚在 2细胞原胚时 , 珠心组织开始解体 , 珠被绒毡层开始退化 , 胚在发育过程中呈饥饿状
态;对于较晚败育的胚囊中 , 杂种后代的胚要比自交胚的发育延迟 , 在 32 ～ 64 细胞原胚或球形胚阶段 , 胚体停止
发育 , 胚乳细胞要比自交提前 4 d开始形成 , 到授粉 25 d后 , 球形胚体开始解体 , 胚乳细胞开始退化;个别胚囊
中 , 授粉 18 d后还发现精子在卵中没有完成受精 。
79增刊 王幼平 等:海甘蓝与芸薹属属间杂交的研究
表 1　芥菜型油菜×海甘蓝及其自交胚的发育状况比较
授粉后天数(d) 芥菜型油菜自交 芥菜型油菜×海甘蓝
4
7
10
14
18
25
受精卵开始分裂 , 游离胚乳核形成, 分布
在胚囊中 , 呈彩带状。
2～ 4细胞原胚 , 胚柄具 2细胞。
4～ 8细胞原胚 , 胚体 14μm , 胚柄具 2细胞。
16～ 32细胞原胚 , 胚柄具 4～ 7细胞。
球形胚～ 心形胚 , 大小 115×147μm ,
胚乳细胞开始形成。
马蹄形胚 , 大小 0.15～ 0.33mm。
10%的卵受精 , 卵细胞受精后体积膨大 , 核端化 , 中央
有 2个或 1个已融合的极核
卵细胞膨大 , 偶见 2细胞原胚形成 , 游离胚乳核开始形成。
2～ 4细胞的原胚 , 胚柄具 2～ 3细胞 , 有的胚体开始退化。
多数胚停止发育, 约 10～ 20%的胚发育成 32～ 64细胞
的原胚 , 胚乳细胞开始形成。
多细胞球形胚 , 胚乳细胞由胚囊边缘向中央形成。
球形胚开始退化, 胚乳细胞开始解体。
2.2 杂种的获得
2.2.1 芥菜型油菜与海甘蓝远缘杂交角果的发育观察　　芥菜型油菜与海甘蓝远缘杂交 1周后油菜的子房开始膨
大 , 授粉 16 d后对角果的脱落率进行统计 , 发现棱角油菜×海甘蓝的脱落率最低 , 为 10.0%;南充油菜×海甘蓝
的脱落率最高 , 为 47.5%。授粉 25 d后所有的杂交组合角果基本脱落 , 脱落率高达87.2%～ 90.4%。这说明用传
统的方法无法得到芥菜型油菜和海甘蓝的属间杂种 。根据芥菜型油菜×海甘蓝远缘杂交的胚胎学观察 , 授粉后 14
d 32 ～ 64细胞球形胚时 , 胚体停止发育 , 因此大田所观察的结果和胚胎学的观察基本相符合 。
2.2.2 胚胎挽救　　取授粉 7 ～ 10 d后的油菜角果 , 直插于MS+2 mg/L IAA+0.5 mg/L KT 培养基中 , 1周后子
房体积逐渐增大 , 芥菜型油菜子房壁向外突出。培养约 30 d后 , 可见角果的外壁逐渐变黄 , 少数角果中有幼胚的
发育 , 泸州四棱油菜×海甘蓝约占 8.2%, 棱角油菜×海甘蓝为 22.5%, 南充油菜×海甘蓝为 9.4%, 从以上统计
结果可以看出 , 雌性亲本品种不同 , 通过组培幼胚的获得率也不同 。用解剖针轻轻划破种皮 , 取出幼胚 , 置于MS
+6mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中 , 培养 2-3周后 , 只有泸州四棱油菜×海甘蓝的幼胚子叶伸长或长出丛
生芽 (图版 Ⅰ , 4), 杂种诱导率为 2.1%, 其它组合中可能因幼胚发育等原因均未长出幼苗 , 即母本的品种不同 ,
对杂种的诱导率也有一定的影响 。
2.3 杂种的鉴定
2.3.1 杂种的形态特征　　杂种 F1在不同的生育阶段 , 其形态分别倾向双亲之一或介于双亲之间。幼苗期 , 杂种
幼苗的基叶似海甘蓝 , 卵圆形 , 后期叶子皱缩;现蕾期 , 杂种的现蕾期基本和母本同步 , 花蕾较母本小;开花期 ,
花为淡黄色 , 似母本 , 花药多数退化 , 杂种 F1子房细长;成熟植株形态 , 从成活的 1株植株来看 , 花葶第一次分枝
