全 文 ：园　艺　学　报　1998 , 25(3):214～ 219
Acta Horticulturae Sinica
　收稿日期:1998-02-23;修回日期:1998-05-18。
＊第一作者在韩国国家园艺研究所从事博士后研究的部分内容。
RAPD标记在苹果属种间杂交一代的分离方
式＊
刘孟军1　Shin Yong-Uk2　Yae Byeong-Woo2
(1河北农业大学中国枣研究中心 ,保定 071001;2National Horticultural Research Institute , Suwon , 440310 Korea)
提　要　以富士苹果和山定子及二者的种间杂交 F1代为试材 , 对 RAPD标记的分离方式
进行了研究。结果表明 , RAPD标记在 F1 代的分离方式可归为 3 类 , 即呈孟德尔分离 、 偏离
孟德尔分离比例和异常分离。呈孟德尔分离的情况有:不分离 (代表了父母本中相应 RAPD
标记的 5种组合:AA×AA、 AA×Aa、 Aa×AA、 AA×aa、 aa×AA)、 1∶1 分离 (代表了父母本
中相应 RAPD标记的 2 种组合:Aa×aa、 aa×Aa)和 3∶1 分离 (代表了父母本中相应 RAPD标
记的 1种组合:Aa×Aa)。异常分离的标记包括:F1代出现双亲均不具备的标记 、 分子量在不
同F1 个体间变化的标记 , 以及隔代遗传的标记。 据对 200 个 RAPD 标记的统计分析 , 不分离
标记 、 按 1∶1或 3∶1 比例正常分离的标记 、 偏离孟德尔分离比例的标记和异常分离标记分别
占45.5%、 45.0%、 8.0%和1.5%;双亲共有标记中74.7 %不发生分离 , 单亲特有标记中
57.1%～ 79.6 %发生正常分离;富士特有标记中不分离标记占33.3 %, 而山定子特有标记中
不分离标记只占4.3 %, 表明富士基因组中纯合基因位点的比例要高于山定子。对异常分离的
RAPD标记等进行了讨论。
关键词　苹果属;种间杂交;RAPD标记;分离方式
自1990年 Williams等证明 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)可用作遗传标
记〔1 ,2〕以来 , RAPD以其多种优越性已广泛应用于动植物遗传连锁图谱的构建〔1～ 4〕 。利用
RAPD构建遗传连锁图谱通常需要有回交 、 测交或F2分离群体 , 这对多年生果树来说并非
易事。Hemmat M.等〔5〕在传统的果树杂交育种理论基础上提出 “双假测交构想” (double
pseudotestcross format), 即利用多年生果树遗传上高度杂合 F1代即发生分离的特点 , 以 F1
分离后代为作图群体 , 使多年生果树遗传作图的难题迎刃而解。而利用 F1 群体构建 RAPD
遗传图谱 , 首先需了解 RAPD在F1 的分离情况 。本文研究了 RAPD标记在苹果属种间杂交
F1代的分离方式 , 以期为苹果的遗传连锁图谱构建和遗传育种研究提供参考 。
1　材料与方法
1.1 　材料　富士苹果 (Malus domestica cv.Fuji)、 山定子 (M.baccata)、 富士苹果与山
定子的二年生 F1 代实生苗 (60株)以及富士苹果的双亲 ———元帅和国光 , 采自韩国国家
园艺研究所。5 ～ 7月采集幼叶 , 保存于-70℃冰箱。
1.2 　DNA模板制备　采用改良的高盐低 pH 值法〔6〕 。
1.3 　RAPD分析　试验在韩国国家园艺研究所生物工学实验室进行。采用美国 Operon生
物技术公司的 10碱基随机引物 , Promega 公司的 dNTP , DynaZyme 公司的 Taq酶 , PCR扩
增使用 PE-480基因扩增仪。基本反应体系为50 μL 反应体积中含 2 μL模板 DNA (10 ng/
μL)、 2 μL引物 (10 ng/μL)、 5 μL 100μmol/L dNTP 、 0.8单位 Taq DNA 聚合酶 、 5μL 10
倍酶稀释液和35.6 μL 重蒸水 , 反应液上覆盖 50μL矿物油 。PCR扩增程序为 94℃预变性
5 min , 然后 94℃1 min 、 37℃1 min 、 72℃2 min , 循环50次 , 最后在 72℃下延伸 5 min。扩
增产物在1.2 %琼脂糖胶 (Promega Lot#525935 , Part#B312A)上电泳 (反应产物在电泳
前存放于 4℃), 电泳和制胶缓冲液用0.5倍的 TBE 。电泳结束后凝胶在0.5μg/mL 的 EB
(溴化乙锭)中染色 20 ～ 30 min , 然后在 MgSO4溶液中清洗 , 于紫外灯下观察并照像 。
2　结果与分析
2.1 　RAPD标记在苹果属种间杂交 F1 代的分离方式
RAPD标记在富士苹果和山定子杂交F1 代的分离情况可分为符合孟德尔分离规律 、 偏
离孟德尔分离规律和异常分离 3类。
2.1.1 　孟德尔分离　符合孟德尔分离规律的情况有以下 3种:
(1)RAPD标记在 F1代不分离。在 F1 代不分离的 RAPD标记既有双亲共有标记 , 也
有单亲特有标记 。鉴于 RAPD为显性遗传标记 , F1代不发生分离的双亲共有标记反映了双
