全 文 ：李乃伟 ,李云龙 ,蔡小龙 ,等.4种(品种)冬青属植物组织培养的研究 [ J] .江苏农业科学 , 2010(6):73-75.
4种(品种)冬青属植物组织培养的研究
李乃伟 , 李云龙 , 蔡小龙 , 陆小清
(江苏省中国科学院植物研究所 /南京中山植物园 ,江苏南京 210014)
　　摘要:以 4个冬青属植物品种的腋芽为外植体 , 研究不同外源激素对冬青属植物离体快繁的影响 , 并筛选出适合
4种(品种)冬青属植物试管苗快繁的培养基。结果表明:(1)在初代培养试验中 , 4种(品种)冬青属植物污染控制难
易不同 , “金皇帝”阿尔塔冬青污染率最低 , 为 8.33%;(2)4种(品种)冬青属植物的继代增殖培养基不同 , 适合 “金皇
帝”阿尔塔冬青和 “金心”阿尔塔冬青的培养基为 MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05mg/L, 适合 “蓝少女”冬青和 “金
宝石”钝齿冬青的培养基为 MS+6-BA0.5 mg/L+IBA0.05 mg/L;(3)4种(品种)冬青属植物试管苗生根培养基为
1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4 mg/L, 平均生根率达 83.33%。
　　关键词:冬青属植物;组织培养;外源激素;增殖
　　中图分类号:S687.104+.3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)06-0073-03
收稿日期:2010-09-03
基金项目:江苏省科技基础设施建设计划项目(编号:BM2006104);
南京市科技计划项目(编号:201001051)。
作者简介:李乃伟(1983—),男 ,山东聊城人 ,硕士 ,研究实习员 ,主要
从事植物生物技术研究。 E-mail:linaiwei8828@163.com。
通信作者:陆小清 ,高级实验师 , 主要从事景观园林植物繁育研究。
E-mail:xqlu3312@ 163.com。
　　冬青属 (IlexL.)植物为我国长江流域以南的 、亚热带常
绿阔叶林中常见的树种 ,多为常绿阔叶树种 ,树姿优美 ,果实
通常红色光亮 ,可长期宿存 ,为良好的庭园观赏和城市绿化景
观植物 ,多数种类的叶厚而革质 ,大多耐寒能力强 [1 ] 。冬青
属植物的花多而密 ,为良好的蜜源植物;木材坚韧细致 ,可制
家具及雕刻等用;有些种类含有 β -香树脂型和齐墩果烷型
三萜酸与皂苷 ,并含有黄酮类 、香豆素类及木质素类化合物 ,
不少种类可作药用 [ 2-3] 。冬青属植物除具以上观赏等价值
外 ,还具有抗污染能力 [ 4 ] 。目前 ,冬青属植物品种无论是作
为盆栽观赏还是作为绿化 ,在国内的应用都还很少 ,具有广阔
的市场需求 。冬青属植物种子繁殖比较困难 , 扦插繁殖因
(品)种而异 ,彩叶品种较难扦插繁殖 ,很难满足市场需求 。
笔者选择 4种难以扦插繁殖的彩叶冬青属植物 ,进行离体培
养与快速繁殖研究 ,以期为建立工厂化育苗体系提供基础 。
1　材料与方法
1.1　植物材料
试验材料取自江苏省中科院植物研究所内生长健壮的冬
青属植物 ,有 4个品种 ,分别为 “金皇帝 ”阿尔塔冬青(Ilexal-
taclerensis“GoldKing”), “金心 ”阿尔塔冬青(Ilexaltaclerensis
“Lawsoniane”), “蓝少女 ”冬青 (Ilexmeserveae“BlueGirl”),
“金宝石 ”钝齿冬青(Ilexcrenata“GoldenGem”)。
1.2　试验方法
1.2.1　外植体消毒　取成年植株的新梢茎段 ,先用自来水流
