全 文 ：含笑属 RAPD反应条件优化及遗传多态性分析
唐历波 , 周鹤峰 , 陈 东 (遵义医学院珠海校区生物工程系 ,广东珠海 519043)
摘要 [目的]确立含笑属植物RAPD反应的最优条件 ,确定 7种含笑属植物的亲缘关系。[方法]采用改进的 CTAB 法提取木兰科含笑
属 7种植物叶总DNA ,进行 RAPD分析 ,分别研究了模板DNA、引物、dNTP 、Mg2+和 Taq DNA聚合酶用量对 RAPD反应的影响。[ 结果]
RAPD最优反应体系为:反应体积20μl ,内含125 ng模板DNA , 0.3μmol/L引物 , 0.5 U Taq 聚合酶 ,1.5 mmol/ LMgCl2 , 0.1 mmol/LdNTP, 2μl
10×buffer。应用Nei距离法计算各种间的相似系数 ,采用UPGMA法进行聚类分析 , 7种含笑种可分为 3大类。[结论]筛选的最佳 RAPD
反应条件可为含笑属植物的分类和遗传多样性分析提供理论依据。
关键词 含笑属;反应体系;RAPD;聚类分析
中图分类号 Q943 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)01-00046-03
Genetic Diversity Analysis and Optimization of RAPD Reaction System of Michelia
TANG Li-bo et al (Department of Biology Engineering , Zunyi Medical College Zhuhai Campus , Zhuhai , Guangdong 519043)
Abstract [ Objective] The optimization of RAPD reaction condition were established to determine the relationship of seven species of Michelia.
[Method] The improved CTAB method was applied to extracted genomicDNA in the leaves of 7 species of Michelia.Using the method of single factor in
the experiment , the effects of different concentration of MgCl2 , dNTP, template DNA , random primers and Taq DNA polymerase on RAPD reaction were
studied.[ Result] The optimization of RAPD reaction system with total volume of 20μl including 125 ng template DNA , 0.3μmol/L primer , 0.5 U the
Taq polymerase, 1.5 mmol/LMgCl2 , 0.1 mmol/ LdNTP and 2μl 10×bufferwere established.The Nei s genetic similarity coefficient was calculated by
DPS software , 7 species of Michelia were divided into three groups with UPGMA method.[ Conclusion] The result provided the theory foundation for
Michelia Linn classification and genetic diversity analysis.
Key words Michelia Linn;Reaction system;RAPD;Cluster analysis
基金项目 遵义医学院校区启动基金(KY200603)。
作者简介 唐历波(1963-),男 ,安徽马鞍山人 , 副教授 , 从事药用植
物分类学方面的研究。
收稿日期 2008-10-17
木兰科含笑属(Michelia Linn)约 50余种 ,分布于亚热带
和温带 ,我国有 30余种 ,产自西南部和东部 ,大多供观赏用。
木兰科植物具有一些比较原始的性状 ,是研究被子植物起源
和早期植物演化的关键类群之一。RAPD(Randomly Amplified
polymorphic DNA)是 20世纪 90年代发展起来的 DNA分子标
记技术[ 1] ,具有成本低 、分析速度快 、仅需极微量的 DNA即
能获得丰富的多态性特征的优点。实践证明 ,RAPD是植物
遗传多样性研究的一个有效而简便的工具[ 2-4] ,利用 RAPD
技术研究物种的遗传变异 ,对深入探讨植物致濒机理 、保护
和延续物种的多样性具有重要的理论意义和实际价值。国
内关于含笑属植物的 RAPD反应条件优化的研究较多[ 5-7] ,
但仅局限于单个种的研究。笔者对木兰科含笑属 7个代表
种的 RAPD反应条件进行了优化 ,根据扩增条带的多态性分
析其亲缘关系 ,以期建立一个木兰科含笑属通用的 RAPD反
应体系 ,为木兰科植物起源分析提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 7种含笑植物 ,来自于深圳仙湖植物园木兰园;
主要仪器:高速冷冻离心机(Centrifuged 5810R eppendorf),UV-
