全 文 ：4种金丝桃属植物基因组 DNA提取及 RAPD分析
周 凤 1，张东旭 1，吕洪飞 2
(1. 山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009;
2. 浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)
摘 要: 目的 探究金丝桃属基因组 DNA的提取方法及用 RAPD分析的技术体系. 方法 采用改良的低 pH值高
盐法获得高质量的金丝桃属植物总 DNA，从 80个 10-mer随机引物中筛选出 12个，对 4种金丝桃属植物的基因组
DNA 进行 RAPD 分析. 结果 共产生了 330 条 DNA 片段，其中 218 条谱带具有遗传多态性，约占 66.1%. 结论
RAPD分析揭示 4种金丝桃属植物之间的 DNA指纹存在明显的种间差异，能为金丝桃属植物的分类鉴定提供遗传
学依据.
关键词: 金丝桃属 DNA提取 RAPD分析
中图分类号: Q943 文献标识码: A
第 26卷第 4期 山西大同大学学报(自然科学版) Vol.26.No.4
2010年 8月 Journal of Shanxi Datong University(Natural Science) Aug.2010
文章编号: 1674－0874（2010）04－0064－04
收稿日期: 2010-04-06
作者简介: 周凤(1964-)，女，山西侯马人，硕士，副教授，研究方向: 农业基础.
金丝桃属(Hypericum L. )隶属藤黄科，全世界
约 400余种，我国约有 8组 55种 8亚种，该属植
物产于全国各地，但主要集中于西南地区[1]. 金丝桃
属植物中含多种药用成分，如金丝桃素类、槲皮
苷、金丝桃苷、芦丁、黄烷酮醇类、黄酮类、咄酮
类、香豆素类和间苯三酚衍生物(贯叶金丝桃素)等[2].
近年来的研究表明，金丝桃属植物所含金丝桃素类
化合物具有抗抑郁、抑制中枢神经、抗病毒和增强
免疫功能，并具有显著的抗 DNA、RNA病毒作用，
可用于艾滋病的治疗，从而引起医药界的重视 [3].
本课题组曾发现金丝桃属植物的叶表皮微形态 [4]、
叶内部的分泌结构类型、分布密度、大小和位置[3]
以及红外光谱图[5]等存在较大差异，可用作金丝桃
植物的鉴别指标，然而用分子生物学手段鉴别金丝
桃属植物至今未见报道.
随机扩增多态性 DNA (random amplified poly－
morphic DNA，RAPD) 是 20世纪 90年代发展起来
的 DNA分子遗传标记技术，已被广泛地应用在药
用植物分类鉴别中[6-8]. 本研究试图以金丝桃属的 4
种植物为材料种，发展适于金丝桃属植物的总
DNA 提取方法及 RAPD 分析技术体系，以期为我
国金丝桃属植物种类鉴定和优良栽培种选育提供
基础数据.
1 材料与方法
1.1 植物材料
用于 DNA提取的叶片采自浙江师范大学学校
绿化科苗圃栽培的金丝桃属植物，分别是贯叶连翘
(H.perforatum L)、小连翘 (H.erectum Thunb ex Mur－
ray)、元宝草 (H.sampsonii Hance)、浆果金丝桃 (H.
androsaemum Linn).
1.2 总 DNA的提取
采用改良的低 pH值高盐法，步骤如下: ①取
新鲜植物叶片约 0.4 g，用 70% 酒精洗 6 s，用蒸馏
水清洗三次; ②把洗净的叶片于研钵中快速用液氮
研成粉末，将粉末转至 1.5 mL离心管中; ③加入 1
mL 预冷的提取介质 (100 mmol ／ L pH 4.8 NaAc，50
mmol ／ L pH 8.0 EDTANa2，500 mmol ／ L NaCl，2%
PVP，1.4%SDS，其 pH 为 5.5); ④置浮桥上 65 ℃
水浴保温 40 min，其间颠倒混匀几次 ; ⑤室温下
12 000 r ／ min 离心 15 min，弃沉淀. ⑥加入 2/3 体
积的 pH 4.8 2.5 mol ／ L Kac，混匀，0 ℃ 放置 30 min
沉淀蛋白质，4 ℃ 12 000 r ／min 离心 10~20 min，弃
沉淀; ⑦上清液加入 0.6倍体积的 -20 ℃预冷的异
丙醇.温和混匀后于 4 ℃沉淀核酸 2 h; ⑧4℃ 12 000
r ／min 离心 20 min，收集沉淀; ⑨用 750 μL无菌蒸
馏水溶解沉淀，并于 50 ℃ 水浴助溶; ⑩4 ℃ 12 000
r ／min 离心 10 min，弃不溶物. 上清液中加入 0.6倍
体积异丙醇，1/10体积 3 mol/L NaAc(pH 5.2)，混匀
后于 12 000 r ／ min 离心 10 min 收集 DNA; 輥輯訛500
μL 70% 乙醇洗涤沉淀. 空气干燥 5 min; 輥輰訛溶于 50
μL 0.1×TE缓冲液中; 輥輱訛加 3μL RNaseA混匀，并在
37℃下保温 30 min，分装后存于 4℃或 -20℃备用.