水冲洗 30 min。然后在超净工作台上用 75%乙醇处理 10s,
再用 0.1%HgCl2溶液灭菌 15 min,无菌水冲洗 4 ～ 5次 。将
4种冬青属植物的外植体切成带顶芽和腋芽的 1.0 cm长的
茎段 ,接种到启动培养基 (MS+6 -BA1.0 mg/L+NAA
0.05 mg/L+GA3 1.0 mg/L+3.0%蔗糖 +0.7%琼脂 )上
培养 。
1.2.2　继代增殖　当顶芽和腋芽生长到 3 ～ 4 cm高的芽苗
时 ,将芽苗切成带腋芽的 1cm长的茎段 ,接种于含不同细胞
分裂素和不同生长素种类和浓度的增殖培养基上比较增殖
效果 。
1.2.3　无菌苗生根及驯化　将无根苗进行切割 ,接到不同生
根培养基上 , 30 d后统计生根率 ,当根长达到 1 cm左右时 ,打
开瓶盖炼苗 1周 ,然后用镊子从培养瓶中取出试管苗 ,洗掉根
部培养基 ,栽入灭过菌的泥炭和珍珠岩混合基质(3 ∶1)中 。
前期适当遮阴 ,保持空气湿度 , 20 d后统计成活率 。
2　结果与分析
2.1　4种(品种)冬青属植物无菌体系的建立
在相同的灭菌条件下 ,将外植体切成带顶芽和腋芽的
1.0cm长的茎段 ,接种于启动培养基 MS+6-BA1.0 mg/L
+NAA0.05mg/L+GA3 1.0 mg/L+3.0%蔗糖 +0.7%琼脂
上培养 , 7 d后统计污染情况 ,结果如表 1所示 。
表 1　4种(品种)冬青属植物接种 7d后污染率比较
品种 接种数(个)
污染数
(个)
污染率
(%)
“金皇帝 ”阿尔塔冬青 60 5 8.33
“金心 ”阿尔塔冬青 50 21 42.00
“蓝少女 ”冬青 45 23 51.11
“金宝石 ”钝齿冬青 60 35 58.33
　　注:污染率是在外植体培养 7 d后统计 ,污染率 =污染茎段数 /
原接种茎段数 ×100%。
　　表 1结果表明 , 4种(品种)冬青属植物材料的带菌量均
较大 ,且存在较大差异 。其中 , “金皇帝 ”阿尔塔冬青污染率
最低 ,为 8.33%,其余均超过 40%,最高的达到了 58.33%。
接种 15 d后 , “金皇帝 ”阿尔塔冬青和 “金心 ”阿尔塔冬
青的顶芽和腋芽开始萌动 , 40 d后长为 3 ～ 4 cm高的芽苗 ,
50 d后能长成 5 ～ 7cm高的芽苗 ,节间适中 ,叶片生长伸展很
开 ,适合大批增殖;但是 “蓝少女 ”冬青和 “金宝石 ”钝齿冬青
—73—江苏农业科学　2010年第 6期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.06.168
萌发较慢 , 30d缓慢萌发 , 60 d后形成 2 ～ 4 cm高的丛生芽
苗 ,但是节间很短 , 叶丛紧簇 , 不适合切割增殖 。改变
2个品种的培养基 ,降低了 6-BA的浓度 ,培养基变为 MS+
6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+3%蔗糖 +0.7%琼脂 ,
生长效果有较大改善 ,长势良好 。
2.2　细胞分裂素对 4种(品种)冬青属植物继代增殖培养的
影响
将诱导培养基上萌发的冬青无菌苗切成带 1个腋芽的小
茎段 ,转入新配制的不同继代增殖培养基中 ,进行不同的细胞
分裂素增殖效果试验 。对 4种冬青属植物进行 6 -BA、KT、
Zip3个处理的试验 ,每个处理分 4个水平 ,每个水平接种
30个茎段 ,结果如表 2所示 。
表 2　细胞分裂素对 4种(品种)冬青属植物增殖培养的影响
激素组
合编号
激素组合(mg/L)
6-BA KT Zip NAA
接种数(个) 增殖系数
金黄帝 金心 蓝少女 金宝石