部位较低 , 约 5 cm , 和父本海甘蓝相似 (平均为 8 ～ 10 cm), 而与母本泸州四棱油菜 (平均为 10 ～ 15 cm)不同
(图版 I , 7);角果形态 , 杂种 F1开放授粉形成的角果为长角果 , 长约 2 cm , 和母本相似 (2.5 ～ 3.0cm), 但角果无
棱 , 每个角果只见 1 ～ 2颗种子 , 较大 , 褐色 , 而母本角果四棱 , 种子为 4行 , 15 ～ 23颗 , 亮黄色 , 较小 。
2.3.2 杂交后代的细胞学观察　　母本泸州四棱油菜的体细胞 2 n=36 , 父本海甘蓝的染色体数 2 n=90〔1〕 。我们
对杂交后胚培养获得的幼苗根尖进行了体细胞观察 , 统计了取自杂交后代组培幼苗的 20个根尖 , 所得幼苗的根尖
中约 85 %和母本体细胞染色体数相同 , 即 2 n=36 , 其中有 15%的幼苗染色体数介于母本和父本之间 , 即 2 n=63
(图版 Ⅰ , 5), 从 2n=63的个体的体细胞上初步可定为杂种幼苗 。
由于 F1未作任何加倍处理 , 因此其花粉母细胞的减数分裂MI , 预期的构型应为 63I 。取经体细胞鉴定为 2 n=
63的植株花蕾进行观察 , 多数减数分裂第一次分裂具有 63个单价体 (图版 Ⅰ , 6)。F1在四分体阶段形成不同频
率的四分体 (tetrads)、三分体 (triads)、二分体 (dyads)和单分体 (monads)。通过统计四分体约占 65%～ 70%、
三分体约占 15%～ 20%、二分体约占 5%～ 10%、单分体约占 5%～ 10%。
2.3.3 杂种 F1花粉形态和育性的观察　　亲本泸州四棱油菜的花粉赤道面观为椭圆形 , 极面观为 3裂圆形 , 大小
平均为 28.9 (26.3 ～ 32.6)×24.0 (20.0 ～ 28.4)μm , P/ E 值为 1.21 。海甘蓝的花粉赤道面观为近圆形 , 极面
80 遗　　传 HEREDITAS(Beijing)1998 20卷
观为 4裂圆形 , 大小为 23.3 (18.9 ～ 26.3)×25.0 (21.0 ～ 28.4)μm , P/ E 值为 1.07〔5〕 。杂种 F1花粉形态赤道
面观为近圆形 , 极面观多为 3裂圆形 , 4裂圆形约占10%～ 15%, 即具有父本海甘蓝的花粉类型 。F1花粉大小也不
等 , 变幅很大 , 大小为 22.8 (4.2 ～ 30.5)×22.1 (4.2 ～ 26.3)μm , P/E 值为 0.97。 F1花粉的活力较低 , 通过
FDA 测定 , 有活力的花粉约占 12%～ 25%, 平均为 18.5%。
2.3.4 同工酶的研究　　通过取幼嫩花蕾的脂酶同工酶分析 , 母本泸州四棱有 11条酶带 (Rf 值分别为 0.18 、
0.23 、 0.30 、 0.40 、 0.47 、 0.57 、 0.67 、 0.83 、 0.92 、 0.95和 0.97), 父本海甘蓝共有 7条酶带 (Rf值分别为
0.13 、 0.18 、0.23 、 0.57 、 0.63 、 0.67和 0.97), 杂种 F1花蕾的酯酶同工酶有 13条酶带 (图版 Ⅰ , 8), 其中 Rf值
为 0.13和 0.63是父本所特有 , 在 F1中表现出来 , 余下 11条酶带 , 如果不考虑酶带的染色强度 , 杂种 F1的酶带综
合了父本海甘蓝的特征酶带 , 这和前人报道的种间杂种的同工酶带是部分或所有亲本酶带的综合的结果相一
致〔6 , 7〕。
3讨　　论
在芸薹属植物中亲本基因型对种间杂交亲和性影响的研究有些报道〔8～ 9〕 , 但亲本基因型对属间杂交亲和性研
究甚少 。本文用海甘蓝作父本和芥菜型油菜杂交 , 其中南充油菜×海甘蓝和棱角油菜 ×海甘蓝远缘杂交表现出弱
