全 文 ：收稿日期：２０１１－０９－１６
黑龙江省两种金丝桃属植物ＲＡＰＤ反应的初步研究
孟令锴１，李洁２，高长久１
（１．牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 １５７０１１ ２．牡丹江医学院红旗医院）
摘 要：利用ＲＡＰＤ技术，对黑龙江省金丝桃属两种植物进行ＤＮＡ分子遗传标记鉴别，从３０种随机引
物中筛选出，对乌腺金丝桃、长柱金丝桃扩增具有较明显多态性的３种引物，进而从基因水平探讨其遗
传本质。结果表明：引物Ｓ７５、Ｓ７６、Ｓ８０可作为乌腺金丝桃、长柱金丝桃的高特异性引物，用这三种鉴别
引物对样品的ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应，经琼脂糖凝胶电泳，就可以准确鉴别。
关键词：长柱金丝桃；乌腺金丝桃；ＲＡＰＤ
Ｔｗｏ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ＨｙｐｅｒｉｃｕｍＲＡＰＤ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
Ｍｅｎｇ Ｌｉｎｇｋａｉ １，Ｌｉ Ｊｉｅ２，Ｇａｏ Ｃｈａｎｇｊｉｕ１
（１．Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｅｇｅ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５７０１１
２．Ｈｏｎｇｑｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ＲＡＰＤ，Ｗｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍｉｎ
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ ｂｙ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ．Ｆｒｏｍ ３０ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ，ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｏｆ
Ｈ．ａｔｔｅｎｕａｔｕｍＣｈｏｉｓｙ．，Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ．ａｓｃｙｒｏｎＬ．ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｎｄ
ｔｈｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｎａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓ７５，Ｓ７６，Ｓ８０ｃａｎ ｂｅ
ｕｓｅｄ ａｓ Ｈ．ａｔｔｅｎｕａｔｕｍＣｈｏｉｓｙ．，Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ａｓｃｙｒｏｎ Ｌ．ｏｆ ｈｉｇｈ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ，ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｐｒｉｍｅｒ
ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｃａｎ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ａｓｃｙｒｏｎ Ｌ．；Ｈ．ａｔｔｅｎｕａｔｕｍＣｈｏｉｓｙ；ＲＡＰＤ
金丝桃属（ＨｙｐｅｒｉｃｕｍＬ．）为藤黄科（Ｃｌｕｓｉａｃｅａｅ）。
该属全世界约有４００余种，我国有５５种，８亚种。该属
植物的一些种在国内外广为药用，主要用于治疗抑郁
症、肝炎、痢疾，有抗菌消炎、镇痛、收敛等功效。传统
中医药学认为其具有清热解毒、收敛止血、利湿之功
效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、风湿骨痛、口鼻生
疮等症［７］。国内外对该属植物的研究极为重视。黑龙
江省分布的乌腺金丝桃（Ｈ．ａｔｔｅｎｕａｔｕｍＣｈｏｉｓｙ．）和长
柱金丝桃（Ｈ．ａｓｃｙｒｏｎ Ｌ．）的研究较少，主要集中在原
植物形态、生药性状、显微特征及部分化学成分含量的
测定及分析等传统生药学领域。
在目前生药学研究中，主要应用形态学、组织学、
化学等物种特异性遗传标记特征，这些特征特别是以
形态学为基础的鉴别方法虽然有着简便、易行等优点，
然而有很多特征为生物体的遗传物质与外界环境及其
他多种因素共同作用的结果，他们在受遗传因素影响
的同时，也受到如土壤、气候、阳光等因素的影响，而
ＤＮＡ作为遗传物质，他保持着遗传特性，不受外界因
素影响，用ＤＮＡ遗传物质进行物种鉴定，具有准确性
和可靠性。为此，本研究对金丝桃属两种药用植物进
行ＲＡＰＤ反应的初步研究，旨在为黑龙江省金丝桃属
植物ＲＡＰＤ的有效鉴定奠定基础
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
取供试材料植株新鲜嫩叶片经硅胶干燥保存。乌
腺金丝桃：２０１１年７月采于黑龙江省牡丹江镜泊湖地
区。长柱金丝桃：２０１１年７月采于黑龙江省横道河地
区；ＰＣＲ扩增仪，Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＹＬＮ－
２０００凝胶成像分析系统，北京亚力恩机电技术研究
所；ＤＹＹ－８Ｂ电泳仪，北京六一仪器厂；ＤＵ－８００核酸蛋
白质分析仪，美国ＢＥＣＫＭＡＮ公司。
１．２ 试剂
随机引物（ｐｒｉｍｅｒ）、ＤＧＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、１０×ｂｕｆｆｅｒ、ｍｇｃｌ２、琼脂糖均购