2550紫外可见光分光光度计 ,WFH-202B紫外透射分析仪 ,核
酸电泳设备 ,PCR扩增仪(Hema 8000);试剂:CTAB ,氯仿-异
戊醇混合液(24∶1 ,V/V),TE缓冲液 , PCR试剂盒购自上海生
物工程公司 。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取。利用改良的CTAB法提取[ 8-9] 。
1.2.2 DNA浓度和纯度的检测。采用紫外吸收检测和凝胶
电泳检测判断DNA样品的纯度和浓度。
1.2.3 RAPD反应体系。
1.2.3.1 RAPD反应的引物 。引物购自上海生工 ,编号为 S1
～ S96。
1.2.3.2 RAPD反应体系建立。用不同的引物浓度和不同
的模板浓度对提取出来的 DNA进行PCR扩增 ,选取 2个引
物进行条件优化 ,其模板及引物浓度优化设计见表 1。然后
在最优条件下进行引物的筛选 ,且用筛选的引物分别对所有
模板 DNA进行 PCR反应 。PCR扩增程序:94 ℃预变性 10
min , 94 ℃变性 1min ,36 ℃复性 1min , 72 ℃延伸 2min ,共 45个
循环 ,再 72 ℃延伸 8min ,最后 4 ℃保存 。
表1 模板及引物浓度优化设计
Table 1 The design of the optimization of RAPD for the concentration of
template DNA and random primers
序号
Sequ-
ence
模板μl
Template
引物μl
Primer
Master ddH2O
序号
Sequ-
ence
模板μl
Template
引物μl
Primer
Master ddH2O
1 0.25 1.2 10 8.55 13 0.25 1.2 10 8.55
2 0.50 1.2 10 8.30 14 0.50 1.2 10 8.30
3 1.00 1.2 10 7.80 15 1.00 1.2 10 7.80
4 1.50 1.2 10 7.30 16 1.50 1.2 10 7.30
5 2.00 1.2 10 6.80 17 2.00 1.2 10 6.80
6 3.00 1.2 10 5.80 18 3.00 1.2 10 5.80
7 1.00 0.4 10 8.60 19 1.00 0.4 10 8.60
8 1.00 0.6 10 8.40 20 1.00 0.6 10 8.40
9 1.00 0.8 10 8.20 21 1.00 0.8 10 8.20
10 1.00 1.2 10 7.80 22 1.00 1.2 10 7.80
11 1.00 1.6 10 7.40 23 1.00 1.6 10 7.40
12 1.00 2.0 10 7.00 24 1.00 2.0 10 7.00
注:RAPD反应体系为 20μl , 1～ 12号为引物 S5 ,13～ 24号为引物 S8,模
板均为深山含笑。
Note:RAPD reaction system is 20μl , 1-12 is primer S5, 13-24 is primer
S8.Templates are all Michelia maudiae.
1.2.4 数据处理与聚类分析。根据遗传距离得到不同居群
间的遗传相似性 ,应用 DPS程序中的非加权组法(UPGMA)进
行聚类分析 ,构建群居间亲缘关系分支树系图[ 10-11] 。
2 结果与分析
2.1 模板 DNA纯度和浓度的检测 用紫外分光光度法检
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 , 37(1):46-48 , 64 责任编辑 李占东 责任校对 张士敏
测了所有 DNA样品的浓度和纯度 ,结果见表 2 。由表 2可
知 ,DNA样本 OD260/OD230在 1.8～ 2.0 ,且 OD260/OD280在 1.8
左右 。7种含笑的DNA样品的琼脂糖凝胶电泳结果见图 1 ,
由图 1可知 ,所有DNA样本均无降解。
表 2 7种含笑 DNA的 OD值
Table 2 The OD value of the DNA samples from7 kinds of Michelia Linn
项目 深山含笑(1)
Micheliamaudiae
亮叶含笑(2)
Michelia fulgens
白花含笑(3)
Micheliamediocris
绒叶含笑(4)
Michelia velutina
四川含笑(5)
Sichuan Michelia
香籽含笑(6)
Michelia hedyosperam
杏香含笑(7)
Michelia almond
OD230 0.026 0.086 0.013 0.033 0.047 0.025 0.028
OD260 0.050 0.161 0.026 0.062 0.087 0.045 0.051
OD280 0.028 0.088 0.014 0.034 0.049 0.025 0.026
OD260/OD230 1.923 1.872 2.000 1.879 1.851 1.800 1.821
OD260/OD280 1.786 1.830 1.857 1.854 1.776 1.800 1.962
DNA浓度∥μg/ml 250 905 130 310 435 225 255
DNA Concentration
注:M 为Marker ,1～ 7分别代表 7种含笑。
Note:“M”is the marker;the number 1-7 represent 7 kinds of Michelia.
