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蔷薇属植物无菌体系的建立



全 文 :蔷薇属植物无菌体系的建立
郭艳超1,2,赵梁军2* (1.河北省农林科学院滨海农业研究所,河北唐山 063200;2.中国农业大学,北京 100193)
摘要 [目的]建立蔷薇属植物的无菌快繁体系。[方法]以茎段为外植体,以 10种蔷薇属植物为试验材料,在培养基中添加不同的同
激素组合来建立其组织培养体系。[结果]10种蔷薇属植物在萌发培养基 MS +0. 5 mg /L BA +0. 01 mg /L NAA上均可萌发,芽体健壮,
萌发率可达到 70%以上;10种蔷薇属植物各自适宜的增殖培养基略有不同,在增殖培养过程中,增殖率可以达到 3. 0%以上,丛生苗健
壮,叶色正常;健壮小苗在添加 0. 1 ~0. 2 mg /LNAA的 1 /2MS培养基上诱导生根,根系生长良好,生根率可以达到 90% ~ 100%;将生根
后的小苗驯化后移栽,成活率在 95%左右。[结论]建立了蔷薇属植物的无菌快繁体系,为蔷薇属植物的分子育种奠定了基础。
关键词 蔷薇属植物;组织培养
中图分类号 S685. 12 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611(2011)33 -20325 -03
Development of an in vitro culture system of Rosa spp. Plants
GUO Yan-chao et al (Coastal Agriculture Institute,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Tangshan,Hebei 063200 )
Abstract [Objective]This study was to develop an in vitro tissue culture system of Rosa spp. [Method]Using ten species of Rosa spp.
plants as experimental materials,different combinations of hormones were designed to establish their in vitro tissue culture system with the stem
segments as explants. [Result]All ten varieties tested germinated when the nodal segment explants were cultured on the sprouting medium MS
+ 0. 5 mg /L BA + 0. 01 mg /L NAA and grew vigorous shoots,and the sprouting rate was up to 70% . Of the ten rose varieties tested,each
has a respective optimal proliferation medium,and the multiplication rates for all the varieties reached 3. 0% . The axillary buds were vigorous
and normal in leaf color. The optimal medium for rooting and acclimationwas 1 /2MS medium containing 0. 1 mg /L or 0. 2 mg /L NAA,in
which the rooting frequency reached 90% - 100% and the root system was developed. After acclimation and transplant,the survival rate was
as higher as 95% . [Conclusion]An in vitro tissue culture system of Rosa spp. has been established in this study,which lays foundation for
the molecular breeding of Rosa spp.
Key words Rosa spp. plants;Tissue culture
基金项目 国家自然科学基金资助项目(30871733)。
作者简介 郭艳超(1974 -) ,女,河北定兴人,硕士,研究方向:园林植
物抗逆生理及分子遗传,E-mail:guoyanchao2008@ sina. com。
* 通讯作者,教授,博士,博士生导师,从事观赏植物抗逆分
子育种方面的研究,E-mail:zhaolj5073@ sina. com。
收稿日期 2011-08-12
我国是蔷薇属植物的原产地之一,且蔷薇属植物资源丰
富,约占世界总数的 41%[1]。蔷薇属植物品种繁多,花色艳
丽,花型多样,具花香,是庭园与园林绿化材料的首选。
当前蔷薇属植物的育种是花卉育种中最活跃的领域之
一,其育种目标主要集中在对花色、花香、花型、开花习性、鲜
切花寿命、柱型、抗病性等的改良上[2 -3]。而分子育种技术
由于是直接有目的地操作基因,使该技术具有能达到只改变
蔷薇属植物的某一单一性状而保持其他性状不变的特点。
因此,分子育种技术被越来越多地应用于改良观赏植物的研
究上,并且在蔷薇属植物的性状改良上显示了很大的应用潜
力。而建立蔷薇属植物的组培和遗传转化系统是通过体细
胞克隆变异进行育种和基因工程育种的重要前期工作[4]。
关于蔷薇属植物的离体培养、根诱导及移栽问题已有了
较多的报道[5 -8]。由于受基因型影响,不同品种之间的组织
培养特性表现出一定的差异[5]。因此探讨不同品种组培快
繁的培养条件,特别是培养基中适宜的不同激素配比仍具有
重要价值。
1 材料与方法
1. 1 试验材料 以种植于中国农业大学科学园观赏园艺花
圃内的 2个月季品种和 8个蔷薇品种为试验材料,月季品种
为白梅蒂朗(Rosa White Meidilan)、无刺月季(Rosa careful-
ly) ;蔷薇品种:多花蔷薇[无刺 3 号(Rosa multiflora
‘inermis3’]、无刺 4号(Rosa multiflora‘inermis4’)、无刺 11
号(Rosa. multiflora‘inermis11’)、荷花蔷薇(R. multiflora f.