亲相应 RAPD标记的 3种组合 , 即AA×AA 、 AA×Aa或 Aa×AA (A和 a分别表示显性和
隐性 RAPD标记 , 以下同);富士特有标记反映的双亲相应 RAPD标记组合为AA×aa;山
定子特有标记所反映的双亲相应 RAPD标记组合为 aa×AA。这类标记在 F1 代个体中存在
与缺失的理论比例为 60∶0 (供试 F1群体有 60个单株), 如双亲共有标记OPD15-1320和
富士特有标记OPD15-1880在 F1 群体中存在与缺失的实际比例分别为 59∶1和 60∶0 (图
版 , a), 在统计学上二者均符合 60∶0的比例。
(2)RAPD标记在 F1 代按 1∶1分离 。这类标记包括富士特有标记 (如 OPE08-800的
实际分离比例为 28∶32 , 见图版 , c)和山定子特有标记 (如 OPD15-950的实际分离比例
为30∶30 , 见图版 , a), 对应的双亲相应 RAPD标记组合分别为 Aa×aa和 aa×Aa 。
(3)RAPD标记在 F1代按 3∶1分离。这类标记仅发生在双亲共有标记上 , 双亲中的相
应 RAPD标记组合为Aa×Aa 。
依据Hemmat M.等提出的 “双假测交构想” , 符合 1∶1或 3∶1孟德尔分离比例的
RAPD标记中 , 富士特有标记和山定子特有标记可分别用于构建富士和山定子的遗传连锁
图 , 双亲共有标记可用于构建双亲的遗传连锁图 , 并可用于判断双亲间的同源连锁群。
2.1.2 　偏离孟德尔分离规律　F1个体中 RAPD标记存在与缺失的比例在统计学上偏离1∶1
或3∶1的孟德尔分离比例。如富士特有标记 OPE14-920 、 山定子特有标记 OPD15-1750
(图版 , a)和双亲共有标记 OPE11-720 的实际分离比例分别为 41∶19 、 16∶44 和 50∶10 ,
分别偏离了30∶30 、 30∶30和 45∶15的理论比例 。
2.1.3 　异常分离　异常分离标记有以下 3种:
(1)非亲 RAPD标记 , 即双亲均无 , 却在 F1 代出现 , 如 OPC07-1290 (图版 , b)和
OPE19-860 (分离比例分别为 26∶34和 30∶30)。
2153期　　　　　　　　刘孟军等:RAPD标记在苹果属种间杂交一代的分离方式 　　　　　　　　
(2)分子量在F1代不同个体间有波动 , 如 OPE08-880 (图版 , c)。
(3)隔代遗传 , 见于富士苹果的双亲 , 但富士和山定子中均不存在 , 而在富士与山定
子的杂交 F1 代个体中重又出现 , 如 OPF07-1780 (分离比例为 29∶30)。
2.2 　不同分离类型 RAPD 标记的出现频
率
对扩 增 效 果 良 好 的 Operon 引 物
(OPA07 、 OPA08 、 OPA09 、 OPA10 、 OPA11 、
OPA14 、 OPA17 、 OPA20 、 OPB08 、 OPB19 、
OPC05 、 OPC06 、 OPC07 、 OPC09 、 OPC19 、
OPE01 、 OPE03 、 OPE06 、 OPE07 、 OPE08 、
OPE09 、 OPE11 、 OPE12 、 OPE13 、 OPE14 、
OPE16 、 OPE17 、 OPE19)产生的 200 个
RAPD标记在富士苹果与山定子种间 F1 代
分离情况进行统计分析和 X2检验 , 结果表
明 , 不发生分离的占45.5%;符合 1∶1或
3∶1孟德尔分离比例的占45.0%;偏离孟德
尔分离比例的占 8.0%;异常分离的占
1.5 %(表)。
在F1代不发生分离的 RAPD标记中 ,
双亲共有标记占74.7 %, 富士特有标记占
23.1%, 山定子特有标记占2.2 %;从另
一角度看 , 双亲共有标记中 80%的不发生
分离 , 富士特有标记中不分离标记占
33.3%, 山定子特有标记中不分离标记只
占4.3 %。该结果表明双亲共有标记在 F1
代大多不发生分离 ,是不分离标记的主体 ,
表　RAPD标记在苹果属种间杂交 F1 代的分离方式
Table　Segregation patterns of RAPD marker in F1 progeny
from an interspecific cross between Malus domestica
cv Fuji and M.baccata
分离方式
Segregation
pattern
双亲共
有标记
Marker
present
in both
parents
富士特
有标记
Marker
present
only
in Fuji
山定子
特有
标记
Marker
present
only in
M.
baccata
合计
Sub-
total
出现
频率
Fre-
quency
(%)
不分离
Non-segregation
68 21 2 91 45.5
1∶1和 3∶1分离
1∶1 and 3∶1 segregation
15 36 39 90 45.0
偏离孟德尔分离比例
Deviation f rom
Mendelian segregation
2 6 8 16 8.0
异常分离＊
Abnormal segregation
3 1.5
　　＊异常分离标记包括非双亲标记 、 隔代遗传标记和
分子量在 F1 代个体中变化的标记。