自上海生工生物工程技术服务有限公司。
１．３ 实验方法
１．３．１ 基因组ＤＮＡ提取
采用北京鼎国生物工程技术服务有限公司生产的
０３
第１期（总第１１６期） 中 国 林 副 特 产 Ｎｏ．１（ＧＳＮＯ．１１６）
２０１２年２月 Ｆｏｒｅｓｔ Ｂｙ－Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｆｅｂ．２０１２
DOI:10.13268/j.cnki.fbsic.2012.01.009
植物基因组ＤＮＡ抽提试剂盒提取。
操作步骤：
第１步：组织≤０．５ｇ，液氮研磨，加入１ｍＬ溶液Ｂ，
反复摇均，室温５ｍｉｎ。
第２步：加入２．５ｍＬ溶液Ｃ，２０μＬ溶液 Ａ，充分
摇均，室温放置２０ｍｉｎ。
第３步：≥８０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ。
第４步：取上清，加入５０μＬ溶液Ｄ，≥８０００ｒｐｍ离
心１ｍｉｎ，弃上清。
第５步：加入８０μＬ溶液Ｃ，摇均，≥８０００ｒｐｍ离心
５ｍｉｎ，弃上清。
第６步：加入１ｍＬ溶液Ｅ，摇均，≥８０００ｒｐｍ离心
３０～６０ｓ，弃上清。
第７步：重复步骤６。
第８步：≥１２０００ｒｐｍ离心３０～６０ｓ，吸干上清，室
温敞开晾干约５～１０ｍｉｎ。
第９步：取２５０μＬ溶液Ｆ，摇均，４０～５０℃水浴３～
５ｍｉｎ。
第１０步：≥１２０００ｒｐｍ离心３０～６０ｓ，取上清，即为
ＤＮＡ。
１．３．２ 供试材料基因组ＤＮＡ检测
供试材料基因组ＤＮＡ 质量检测在ＤＵ－８００核酸
蛋白质分析仪上进行。取１μＬ的 ＤＮＡ溶液和９９μＬ
的ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ于石英比色皿中，混匀，以ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ为
对照液，测定波长２６０ｎｍ、２８０ｎｍ的ＯＤ２６０、ＯＤ２８０值，计
算ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的比值以得样品的纯度，并按总ＤＮＡ
含量（μｇ／ｍＬ）＝ＯＤ２６０×５０×１００，计算各样品ＤＮＡ的
浓度。
１．３．３ ＲＡＰＤ反应
反应总体积２５μＬ。依次加超纯水，１μｍｏｌ／Ｌ引
物，１０ 倍 ＰＣＲ 缓冲液 （１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．２），
２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓ，４０ｎｇ左右模板ＤＮＡ，１ＵＴａｑ酶。
扩增程序：
①１９３℃，２ｍｉｎ。
②２９３℃变性１ｍｉｎ，３６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸反
应１．５ｍｉｎ，４５个循环。
③７２℃，保温５ｍｉｎ，循环结束后反应产物置于４℃
保存。
１．３．４ 随机引物的筛选
从样本中选出具有代表性的且总ＤＮＡ质量相对
较好的样品作为代表，利用上文中得到的反应条件进
行ＰＣＲ扩增，在３０个随机引物中（１０ｂｐ）进行筛选，选
择具有稳定的、能扩增出具有多态性带的有效引物。
１．３．５ ＰＣＲ产物鉴定与记录
ＰＣＲ产物用１．５％琼脂糖凝胶电泳（在１×ＴＡＥ
中）分离与鉴定，在紫外透射仪上观察与照相，以
ＤＧＬ２０００为ＤＮＡ分子量标准。
２ 结果
２．１ 供试材料总ＤＮＡ的质量
ＤＮＡ 质 量 在 ＤＵ－８００ 上 测 定 ＯＤ２６０、ＯＤ２８０ 及
ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值及浓度。见表１。
表１ 供试材料基因组ＤＮＡ的紫外分析结果
样品名称 ＯＤ２６０ ＯＤ２８０ 浓度／（ｎｇ·ｍＬ－１） ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
乌腺金丝桃 ０．０４８ ０．０２５ ２４０ １．９２０
长柱金丝桃 ０．０５５ ０．０３０ ２７５ １．８３４
２．２ 引物筛选结果
图１ 部分引物筛选结果
注：１：空白、２：Ｍａｒｋｅｒ、Ｓａｎｇｏｎ引物３：Ｓ１０ ４：Ｓ７４ ５：Ｓ７５ ６：Ｓ７６
７：Ｓ７７ ８：Ｓ７８ ９：Ｓ８０
２．３ 供试材料基因组的部分指纹图谱
图２ 乌腺金丝桃、长柱金丝桃ＲＡＰＤ指纹图谱
注：０：空白１：Ｓ７５乌腺金丝桃；２：Ｓ７５长柱金丝桃；３：Ｓ７６乌腺金
丝桃；４：Ｓ７６长柱金丝桃；５：Ｓ８０乌腺金丝桃；６：Ｓ８０长柱金丝桃；７：
Ｍａｒｋｅｒ
由扩增图谱可知：Ｓ７５、Ｓ７６、Ｓ８０引物对乌腺金丝
桃及长柱金丝桃基因组ＤＮＡ扩增，图谱表明两种植物
均在２００ｂｐ左右有相同长度条带，同时也有不同的条
带出现，说明其在遗传上既具有相似性，又存在差异，
根据这些差异可以有效鉴别金丝桃属两种近缘植物乌
腺金丝桃及长柱金丝桃。如应用Ｓ７５乌腺金丝桃在
２０００ｂｐ左右有一ＤＮＡ谱带出现，而长柱金丝桃此条
带缺失，该条带的有无可以有效鉴别这两种近缘植物。
３ 结论
本课题研究结果显示，应用 ＲＡＰＤ方法可以准
确、快速、简便地鉴定中药，且只需很少量的样品就可
完成。引物Ｓ７５、Ｓ７６、Ｓ８０可作为乌腺金丝桃、长柱金
丝桃的高特异性引物，用这三种鉴别引物对样品的
ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应，经琼脂糖凝胶电泳，就可以准确
鉴别。
作者简介：孟令锴（１９８０－），男，黑龙江齐齐哈尔人，讲
师，硕士，研究方向：生药鉴定及品质评价。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍＬｋ７２０
＠１６３．ｃｏｍ。
１３
２０１２年 孟令锴等：黑龙江省两种金丝桃属植物ＲＡＰＤ反应的初步研究 第１期