1.3 总 DNA的纯度检测
总 DNA纯度和质量的检验采用 0.8% 琼脂糖
凝胶电泳检验和紫外吸收检验 (紫外分光光度计:
Ultrospec 4000，UV/Visible Spectrophotometer)，测
定提取总 DNA样品 A260、A280值. 以 A260/ A280值估
测其纯度，以公式: 双链 DNA 浓度 (μg/μl)= A260/
0.020计算其浓度.
1.4 引物及其筛选
本试验所用的随机引物购自北京经科生物工
程有限公司，包括第 V组、第 W组、第 Y组和第
Z组共 80条引物，分别记为 OPV-01至 OPV-20，
OPW-01 至 OPW-20，OPY-01 至 OPY-20，OPZ-
01 至 OPZ-20. 任取一个模板，对所有引物进行
PCR扩增，根据扩增条带数的多少对引物做初步
筛选，筛选原则是扩增条带数多且条带清晰的
引物.
1.5 RAPD扩增反应
PCR 反 应 在 GeneAmp PCR System 2400
(PerkinElmer Corporation) 上进行，经预实验优化条
件后确定反应体系总体积为 25 μL: 10×PCR buffer
(500 mmol ／ L KCl，100 mmol ／ L Tris -HCl， 1.0%
TritonX-100)2.5 μL，引物 (8 pmol ／ L)2 μL，dNTP
(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 1 mmol/L)2.5 μL，模
板 DNA 1.7 μL (约含 DNA 100 ng /μL)，MgCl2(25
mmol/L)2 μL，Taq酶 0.3 μL (0.5 U/μL)，无菌水 14
μL，反应混合物用 16 μL石蜡油覆盖.
扩增反应的程序为: 94 ℃ 预变性 5 min，进入
40个 PCR循环 (94 ℃ 变性 60 s，36 ℃ 复性 60 s，
72 ℃ 延伸 90 s)，最后于 72 ℃ 延伸 5 min. 取扩增
产物 8 μL，加 2 μL 上样缓冲液，用含有 0.5 μg/
mL溴化乙锭(EB)的 1.4% 琼脂糖凝胶电泳检测，以
0.5×TBE为电极缓冲液，电压为 5 V/cm，稳压电泳
1.5 h. 电泳结果在 Pharmacia Biotech ImageMaster
VDS系统下观察、照相记录结果.
1.6 数据统计分析
根据扩增结果，计算多态位点百分率，按琼脂
糖凝胶同一位置上 DNA带的有无进行统计，有带
(包括弱带)的记为“1”，无带的记为“0”. 根据公式 S
=Nxy/(Nx+Ny)计算不同样本之间的相似系数，其中
S表示相似系数，Nxy为样本 x和样本 y共同具有
的分子量相同的 DNA 扩增谱带数，Nx 为 样本 x
的 DNA扩增谱带数，Ny为 样本 y的 DNA扩增谱
带数. 各样本间的遗传距离 P =1-S. 根据遗传距离
并利用 SPSS 13.0 统计软中的 Hierarchical Cluster
Analysis方法(Cluster method: Between-groups linkage;
Measure: Interval (Euclidean distance))构建聚类图.