1 0.30 0 0 0.05 30 2.17 2.27 2.37 2.23
2 0.50 0 0 0.05 30 2.87 2.77 4.40 3.97
3 1.00 0 0 0.05 30 4.33 4.07 3.33 3.00
4 1.50 0 0 0.05 30 2.30 2.00 2.37 2.17
5 0 0.50 0 0.05 30 2.40 2.13 2.00 2.30
6 0 1.00 0 0.05 30 1.87 1.57 2.13 2.00
7 0 1.50 0 0.05 30 1.67 1.57 1.60 2.10
8 0 2.00 0 0.05 30 1.60 1.60 1.60 2.23
9 0 0 0.50 0.05 30 1.87 1.77 1.97 2.37
10 0 0 1.00 0.05 30 2.07 1.93 2.20 2.67
11 0 0 1.50 0.05 30 1.77 1.60 2.00 2.80
12 0 0 2.00 0.05 30 1.57 1.33 1.40 1.83
　　注:增殖系数是在外植体继代培养 50d后统计 ,增殖系数 =增殖茎段数 /原接种茎段数。
　　试验结果表明 , 6-BA对外植体的增殖效果明显优于 KT
和 Zip,在 1.0 mg/L6-BA处理下 , “金皇帝 ”阿尔塔冬青和
“金心 ”阿尔塔冬青增殖系数达到最高 ,分别为 4.33和 4.07;
而在 2.0 mg/LZip处理下 ,增殖系数最低 ,分别为 1.53和
1.33。在 0.5 mg/L6-BA处理下 , “蓝少女”冬青和 “金宝石 ”
钝齿冬青增殖系数达到最高 ,为 4.40和 3.97;而在 2.0mg/L
Zip处理下增殖系数最低 , 为 1.40和 1.83。说明 , 在
0.5mg/L或 1.0mg/L6-BA培养基上的植株生长良好 ,并产
生大量丛生苗 ,其高度 、粗度以及节间距离均匀 ,且生长良好;
而在其余水平上 ,产生大量丛生苗 ,节间很短 ,且部分出现枯
死现象 ,不适于大规模繁殖 。对于其他 2种细胞分裂素 ,经过
KT处理生长的植株节间短 ,较矮 ,且部分不能生长 。经过 Zip
处理的 ,在较低浓度下 ,植株生长良好 ,高度和节间度均较理
想 ,生长势较强;但是 ,在较高浓度下 ,会出现生长不良 ,甚至
不生长 、不增殖的现象 。
2.3　生长激素对 4种(品种)冬青属植物继代增殖的影响
同时比较不同种类和不同浓度的生长素对 4种冬青属植
物无菌苗增殖的影响 , 每种生长素设置 3个浓度 , 分别为
0.03、0.05、0.08 mg/L,每个处理接种 30个芽 。各培养基中 ,
与生长激素组合的细胞分裂素为 6-BA, “金皇帝 ”阿尔塔冬
青和 “金心 ”阿尔塔冬青采用 1.0 mg/L浓度水平 , “蓝少女 ”
冬青和 “金宝石 ”钝齿冬青采用 0.5 mg/L浓度水平 。从表 3
可以看出 ,生长素浓度水平对不同冬青属植物无菌苗增殖的
影响不大 ,而生长素种类对 4种冬青属植物无菌苗增殖的影
响比较明显 。在 NAA激素处理下 , “金皇帝 ”阿尔塔冬青和
“金心”阿尔塔冬青无菌苗增殖效果优于 IBA和 IAA;在 IBA
激素处理下 , “蓝少女 ”冬青和 “金宝石 ”钝齿冬青增殖效果优
于 NAA和 IAA。在 0.05 mg/LNAA处理下 , “金皇帝 ”阿尔
塔冬青和 “金心 ”阿尔塔冬青无菌苗增殖系数最高 ,达到 3.50
和 3.33;在 0.05 mg/LIBA水平上 , “蓝少女 ”冬青和 “金宝
石 ”钝齿冬青增殖系数也达到了 3.50和 3.77。表明生长素在
一定浓度下能使植株生长良好 ,并通过调节与细胞分裂素等
