全 文 ：文章编号:1000-694X(2007)03-0466-03
沙拐枣属(Calligonum L.)7种植物总
DNA提取方法的改进及鉴定
　　收稿日期:2006 01 11;改回日期:2006 02 22
　　基金项目:国家自然科学基金重大研究计划(90302010);交通部西部交通建设科技项目(2003 318 362 32);甘肃省中青年基金
(3ZS041 A25 006);中国科学院西部之光项目共同资助
　　作者简介:晋玲(1974—),女(汉族),陕西韩城人 ,讲师 ,在读博士。主要从事荒漠植物研究。
　　＊通讯联系人:安黎哲(E-mai l:li zhean@l zu.edu.cn)
晋 玲1 , 2 , 李 鸣1 , 张 勇3 , 4 , 白蕾3 , 安黎哲1 , 3＊ , 陈拓1
(1.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 , 甘肃兰州 730000;2.甘肃中医学院,甘肃 兰州 730000;3.兰州大学生命科学
学院 , 甘肃兰州 730000;4.河西学院生物系 , 甘肃张掖 734000)
摘　要:摸索沙拐枣属(Cal li gonum L.)七种植物沙拐枣(Ca lli gonum mongolicum Turcz.)、泡果沙拐枣(C.j un-
ceum(Fisch.et Mey.)Endl.)、无叶沙拐枣(C.aphy l lum(Pall.)Gǜ rke)、红果沙拐枣(C.rubicund um Bge.)、心形
沙拐枣(C.cordatum E.Kor.ex N.Pav l.)、密刺沙拐枣(C.densum Bor szcz.)、乔木状沙拐枣(C.arborescens
Litv.)的总 DNA 提取方法并对 DNA 样品的纯度和浓度进行鉴定 , 对传统的 CTAB 法进行方法和材料的改进 , 开
展与总 DNA 相关的 PC R扩增和其他遗传学分析 ,并取得满意的结果。其结果对于沙拐枣属植物的有关研究提供
了有效的实验手段。
关键词:沙拐枣属;总 DNA;ISSR
中图分类号:Q943 文献标识码:A
　　蓼科沙拐枣属(Calligonum L.)植物主要分布
于亚洲 、欧洲南部和非洲北部的荒漠地区[ 1] 。在我
国沙拐枣属植物主要分布于西北干旱半干旱地
区[ 2] ,是荒漠地区植物群落的建群种 ,具有重要的生
态价值[ 3-7] ;其嫩枝可供牲畜使用 ,具有较大的经济
价值[ 8] ;果实美观 ,是沙漠中的一道美丽的风景 ,具
有较高的观赏价值。
高质量 DNA 的获得是进行分子生物学研究的
基础。植物总 DNA 的提取方法很多 ,但根据细胞
膜溶涨介质来分 ,可以分为CTAB法和 SDS 法。对
于多数植物常规的 CTAB法[ 8] 和 SDS 法[ 9] 可以有
效的提取供下游实验所用的总 DNA 。
常规的 DNA 提取方法多以叶片为提取材料 ,
由于沙拐枣属植物叶片退化 ,必须取植物的其他部
位进行实验 ,陶玲等报道用种子的胚为提取材料[ 3] ,
而沙拐枣属植物果皮坚韧 ,胚的量小 ,并不适于大量
多次提取 。因此 ,在进行沙拐枣属植物分子生物学
研究中 ,我们改用沙拐枣属植物的同化枝提取总
DNA ,材料易得 ,效果较好。在前人[ 9 -12] 工作的基
础上 ,通过反复试验 ,我们摸索出一种适合沙拐枣属
植物 DNA提取的方法 ,对分布于我国的多种沙拐
枣属植物的 DNA 进行了提取 ,取得了较为满意的
效果 ,提取的 DNA适用于 PCR扩增和其他遗传学
分析。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为沙拐枣(Calligonum mongol icum
Turcz.)、泡果沙拐枣(C.junceum (Fisch.et
M ey .)Endl.)、无叶沙拐枣(C.aphy l lum (Pall.)