2 结果与分析
2.1 总 DNA提取
紫外分光光度计测定的结果表明，提取的 4个
DNA 样本的 A260/ A280值在 1.85~2.0 之间，均适合
做 RAPD 分析，用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳对 4 个
DNA样本进行检测，只有个别样本有少许降解 (图
1)，说明本研究所有 DNA提取方法对金丝桃属植
物是有效的.
注: 1. 贯叶连翘; 2. 元宝草; 3. 小连翘; 4. 浆果金丝桃
图 1 总 DNA电泳图
2.2 随机引物的筛选和扩增结果
通过比较 RAPD 扩增效果，用贯叶连翘 DNA
样品对四组 80个引物进行初步筛选，有 48个引物
可以得到较清晰扩增产物，然后用这 48个引物对
四种植物的 DNA样品对 48个引物复筛，得到 12
个多态性较高的引物. 以这 12条引物对 4种植物
DNA样品进行 RAPD 扩增，共获得 330 条扩增产
物，每个引物的扩增条带为 13~42条，平均为 29.2
条，其中 218 条具有遗传多样性，约占总数的
66.1%，每个引物检测到的 RAPD 多态谱带不等，
从 10条到 26条，平均为 18.2条(图 2、表 1). 这表
明金丝桃属物种间个体间的 DNA多态性是比较丰
富的，因此，利用 RAPD标记在 DNA水平上检测
金丝桃属种间差异是可行的.
2.3 金丝桃属种间聚类分析
根据 12 个引物得到的 RAPD 标记，在 SPSS
13.0程序中计算任意两个物种间的 Nei-Li遗传相
似性系数(表 2)，根据遗传相似性系数进行 UPCMA
聚类分析，构建遗传关系树状图(图 2).
周凤等: 4种金丝桃属植物基因组 DNA提取及 RAPD分析2010年 ·65·
注:1. 贯叶连翘; 2. 元宝草; 3. 小连翘; 4. 浆果金丝桃
图 2 引物 OPW- 01扩增产生的 RAPD带型
表 1 金丝桃属植物 RAPD分析所用引物及其扩增结果
表 2 金丝桃属不同物种之间的遗传相似系数
注: 1. 贯叶连翘；2. 元宝草；3. 小连翘；4. 浆果金丝桃
图3 金丝桃属 4个不同样本 RAPD分析聚类图
3 讨论
3.1 总 DNA的提取
获得高质量的 DNA样品是进行分子生物学研
究的前提，DNA样品质量的好坏往往是分子生物
学下一步实验成败的关键. 目前植物基因组 DNA
的提取方法有 CTAB法、SDS法及蛋白酶 K 法等.
不同的植物材料，适合的提取方法也不同. 造成这
种现象的原因在于，不同的植物具有不同的细胞壁
结构，细胞的内含物如酚类、多糖、帖类等次生代
谢物质的含量差别很大. 这些内含物可以与 DNA
结合形成复合物，DNA被埋在这种粘稠的胶状物
中难以溶解，甚至产生不同程度的褐变. 因此，对
于不同的物种可能都需要寻找一套相应的最优提
取方案，以获得高质量的 DNA样品.
金丝桃属植物由于其组织细胞中含有大量的
多酚、多糖及其它次生代谢产物[9]，如果提取方法
选择不当，会使 DNA埋在这种粘稠胶状物中而难
以溶解[10]，从而干扰后续的操作. 许多研究者发现，
RAPD技术并非理论上所想象的那样“简便易行”.