图1 7种含笑 DNA的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 The aganose gel electrophoresis of 7 kinds of Michelia DNA
2.2 RAPD体系的优化
2.2.1 DNA模板浓度。由图 2可知 ,在其他条件恒定的情况
下 ,DNA浓度不同 , PCR扩增的结果有较大的差异。1～ 3号
随着模板浓度的增加 ,RAPD条带强弱变化和数量变化明显 ,
而 4～ 6号因浓度过高不能扩增出条带。由此可知 , 3号效果
最好 ,模板 1μl即 125 ng。
2.2.2 引物浓度。由图 2 可知 ,在其他条件恒定的情况下
(19 ～ 24号),随着引物浓度的增加 ,RAPD条带变化明显 ,引
物浓度在 22 ～ 24号之间条带清晰没有明显的区别。从节约
引物考虑 ,22号较好 ,3号和 10号同样有好的效果 ,即引物为
0.3μmol/L。
2.3 引物的筛选 在随机选择的 36条 RAPD引物中 ,筛选
出对供试材料能扩增出清晰的谱带且重复性好的引物有 9
种 ,见表 3。
注:M为marker ,数字 1～ 24为表 1中的序号。
Note:“M” is the marker;the number 1-24 is the treatment sequence in Table 1.
图 2 DNA浓度和引物浓度对 RAPD的影响
Fig.2 The effect of the concentration of template DNA and random primers on RAPD
表 3 引物筛选结果
Table 3 The results of primers selection
引物编号
Primer No.
序列(5 -3)
Sequence
引物编号
Primer No.
序列(5 -3 )
Sequence
S6 TGCTCTGCCC S88 TCACGTCCAC
S65 GATGACCGCC S90 AGGGCCGTCT
S68 TGGACCGGTG S94 GGATGAGACC
S69 CTCACCGTCC S96 AGCGTCCTCC
S82 GGCACTGAGG
2.4 RAPD扩增结果 筛选出的 9个引物对 7种含笑植物
的扩增结果见图 3。由图 3可知 ,共扩增出 175条带 ,平均每
个引物 19.4条 ,其中 S96的最多 ,为 28条;S65最少 ,为 9条;
DNA扩增带的多态性为 83.3%
2.5 7种含笑的聚类分析 由图 4可知 , 7种含笑间的遗传
相似系数为 0.346 9 ～ 0.935 5。其中白花含笑与香籽含笑的
遗传相似系数最小 ,为 0.346 9 ,其次是亮叶含笑与乐昌含笑
的遗传相似系数 ,为 0.433 3 ,表明它们之间的亲缘关系较远 。
而 7种含笑属植物遗传距离最大的为深山含笑与乐昌含笑 ,
为 0.935 5 ,表明它们之间的亲缘关系较近 。由图 4可知 ,当
相似系数为 0.45时 ,7个含笑品种可分为 3组:Ⅰ组为香含笑
4737卷 1期 唐历波等 含笑属 RAPD反应条件优化及遗传多态性分析
和杏香含笑 , Ⅱ组为亮叶含笑和绒叶含笑 , Ⅲ组包括 3个种 , 分别为深山含笑 、乐昌含笑和白花含笑。
注:图中编号的个位数字代表表 2所示的 7种含笑编号,十位数字代表表 3中的 9种引物编号;编号 1～ 6表示采用 S94引物 ,四川含笑为模板 ,
其他条件一致 ,引物浓度不同的扩增结果。
Note:Units digits of the numbers in the picture stand for the number of 7 kinds of Michelias showed in table 2;tens digits stand for the numbers of 9 kinds of
primers showed in table 3.No.1-6 indicate the amplification results with different primer concentrations under the condi tion that S94 as primer , Sichuan
Michelia as template and other conditions are same.