＊Abnormal marker in the table includes none -parental
markers , the markerswhich present in Fuji′s parents (absent in
both Fuji and M.baccata) reappear in the progenies of Fuji×
M.baccata , and the markers with molecular weight vibrating
among progenies.
同时表明富士苹果基因组中纯合基因位点所占比例大大高于山定子 。
在F1代符合 1∶1或3∶1孟德尔分离比例的 RAPD标记中 , 双亲共有标记 、 富士特有标
记和山定子特有标记分别占16.7 %、 40.0%和43.3 %;另一方面 , 双亲共有标记 、 富士
特有标记和山定子特有标记中 , 符合孟德尔分离的比例分别占17.6 %、 57.1 %和79.6 %。
该结果表明单亲特有标记在 F1 代大多发生符合孟德尔规律的分离 ,是正常分离标记的主
体 ,同时表明山定子基因组中的杂合基因位点所占比例高于富士苹果 ,富士苹果特有 RAPD
标记的不规则分离比例高于山定子 。
3　讨论
3.1 　非亲 RAPD标记　在供试 148个引物中有 2个引物 , 即 OPF07和 OPC07 , 从富士苹
果与山定子的种间杂交F1 分离群体中扩增出双亲均没有的 RAPD带 (OPF-1780 , 存在∶
缺失=29∶30;OPC07-1290 , 存在∶缺失=26∶34)。Ayliffe M.A.等〔7〕也曾观察到类似的
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非双亲扩增带 , 并通过序列分析证明这些非双亲扩增带来源于不同长度的等位核苷酸序列
之间形成的异源双链体。Davis T.M.等〔8〕在鹰嘴豆 (Cicer arietinum L.)和二倍体草莓的
作图群体中发现了 10个长度在 300 ～ 1350的共显性 RAPD标记 , 认为这些带是双亲所不具
备的异源双链体 , 其泳动速度低于两个相应的亲本带 , 在 PCR扩增前将双亲 DNA混合可
以导致相应异源双链体的出现。这种由等位 RAPD产物形成的非亲 RAPD 可提供共显性
RAPD标记 , 并且能提供新的 RAPD多态性 , 在研究育种行为以及亲缘关系等方面具有重
要应用价值。
3.2 　RAPD 标记的非孟德尔分离 　有关 RAPD 标记的非孟德尔分离已有一些报道。
Hashizume T.等〔9〕指出 , 在西瓜的第 7连锁群上近一半 RAPD标记表现为严重的不规则分
离。Faure S.等〔10〕在香蕉上曾发现 36%的 RAPD位点表现出不规则分离 , 并认为染色体
结构重排是导致不规则分离的主要原因之一。本研究中观察到 8%的 RAPD标记偏离孟德
尔分离规律 , 如 OPD15-1750和 OPE09-1020的期望分离比例为 30∶30和 29∶29 , 而实际
分离比例分别为 16∶44和 13∶45。从已有报道和本研究来看 , 不规则分离的 RAPD往往集
中分布于少数几个连锁群上 , 表明不同染色体在杂交过程中的 “活跃程度” 不同 , 即发生
结构重排 、缺失 、插入和突变等的机率存在差异 。
3.3 　分子量可变的 RAPD标记和隔代遗传的 RAPD标记　有关分子量可变的 RAPD标记
和隔代遗传的 RAPD标记尚未见报道 。本研究发现的分子量在 F1 代个体间变动的RAPD标
记可能是其在一些个体中与另外的等位核苷酸序列之间形成了异源双链体 , 而在另一些个
体中则未能形成相应的异源双链体 , 隔代遗传的 RAPD标记的形成机制尚待进一步研究。
3.4 　F1群体和 RAPD标记在果树遗传作图上的应用　本研究中富士苹果和山定子种间杂
交F1群体中有54.5 %的检出位点发生了分离 , 其中82.6 %(占检出位点总数的 45%)的
位点发生了孟德尔分离 , 分别可用于富士苹果和山定子的遗传作图以及双亲连锁群间的亲
缘性分析。另据统计分析 , 本研究中 59个经过预选的 Operon 引物共产生了 172 个可用于
遗传作图的 RAPD标记 , 平均每个引物可产生2.92个作图标记。可见 , 利用 F1分离群体
和 RAPD标记进行果树遗传作图效率相当高 , Hemmat M.等提出的 “双假测交构想” 在果
树遗传作图上具广阔应用前景 。
参 考 文 献
1 　Williams J G K , Kubelik A R , Livak K J , et al.DNA polymorphisms amplifi ed by arbitrary primers are useful as genetic mark-
ers.Nucleic Acids Research , 1990 , 18 (22):6531～ 6535
2 　Welsh J , McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.Nucleic Acids Research , 1990 , 18 (24):
7213～ 7218