激素的平衡影响增殖 ,而增殖阶段的主要影响因素仍是细胞
分裂素 。
2.4　生根培养
将增殖阶段培养的无根苗经过切分 ,接到含有不同浓度
IBA和 NAA的 1 /2MS生根培养基上 ,每个处理接种 30株无
根苗 ,约 20d后其切口周围出现白色愈伤组织的根状突起 ,
30 d后不定根陆续出现 ,统计生根率 、根数和根长 。观察发
现 ,在同一激素处理下 , 4种冬青属植物的生根效果差异不
大 ,各统计指标通过取 4种植物的平均值进行比较 。从表 4
可知 , IBA和 NAA处理均能促进冬青属植物无菌苗生根 ,但
以 NAA0.4 mg/L处理较好 , 4种植物平均生根率达到
83.33%,生根数达到 2.3条 /株 ,平均根长 9.0 mm;在 IBA处
理下 ,平均生根率最高仅为 20.00%。本试验还比较了基本
培养基 MS与培养基 1 /2MS对冬青属植物无菌苗生根的影
响 ,结果发现 ,培养基 1/2MS明显优于基本培养基 MS。
2.5　驯化移栽
当根长达 2.0cm左右时 ,打开瓶塞炼苗 1周 ,然后用镊
子从培养瓶中取出试管苗 ,洗掉根部培养基 ,栽入含泥炭和珍
珠岩的混合基质中 。前期适当遮阴 ,保持较高的湿度 ,成活率
达 90%。
3　讨论与结论
在无菌体系建立初期 ,外植体的污染率较高 ,这是影响离
体培养的关键因素之一 [ 5-6 ] 。 4个品种中 ,除 “金皇帝 ”阿尔
塔冬青外 ,其他几个品种的污染率都超过 40%,这对建立冬
青属植物无菌系不利 ,特别是一些难以获得的彩叶品种 。因
—74— 江苏农业科学　2010年第 6期
表 3　不同浓度生长激素对 4种冬青属植物增殖培养的影响
激素组
合编号
激素组合(mg/L)
6-BA NAA IBA IAA
接种数(个)
增殖系数
金黄帝 金心 蓝少女 金宝石
1 1.00/0.5 0.03 0 0 30 2.50 2.33 2.20 1.97
2 1.00/0.5 0.05 0 0 30 3.50 3.33 2.67 2.37
3 1.00/0.5 0.08 0 0 30 2.83 2.77 1.77 2.30
4 1.00/0.5 0 0.03 0 30 1.83 1.50 3.27 3.50
5 1.00/0.5 0 0.05 0 30 2.67 2.57 3.50 3.77
6 1.00/0.5 0 0.08 0 30 1.53 1.93 3.07 3.23
7 1.00/0.5 0 0 0.03 30 2.10 1.87 2.07 1.83
8 1.00/0.5 0 0 0.05 30 1.83 2.07 2.23 2.03
9 1.00/0.5 0 0 0.08 30 2.03 2.50 2.43 2.17
　　注:增殖系数是在外植体继代培养 50d后统计 ,增殖系数 =增殖茎段数 /原接种茎段数。
表 4　不同浓度 IBA、NAA对冬青属植物无菌苗生根的影响
激素组
合编号
基本
培养基
激素组合(mg/L)
IBA NAA
接种数
(株)
生根株数
(株)
生根率
(%)
根数
(条)
平均根数
(条)
平均根长
(mm)
1 1/2MS 0.05 0 30 3 10.00 3 1.0 1.0
2 1/2MS 0.10 0 30 5 16.67 6 1.2 1.0
3 1/2MS 0.20 0 30 5 16.67 7 1.4 1.5
4 1/2MS 0.40 0 30 6 20.00 6 1.0 2.0
5 MS 0.40 0 30 5 16.67 7 1.4 1.4
6 1/2MS 0 0.05 30 24 80.00 38 1.6 6.0
7 1/2MS 0 0.10 30 18 50.00 34 1.9 5.0