Gǜrke)、红果沙拐枣(C.rubicundum Bge.)、心形
沙拐枣(C.cordatum E.Kor.ex N.Pavl.)、密刺
沙拐枣(C.densum Bor szcz.)、乔木状沙拐枣(C.
arborescens Li tv.),采集地点及生境见表 1。取新
鲜健壮嫩枝置液氮罐中 ,带回实验室在-70℃冰箱
中保存 ,供试验用 。
1.2　主要提取试剂配方
2×CTAB 缓冲液:2%CTAB ,100 mmol ·L-1
t ris HCl(8.0), 14 mol · L -1NaCl , 20 mmolED-
TA;2%β 巯基乙 醇;饱和 酚/氯 仿/异 戊醇
(24︰ 24︰ 1);氯仿/异戊醇(24 ︰ 1);异丙醇;
70%乙醇。
第 27卷　第 3期
2007年 5月 　　　　　　　 　　　　　　
中　国　沙　漠
JOURNAL OF DESERT RESEARCH
　　　　　　　　　　　　　V ol.27　No.3
May 2007
表 1　沙拐枣属 7 种植物采样点及生境资料
Tab.1　Sampling sites and habitat data of 7 species of Calligonum
编号 种 采样地 生境 纬度/N 经度/ E 采样时间
1 C.mongol icum 甘肃酒泉 荒漠 40°34′ 97°16′ 2004 10 12
2 C.junceum 甘肃民勤 沙漠 39°75′ 103°24′ 2004 08 10
3 C.cordatum 甘肃民勤 荒漠 39°75′ 103°24′ 2004 06 15
4 C.aph yl lum 甘肃民勤 荒漠 39°75′ 103°24′ 2004 06 15
5 C.densum 新疆吐鲁番 沙漠 40°51′ 89°11′ 2004 07 22
6 C.rubicun dum 宁夏中卫 沙漠 37°56′ 105°43′ 2004 07 18
7 C.arborescens 新疆吐鲁番 沙漠 40°51′ 89°11′ 2004 07 22
1.3　提取方法
取新鲜嫩枝 0.18 ～ 0.20 g ,于液氮中研磨后立即
加入2 mL 保温 65 ℃的 2×CTAB 提取液及 5μL β
巯基乙醇混匀 ,65 ℃保温 60 min(期间轻轻颠倒几
次);加入等体积的氯仿/异戊醇(24 ︰ 1)抽提 ,轻轻
颠倒混匀 , 12 000 r ·min-1 4℃离心 10 min;取上清 ,
等体积饱和酚/氯仿/异戊醇(24 ︰ 24︰ 1)抽提[ 8] ;
取上清 ,等体积氯仿/异戊醇(24︰ 1)抽提;取上清 ,
加入 2/3 体积的冰异丙醇(-20 ℃), 混匀后在
-20 ℃下放置 20 min;10 000 r ·min-1 4 ℃离心 10
min ,小心弃去上清液 ,加入70%乙醇配置的 10 mmol
·L-1NH4AC;10 000 r·min-14 ℃离心 10 min ,弃上
清后将沉淀吹干;50μL 1×TE溶解备用[ 3 , 8] 。
1.4　DNA 样品的鉴定
1.4.1　DNA样品的纯度及浓度
在紫外分光光度计(UV2501 ,岛津 ,日本)上测
定总 DNA在 230 nm 、260 nm 和 280 nm 处的吸光
值 ,根据 260 nm 与 280 nm 的光吸收比值及260 nm
与230 nm 的光吸收比值确定 DNA 纯度 。根据260
nm 处测定的光吸收值估测样品 DNA 的浓度(1.0
OD 260相当于双链 DNA 50 μg ·mL-1)。用 0.8%
的琼脂糖凝胶(EB ,0.5μg ·mL-1)电泳 ,估测 DNA
样品的纯度及浓度。
1.4.2　沙拐枣属植物 ISS R的 PCR扩增
以所得沙拐枣总 DNA 为模板 ,使用 ISSR通用
引物[ 13] 。利用 PE 公司 GeneAmp PCR 仪(9700
型 ,ABI , 美国)进行扩增 ,反应总体积为 25 μL:模
板 DNA 1μL ,引物(10 ng ·μL -1)各 1 μL , Tag 酶