一些植物体内的特殊内含物和次生产物 (如单宁、
脂质、多酚及色素类物质)直接影响 Taq酶的活性，
导致扩增失败. 因此，针对富含多酚、多糖等物质
的金丝桃属植物找出适宜的高纯度、大分子量 DNA
的高效提纯方法就显得十分必要. 本研究分别用
CTAB法、SDS法、普通高盐法和低 pH值高盐法对
金丝桃属四种植物叶片的总 DNA进行了提取，结
果发现 CTAB法和 SDS法不适于该属四种植物的
总 DNA的提取，基本上没有得到 DNA，普通高盐
法提取的总 DNA纯度不够好，但低 pH 值高盐法
很适合该属四种植物总 DNA的提取，用该方法得
到的 DNA纯度较理想，OD260/280值都在 1.85~2.0之
间. 用于 RAPD扩增得到的结果也比较好. 该方法
提取 DNA的得率高、试剂易得、步骤简单，不失
为提取金丝桃属植物 DNA的一种好方法. 金丝桃
属植物含多酚物质较多，高盐低 pH 值法采用 pH
5.5的酸性提取液避免多酚类物质电离化及进一步
氧化，同时利用 PVP结合酚类物质; 高浓度 K+ 利
于 SDS与蛋白质及多糖形成复合物，复合物经离
心或过滤除去. 与 CTAB法、SDS法相比，步骤少，
材料损失少，另一方面，通过延长 65 ℃ 水浴保温
和第一次用异丙醇沉淀 DNA的时间，可取得较高
得率，按每克鲜重叶片计，所获得的 DNA 在 1
500 μg以上. 高盐低 pH法的优越性还在于，不采
引物 序列(5’→3’)
扩增
带数
多态位
点数
多态位点
比率 ／%
OPV-09 TGTACCCGTC 37 25 67.6
OPV-13 ACCCCCTGAA 22 17 77.7
OPW-01 CTCAGTGTCC 29 21 72.4
OPW-02 TCGCAGGTTC 40 23 57.5
OPW-06 AGGCCCGATC 31 20 64.5
OPW-10 TCGCATCCCT 13 10 76.9
OPY-15 AGTCGCCCTT 42 26 61.9
OPY-16 GGGCCAATGT 30 20 66.7
OPZ-03 CAGCACCGCA 27 17 63.0
OPZ-05 TCCCATGCTG 13 13 76.9
OPZ-09 CACCCCAGTC 24 14 58.3
OPZ-15 CAGGGCTTTC 22 15 68.2
浆果金丝桃 小连翘 元宝草 贯叶连翘
浆果金丝桃 1.000
小连翘 0.185 1.000
元宝草 0.184 0.095 1.000
贯叶连翘 0.175 0.190 0.153 1.000
山西大同大学学报(自然科学版) 2010年·66·
用酚、氯仿等有毒试剂，不需 CTAB、SDS、酶等价
格较高的试剂，技术环节容易掌握.
3.2 RAPD分析
RAPD技术原理简单，操作简便，是目前众多
分子标记技术中应用最广的技术; 但随着 PCR条件
的变化，会出现不同的扩增结果，且一些试验也发
现 RAPD反应的不稳定性[11]. 影响扩增的主要因子
有 DNA 的模板含量和大小、Tsq 酶含量、Mg2+ 浓
度、dNTP浓度、热循环参数的设计及引物浓度等.
利用 12个引物对 4种金丝桃属植物的模板进
行 RAPD分析，研究了它们种间的遗传分化. 共获
得 218条扩增稳定、重复性好的扩增带，反映出金
丝桃属种间存在着丰富的遗传差异. 从表 2中我们
得到金丝桃属四种植物的遗传相似性系数在
0.095~0.190 之间，可见这些种之间的遗传距离都
比较远. 相对而言，贯叶连翘与小连翘亲缘关系较
近，元宝草与浆果金丝桃亲缘关系较近(图 3). 说明
用RAPD技术鉴别金丝桃属植物的亲缘关系是可行
的，这为进一步探究金丝桃属植物种属分类、物种
起源等奠定了技术和理论依据.
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Genomic DNA Extraction and RAPD Analysis of the Four Species in
Hypericum Linn.
ZHOU Feng1，ZHANG Dong-xu1，Lǖ Hong-fei2
(1. School of Agriculture and Life Sciences，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009;
2. School of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang，321004)
Abstract: Objective To investigate genomic DNA extraction methods and the technical system of RAPD analysis in Hypericum
Linn. Methods A low-pH and high-salt method to obtain high-quality total DNA of Hypericum Linn.，12 primers were screened from
80 10-mer random primers， and were used to analysis genomic DNA of four species of Hypericum Linn. Results Generated 330
DNA fragments，218 bands of which were polymorphic，accounting for about 66.1%. Conclusion DNA fingerprints of four species had
significant differences by RAPD analysis， these could provide genetic basis for taxonomic identifications of Hypericum Linn.
Key words: Hypericum Linn; DNA extraction; RAPD analysis
〔编辑 杨德兵〕
周凤等: 4种金丝桃属植物基因组 DNA提取及 RAPD分析2010年 ·67·