3 　曹家树.分子生物学技术在蔬菜研究上的应用.园艺学年评 , 1995 , 1:133～ 153
4 　惠东威 , 陈受宜.RAPD技术及其原理.生物工程进展 , 1992, 12 (6):1～ 5
5 　Hemmat M , Weeden N F , Manganaris A G.et al.Molecular marker linkage map for apple.The Journal of Heredity , 1994 , 85
(1):4～ 11
6 　刘孟军.RAPD技术在枣和酸枣种质鉴定上的应用研究.中国科协第二届青年学术年会园艺学论文集.北京:北
京农业大学出版社 , 1995.337～ 341
7 　Ayliff e M A , Lawrence G J , Elli s J G , et al.Heteroduplex molecules formed between allelic sequences cause nonparental RAPD
bands.Nucleic Acid Research , 1994 , 22 (9):1632～ 1636
2173期　　　　　　　　刘孟军等:RAPD标记在苹果属种间杂交一代的分离方式 　　　　　　　　
8 　Davis T M , Yu H , Haigis K M , et al.Template mixing:a method of enhancing detection and interpretation of condominant
RAPD markers.Theoretical Applied Genetics , 1995 , 91 (4):582～ 588
9 　Hashizume T , Shimamoto I , Harushima Y.et al.Construction of a linkage map for watermelon 〔Citrullus lanatus(Thunb)〕 us-
ing random amplified polymorphic DNA (RAPD).Euphytica , 1996, 90 (3):265～ 273
10　Faure S , Noyer J L , Horry J P.A molecular marker-based linkage map of diploid bananas(Musa accuminata).Theoretical
Applied Genetics , 1993 , 87 (4):517～ 526
The Segregation Patterns of RAPD Marker in an Interspecific F1
Hybrid between Malus domestica cv.Fuji and M.baccata
Liu Mengjun
1 , Shin Yong-Uk2 , and Yae Byeong-Woo2
(1Research Center of ChineseJujube , Hebei Agricultural University , Baoding , 071001;2National Horticultural Research
Institute , Suwon , 440310 , Korea)
Abstract　The segregation patterns of RAPD marker in an interspecific F1 between Malus domes-
tica cv.Fuji and M.baccata were studied.According to the segregation patterns , RAPD markers
were grouped into three types:(1)normal Mendelian inheritance with segregation ratio of nearly 1∶1
(as a result of Aa×aa or aa×Aa), 3∶1 (as a result of Aa×Aa)or 1∶0 (non-segregation , as a
result of AA×AA , AA×aa , AA×Aa , Aa×AA and aa×AA);(2)deviation from Mendelian
segregation ratios;(3)abnormal segregation in low frequency , including:a)none-parental mark-
ers , absent in both parents but present in progenies , b)the markers present in Fuji′s parents (Rall′
s Jenet and Delicious)but absent in both Fuji and M.baccata and reappeared in the progenies of
Fuji×M.baccata , and c) the markers withmolecular weight vibrating among progenies.Basing on