(5 U ·μL-1)0.2 μL , PCR buffer(Mg 2+)2.5 μL ,
dN TPs(2.5 mM)2.0μL , ddH 2O 17.3μL.扩增
程序为:95 ℃8 min ,94 ℃30 s ,51 ℃40 s ,72 ℃1
min ,共循环 30次 ,之后 72 ℃延伸 7 min。扩增产
物在 5 V · cm-1电压 ,1.5%的琼脂糖凝胶(EB ,0.5
μg ·mL-1)中电泳 , 1 h 后用数码凝胶成像分析系
统观察结果并保存。
2　结果与讨论
2.1　提取方法
沙拐枣属植物嫩枝角质层较厚 ,在研磨材料时 ,
要加入液氮 ,充分研磨 ,使细胞壁充分破碎 。用嫩枝
提取总 DNA 较之用种子的胚 ,有材料易得 ,操作方
便等优点。在提取过程中 ,就所用提取材料的用量
大小进行了多次实验 ,常规的 CTAB法一般用干样
0.2 g 或鲜样 0.55 g 以上[ 8] ,我们分别用干样 0.1
g 、0.2 g 、0.3 g 、0.4g ,鲜样 0.2 g 、0.3 g 、0.5 g 、0.8
g 、1.0 g 的进行实验 ,结果显示在鲜样 0.2 g 左右的
用量时 ,所提取的总 DNA 纯度及质量较高 。β 巯
基乙醇为抗氧化剂 ,可以使多酚氧化酶失活 ,能有效
防止酚类物质被氧化。
2.2　鉴定方法
所提 DNA 经紫外分光光度计(UV2501 ,岛津 ,
日本)检测(表 2)得知 ,260 nm 及 280 nm 的吸光度
比值在 1.704 ～ 1.900之间 ,说明本实验所用方法得
到的 DNA 比较纯净 ,蛋白质 、酚类及多糖杂质去除
比较完全;260 nm 及 230 nm 的吸光度比值在2.000
～ 2.167之间 ,说明所提 DNA 中基本上没有盐及酚
等小分子物质存在。根据 260 nm 处的吸光度估算
DNA 的浓度 0.380 ～ 0.460 μg ·mL-1之间 。电泳
检测结果与分光光度计结果一致 , DNA 在电泳凝胶
上呈现清晰迁移率低而整齐的条带(图 1)。
表 2　沙拐枣属植物基因组 DNA纯度及浓度
Tab.2　Purity and concentration of genomic DNA
of 7 Calligonum species
材料
编号 OD 230 OD 260 OD280 OD260/230 OD 260/280
DNA 浓度
/(μg·mL-1)
1 0.022 0.046 0.027 2.091 1.704 0.460
2 0.021 0.045 0.025 2.143 1.800 0.450
3 0.018 0.039 0.021 2.167 1.857 0.390
4 0.019 0.038 0.020 2.000 1.900 0.380
5 0.023 0.048 0.026 2.087 1.846 0.480
6 0.021 0.043 0.024 2.190 1.792 0.430
7 0.020 0.045 0.023 2.250 1.957 0.450
467　第 3 期 晋 玲等:沙拐枣属(Calli gonum L.)7 种植物总 DNA 提取方法的改进及鉴定 　　　
图 1　7 种沙拐枣基因组 DNA
Fig.1　The genomic DNA of 7 species of Calligonum
2.3　沙拐枣属植物 ISSR的 PCR扩增
用本方法所提 DNA进行简单重复序列 ISSR的
PCR扩增 ,获得了清晰的带谱(图 2)。扩增片段大小
从200 bp 到1 200 bp不等。这表明用本方法提取所
得DNA质量较好 ,可以用于下游分子生物学实验。
图 2　7种沙拐枣叶绿体 DNA ISS R片段的 PC R扩增
Fig.2　ISSR sequence of 7 species in Calligonum by PCR
参考文献(References):
[ 1] 李安仁.中国植物志[ M ] .北京:科学出版社 , 1998:118-
119.