的亲和性 , 而泸州四棱油菜×海甘蓝杂交时花粉管生长正常 , 能够完成受精作用 。因此 , 在进行远缘杂交时最好选
用不同品种作母本 。此外 , 在用 ABF 法鉴定远缘杂交亲和性时应观察授粉后第 1 d和第 2 d , 甚至第 3 d的雌蕊 ,
因为在远缘杂交时可能出现受精延迟现象 , 也就是在授粉后 3 ～ 4 d才可能完成受精 , 因此不要轻意对种间或属间
杂交的可交配性进行定论 。
芥菜型油菜自交胚乳细胞的形成是在心形胚时期 , 而海甘蓝与芥菜型油菜属间杂种的胚乳细胞是在 32 ～ 64
细胞原胚或多细胞球形胚阶段形成 , 要比自交提前4 d进入胚乳细胞时期 , 而且在短时期内就解体 , 这可能将导致
杂种胚和胚乳细胞之间的不协调从而造成杂种败育 。有人认为〔10 , 11〕 , 在不亲和的杂交中 , 胚乳发育不正常是杂种
胚败育的主要原因 , 胚乳发育的不正常具体表现在:游离胚乳核时期就开始退化或胚乳细胞不能形成;而本文观
察到杂种胚的胚乳细胞能够形成 , 且较自交提前形成 , 这和前人所观察的结果有所不同 。作者运用蕾期 (开花前
2 ～ 5d)授粉的方法来克服属间杂交的受精前不亲和 , 同时对早期败育的胚进行胚胎挽救来克服受精后障碍 , 首次
获得了泸州四棱油菜和海甘蓝的属间杂种 , 推测海甘蓝可能和芸薹属的 B染色体组 (n=8)有一定的亲和性 。由
于海甘蓝 n=45 , 染色体基数X=15 , 因此有可能 X=15是由7和 8这两个染色体组 , 或者是 8为基数通过非整倍
体 (aneuploid)而形成 。因此用所得的 “桥梁”杂种与双亲之一回交 , 可以期望创建异附加系 , 对于研究海甘蓝和
芸薹属染色体组间的亲缘关系 、物种的起源和进化等具有重要的理论意义 。
参　考　文　献
1　王幼平等.海甘蓝的初步研究.云南植物研究 , 1995, 17 (2):169～ 174
2　黄承芬等.生物显微制片技术.北京:北京科学技术出版社 , 1991
3　额尔特曼 G (中国科学院植物所古植物室孢粉组译).孢粉分析手册.北京:科学出版社 , 1978
4　北京大学生物系遗传学教研室编.遗传学实验方法和技术.北京:高等教育出版社 , 1983
5　王幼平等.芸苔族几种植物花粉形态的研究 , 云南植物研究.1996 , 18 (3):317～ 319
6　Coulthart M et al.Isozyme studies in Brassica.Electrophoretic techniques for leaf enzymes and comparison of B.napus , B.
campestris and B.oleracea using phosphoglucomutase.Can.J.Plant Sci., 1982 , 62:621～ 630
7　S ikdar S R et a l.Erussica , the intergeneric fert ilize somatic hybrid developed through protoplast fusion betw een Eruca sa tiva and B.
juncea(L.)Czern.TAG , 1990 , 79:561～ 567
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9　孟金陵.甘蓝型油菜与近缘种属杂交时花粉-雌蕊相互作用的研究.作物学报 , 1990 , 16 (1):19～ 25
10　孟金陵等.植物生殖遗传学.北京:科学出版社 , 1995
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1997-08-15收稿 , 1997-11-10修回.
81增刊 王幼平 等:海甘蓝与芸薹属属间杂交的研究