statistics of 200 RAPD markers , there exist 45%none -segregation marker , 45% 1∶1 and 3∶1
Mendelian segregation marker , 8% marker deviating from Mendelian segregation ratios and 1.5%
abnormal segregation marker;74.4 % markers presenting in both parents did not segregate and
57.1 %～ 79.6 % markers presenting in only one parent showed Mendelian segregation;none -
segregation markers accounted for 33.3 %of the markers present only in Fuji and 4.3 %of those pre-
sent only in M.baccata.These results suggested that Fuji genome contains muchmore pure loci than
M.baccata.The mechanisms of abnormal segregation were discussed in the paper.
Key words　Apple;Malus;Interspecific cross;RAPD marker;Segregation pattern
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图 版 说 明
a.引物 OPD15 (CATCCGTGCT)产生的 RAPD标记在富士 (F)与山定子 (B)种间杂交 F1 代的分离情况
标记 950 (分子量)只存在于山定子, 符合孟德尔分离;标记 1320存在于双亲 , 标记 1880仅存在于富士 , 二者
在F1群体中未发生分离;标记 1750只存在于山定子 , 偏离孟德尔分离.R和 D分别代表富士苹果的双亲国光和元
帅;M为 DNA分子量标记。
b.引物 OPC07 (GTCCCGACGA)产生的 RAPD 标记在富士 (F)与山定子 (B)种间杂交F1代的分离情况
标记 1290不存在于双亲 , 但出现在 F1 代个体中。
c.引物 OPE08 (TCACCACGGT)产生的 RAPD标记在富士 (F)与山定子 (B)种间杂交F1 代的分离情况
标记 880只存在于富士 , 其分子量在F1代不同个体间有所变化;标记 800只存在于富士 , 符合孟德尔分离。
Explanation for Plates
a.Segregation patterns of the markers generated by primer OPD15 (CATCCGTGCT)in F1 population from an interspecifi c cross be-
tween Malus domestica cv Fuji (F) and M.baccata (B)Band-950 showing the Mendelian segregation of a band presents only in
M.baccata;band-1320 showing a band present in both parents and all of their progenies;band-1880 showing a band present
only in Fuji but appearing in all the progenies;band-1750 showing the non-Mendelian segregation of a band present only in M.
baccata;“R” and “D” representing the two parents of Fuji apple , Rall′s Jenet and Delicious;M:DNA/EcoR Ⅰ +Hind Ⅲ
marker.
b.Segregation patterns of the markers generated by primer OPC07(GTCCCGACGA)Band-1290 showing a band segregat ing in the
progenies but absent in both parents.
c.Segregation pat terns of the markers generated by primer OPE08 (TCACCACGGT)Band-880 showing a band whose size/mole-
cular weight vabrates among the progenies;band-800 showing the Mendelion segregation of a bind present only in Fuji.
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