[ 2] 刘媖心.沙漠植物志[ M] .北京:科学出版社 , 1985:331-
439.
[ 3] 陶玲 ,刘志学 ,何兴东.用于 RAPD 分析的沙拐枣 DNA 提取
方法[ J] .中国沙漠, 2001 , 21(3):300-302.
[ 4] 高志海 ,崔建国 ,刘生龙 ,等.民勤沙区沙拐枣果实性状的变异
性研究[ J] .中国沙漠 , 1998 , 18(3):244-248.
[ 5] 彭鸿嘉 ,傅伯杰 ,陈利顶 ,等.甘肃民勤荒漠区植被演替特征及
驱动力研究[ J] .中国沙漠 , 2004 , 24(5):628-633.
[ 6] 杨自辉.民勤沙井子地区 40a 来荒漠植被变迁初探[ J] .中国
沙漠 , 1999 , 19(4):395-397.
[ 7] 刘金荣, 李艳 , 周静.沙拐枣果氨基酸分析[ J] .农垦医学 ,
2001 , 23(5):289-290.
[ 8] Murray M G , T hompson W F.Rapid isolation of high m olec-
u lar w eigh t plan t DAN [ J] .Nucleic Acids Research ,1980 , 8:
4321-4325.
[ 9] 曾杰 ,邹喻苹 ,白嘉雨 ,等.玩拗植物类群的总 DNA 制备[ J] .
植物学报 , 2002 , 44(6):694-697.
[ 10] 刘志学 ,陈妍珂.沙漠植物 DNA 快速提取方法[ J] .中国沙
漠, 1997 , 17(3):274-279.
[ 11] 张娟 ,张道远 , 尹林克.刚毛柽柳基因组 DNA 提取和 RAPD
反应条件探索[ J] .西北植物学报 , 2003 , 23(2):253-256.
[ 12] 丁晓东 ,吕柳新.从玩拗植物荔枝中提取基因组 DNA 技术的
研究[ J] .应用与环境生物学报 , 2000 , 6(2):142-145.
[ 13] Wolfe A D , Xiang Q Y , Kephart S R.Asses sing hyb ridi za-
tion in natu ral population of Pens temon(S crophulariaceae)u-
sing H ypervar iable inter sim ple sequence repeat (ISSR)
band s[ J] .Mol Ecol , 1998 , 7:1107-1125.
Preparation of Total DNA from Desert Plant Calligonum L.
JIN Ling1 , 2 , LI Ming1 , ZHANG Yong3 , 4 , BAI Lei3 , AN Li-zhe1 , 3 , CHEN Tuo1
(1 .Co ld and Ar id Region s Environmenta l an d Eng ineerin g Research Inst itute , Chinese Academ y o f Sciences , Lanzhou 730000 ,
Ch ina;2.Gansu Trad i tiona l Chinese Medicine Col lege , Lanzhou 730000 , Ch ina;3.S chool o f Li f e Science , Lanzhou Universi-
ty , Lanzhou 730000 , China;4.Depar tment o f Li fe S cience of H exi Col leg e , Zhang ye 734000 , Gansu , China)
Abstract:We introduced a better method which do best for the purity and concentration of total DNA of sev-
en Calligonum species:Calligonum mongolicum Turcz., C.junceum (Fisch.et Mey.)Endl., C.
aphyl lum (Pall.)G rke , C.rubicundum Bge., C.cordatum E.Kor.ex N.Pavl., C.densum
Borszcz., C.arborescens Litv..This method is an improved one upon material and method based on the
traditional CTAB method.The result showed that it could effectively eliminate the affection of secondary
materials to extracted total DNA from Calligonum , and is suitable for PCR of ISSR and other genetic re-
search.Also , it provides a reliable experimental method for relevant researches on Calligonum .
Keywords:Calligonum L.;total DNA;ISSR
468　　　　　　　　　　　　 　　　 中　国　沙　漠 　　　　　　　　　　　　　第 27卷