图3 9个引物对 7种含笑RAPD扩增结果
Fig.3 The RAPD amplification results of 7 kinds of Michelias with 9 primers respectively
图4 7种含笑的聚类
Fig.4 The cluster analysis of 7 kinds of Michelias
3 结论与讨论
(1)DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目
前 ,已有多种方法成功地从植物叶片 、愈伤组织 、组培苗果
实 、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但有些情况下不同植
物甚至同一种类植物组织材料的来源 、部位 、形态等外在性
质的不同以及化学成分 、组织结构等内在特点的差异 ,在提
取基因组 DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处
理[ 12] 。含笑属植物叶片革质 ,含有较多的酚类和多糖类物
质[ 13] 。故该试验选用改良的 CTAB 法提取 DNA[ 14] ,提取出
来的样本 DNA OD260/OD230为 1.8 ～ 2.0 , OD260/OD280为 1.8
左右 ,均可用来 RAPD分析[ 13] 。
(2)该试验最优体系中模板 DNA含量为 125 ng ,与有关
木兰科RAPD研究[ 14-17](一般在 20 ～ 60 ng)相比 ,其结果偏
大 ,但在试剂盒浓度范围内 ,说明含笑属 RAPD反应体系需
要较高的模板浓度。该试验最优体系中引物浓度为 0.3
μmol/L ,在有关木兰科 RAPD研究[ 15-18] 中引物浓度(0.25 ～
0.4μmol/L)范围内 。
(3)对 7种含笑植物进行 RAPD扩增 ,获得 RAPD表型数
据矩阵。根据Nei距离法计算各品种间的遗传相似系数 ,采
用UPGMA法进行聚类分析 ,建立亲缘关系聚类树状图 。结
果表明 ,几种含笑属植物的遗传相似系数差别较大 ,这是由
于这几种植物来自不同的地方 ,生长在不同的环境下 ,在外
观上也有很大的差异 ,这与王亚玲等[ 19]研究结果相近。云
南白花含笑和广西香籽含笑的遗传相似系数较小 ,说明地缘
关系造成种间的歧义。在同一地方的植物亲缘关系应是相
近的 ,乐昌含笑 、深山含笑 、绒叶含笑起源地均为四川 ,遗传
(下转第 64页)
48 安徽农业科学 2009年
过高反而影响幼苗正常的光合能力。
图2 牛磺酸对枸杞幼苗MDA含量的影响
Fig.2 Effects of taurine on the content of MDA in L.barbarum
seedlings
植物细胞膜相对透性 、膜脂过氧化产物MDA含量是植
物膜系统稳定的重要指标 ,而膜系统的稳定性大小则与植物
抵抗不良环境胁迫能力密切相关。研究表明 ,适当浓度的牛
磺酸处理在一定程度上可以降低枸杞幼苗的细胞膜相对透
性和MDA含量 ,并提高叶片的光合速率 ,增强保护酶 SOD 、
POD的活性 ,对枸杞幼苗细胞膜有一定的保护作用 ,其中最
适处理的牛磺酸浓度在 500mg/L附近 ,与郝林华等在小麦 、
黄瓜幼苗上的研究结果基本一致[ 5-6] 。但是过高浓度的牛
磺酸反而会破坏细胞膜 ,增加细胞膜的相对透性和 MDA含
量 ,降低叶片的光合速率及保护酶 SOD 、POD的活性 。
综上所述 ,适宜浓度的牛磺酸处理可在一定程度上提高
叶片的光合效率 ,增强 SOD 、POD的活性 ,降低细胞膜相对透
性和MDA含量 ,并且最适处理浓度约为 500mg/L。说明牛磺
酸对枸杞幼苗细胞膜具有一定的保护作用 ,适宜浓度的牛磺
酸可以避免或减轻植物细胞膜遭到损伤或破坏 ,从而提高枸
杞的抗性。
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