8 1/2MS 0 0.20 30 15 60.00 30 2.0 2.0
9 1/2MS 0 0.40 30 25 83.33 58 2.3 9.0
10 MS 0 0.40 30 20 66.67 42 2.1 5.0
　　注:生根率是在外植体生根培养 60d后统计 ,生根率 =生根茎段数 /原接种茎段数 ×100%。
为冬青属植物系高大乔木或灌木 ,有较强的顶端优势 ,顶芽粗
壮 ,但其幼嫩茎段组织疏松 ,髓部较大 ,经表面灭菌处理后 ,伤
口易氧化变褐 ,导致接种后整个外植体褐变死亡 。为提高外
植体芽萌发率 ,以当年抽生的枝条作外植体较好 ,萌发快 。较
老的枝条虽不易发生灭菌伤害 ,但易褐变 ,易污染 ,难以获取
无菌材料;较嫩的枝条易获得无菌材料 ,但易受灭菌剂的影响
而褐变死亡 。因此 ,必须根据材料的生长状态确定灭菌时间 ,
同时注意接种过程中无菌和正确操作 ,以提高无菌材料诱导
的成功率 。
在诱导阶段 ,不同树种的腋芽萌发速度有较大的差异 ,即
不同的树种对生长调节剂的浓度要求不同 ,如当 6-BA浓度
是 0.5 mg/L时 , “金皇帝 ”阿尔塔冬青和 “金心 ”阿尔塔冬青
萌芽很快 ,但 “蓝少女 ”冬青和 “金宝石 ”钝齿冬青萌芽缓慢;
将 “蓝少女 ”冬青和 “金宝石 ”钝齿冬青的培养基中 6 -BA浓
度调整为 0.3 mg/L,结果生长效果良好 ,节间变长 ,叶片舒
展 。在启动培养基中添加 GA3 ,主要是为了促进芽萌发 ,获得
较好的萌发效果 [ 7] ,但增殖培养阶段须去除 GA3 ,否则植株生
长过于旺盛 ,甚至出现异常 。
在生根培养阶段 , NAA是较理想的生长调节剂 ,随浓度
升高至 0.4mg/L,生根率 、根数和根长均提高 。此外 ,降低盐
浓度也能促进根系发生 [ 8-10] , 1/2MS培养基生根率高于 MS
培养基 。
通过本试验研究 ,初步建立了冬青的离体快繁体系 。与
常规扦插育苗相比 ,提高了增殖速率 ,突破 1年只能繁殖 1次
的障碍 ,对于冬青属优良树种规模化生产和推广具有重要的
实践指导意义 。
参考文献:
[ 1]中国科学院中国植物志编委会.中国植物志:第 45卷第 2分册
[ M].北京:科学出版社 , 1999:1-62.
[ 2]李　睿 ,温志忠 ,鲁琛琛 , 等.冬青叶中黄酮类化合物提取工艺
[ J].应用化工 , 2009, 38(3):412-414.
[ 3]刘　勇 ,刘贤旺 , 胡小芬.江西冬青属药用植物资源及其利用
[ J].江西林业科技 , 1997(6):23-25.
[ 4]陆小清 ,张衡峰 ,汤庚国.7种(品种)冬青属植物对苯气体胁迫
的反应 [ J] .林业科技开发, 2008, 22(3):54-58.
[ 5]吕校石 ,杨建民 ,刘云强 ,等.椴树组织培养中污染控制技术初步
研究[ J] .河北林果研究 , 2004, 19(1):1-5.
[ 6]李　贵 ,李　菁 ,黎有有 ,等.蛇足石杉外植体表面消毒及内生菌
消除方法 [ J] .吉首大学学报:自然科学版, 2009, 30(4):100-
103.
[ 7]高新一 ,王玉英.植物无性繁殖实用技术 [ M] .北京:金盾出版
社 , 2003:391-392.
[ 8]汤诗杰 ,李乃伟 ,汤庚国.南京椴组织培养快繁体系的建立 [ J].
江苏农业科学 , 2008(6):87-89.
[ 9]易　鑫 ,万志刚 , 顾福根 , 等.碧螺春茶树微繁殖技术研究 [ J].
江苏农业学报 , 2008, 24(1):95-96.
[ 10]刘　芳.南京椴组织培养的研究 [ D].南京:南京林业大学 ,
2007.
—75—李乃伟等:4种(品种)冬青属植物组织培养的研究