carnea)、香水月季(Rosa odorata)、光叶蔷薇(Rosa wichurai-
ana)、法国蔷薇(Rosa gallica)、月季花(Rosa indica)。
1. 2 外植体灭菌 外植体灭菌方法参照崔广荣[9]的研究。
从露地栽培的植株上剪下当年生已开始木质化枝条的中上
部,除去叶片及托叶后放到适当浓度的洗衣粉水中,用软毛
刷清洗,然后将枝条剪成 4 ~5 cm长的茎段,放到 1 L的烧杯
中,纱布罩住杯口,流水冲洗 20 min,冲洗完毕后将茎段再剪
成适当长度的单芽茎段,放到一个装有适量无菌水的塑料瓶
中,备用。在超净工作台里对外植体进行表面灭菌:70%酒
精处理 30 s,无菌水冲洗 3 次,0. 1%升汞(W/V)处理 8 min,
无菌水冲洗 6次,放到无菌培养皿中适当控干水分,备用。
1. 3 腋芽萌发及继代增殖 将灭过菌的茎段外植体接种到
萌发培养基 MS +0. 5 mg /L BA +0. 1 mg /L NAA上诱导腋芽
萌发。萌发培养基参照张常青等[10]和杨永花等[11]的研究。
每个处理接种 10个茎段,3次重复。20 d后统计萌发率。当
萌发的腋芽长到 1 cm左右,将其从外植体上切下接种到增
殖培养基上进行增殖培养。所选用的激素种类和浓度参照
前人的研究[9 -10,12 -13]而定(表 1)。每个处理接种 3 个外植
体,重复 3次。注意观察并分类统计各材料在不同激素组合
的增殖培养基上的生长情况。
1. 4 生根及炼苗移栽 参考相关研究,生根培养基的基本
成分为一般为 1 /2MS,添加低浓度的生长素 NAA或 BA诱导
生根。该试验选用生长素 NAA 并设置了 0. 1、0. 2 和
0. 5 mg /L 3个浓度梯度。将生长健壮的小苗移至生根培养
基中,诱导生根。每个处理接种 3 个小苗,重复 3 次。生根
培养25 d后,统计生根率。选择具有2 ~5条根,根长在1 cm
以上,生长健壮的试管苗进行开瓶炼苗,炼苗7 d后用镊子取
出苗,洗去根部残留的培养基,移栽到装有混合草炭土和蛭
石(质量比为 1∶ 1)灭菌基质的营养钵中,并置于 HPG-400H
光照培养箱中,光照强度为 10 000 Lx,光照时间 14 h,昼夜温
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2011,39(33):20325 - 20327,20420 责任编辑 朱琼琼 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.33.192
度为21 ℃ /16 ℃,保持湿度为 60%,2周后调查成活率。
1. 5 培养条件 该试验均采用 MS 基本培养基,添加 3%蔗
糖,0. 6%琼脂粉,pH 5. 96。GA3 采用过滤灭菌,其他植物生
长调节剂均在培养基灭菌前加入。培养基 121 ℃高压灭菌
15 min。培养条件为温度(25 ±2)℃,光强 50 μmol /(m2·s),光
暗比 16 h∶ 18 h。
2 结果与分析
2. 1 腋芽诱导萌发结果 将各试验材料的外植体茎段接种
到萌发培养基上后,腋芽萌动的早晚随品种不同有所变化,
多数品种 4 ~7 d左右腋芽即开始膨大,10 d左右分化芽逐渐
形成幼苗。随着培养天数的增加,幼苗逐渐伸长,生长,并形
成 2 ~3个芽的芽丛(图 1)。由表 2 可看出,10 种蔷薇属材
料在该萌发培养基上均达到 70%的萌发率。无刺 3 号的腋
芽萌发率最高,为 97%,无刺月季的腋芽萌发率最低,为
70%。这说明该萌发培养基对 10种试验材料诱导腋芽萌发
均适用。
注:A.无刺 3号蔷薇;B.无刺 4号蔷薇;C.无刺 11号蔷薇;D.香水月季;E.光叶蔷薇;F.荷花蔷薇。
Note:A,R. multiflora‘inermis3’;B,R. multiflora‘inermis4’;C,R. multiflora‘inermis11’;D,R. odorata;E,R. wichuraiana;F,R. carnea.
图 1 不同蔷薇属植物茎段腋芽萌发情况。
Fig. 1 The in vitro sprouting of Rosa spp. plants
表 1 继代增殖培养基中的激素种类及浓度
Table 1 Combinations and concentrations of plant growth regulators
tested in proliferation medium mg /L
培养基编号
Medium code
植物生长调节剂组合及浓度 Combination and concentration
BA NAA GA3
1 0. 5 0. 010 0
2 0. 5 0. 050 0
3 0. 5 0. 100 0
4 0. 8 0. 010 0
5 0. 8 0. 050 0
6 0. 8 0. 100 0
7 1. 0 0. 010 0
8 1. 0 0. 050 0
9 1. 0 0. 100 0
10 0. 5 0. 005 0. 1
11 0. 5 0. 010 0. 1
12 0. 8 0. 005 0. 1
13 0. 8 0. 010 0. 1
14 0. 8 0. 050 0. 1
15 1. 0 0. 005 0. 1
16 1. 0 0. 010 0. 1
17 1. 0 0. 100 0. 1
取材季节对腋芽萌发有一定的影响。该试验在春季 4 ~
5月取材时,不仅腋芽萌芽早,萌发率高,且染菌率也低;而在
秋冬季取材时,芽进入自然休眠状态,因而萌芽率及污染率
都较高。故取材时间以春季为佳。
2. 2 腋芽继代增殖结果 试验发现,幼苗接到增殖培养基
上后,有些品种幼苗表现出长势减弱的现象,主要表现为黄
叶,芽丛矮化、紧凑,叶片小等。推测原因可能是幼苗对继代
增殖培养基中的激素种类及浓度存在一个适应过程。将生
长健壮的各品种幼苗在 17 种增殖培养基上连续培养 8 周
后,幼苗的长势及分生能力都有所提高。但各品种幼芽的最
佳继代增殖培养基、不定芽的生长情况及增殖倍数有所不同
(表 3)。有可能是由于芽器官的快速增殖与供试材料的基
因型有关[14]。但各品种在最适增殖培养基上丛生芽的均生
长健壮,叶色嫩绿,叶片伸展。在该试验中还发现,有些品种
(如香水月季)在加入 GA3 的培养基中植株矮小紧凑,叶片
小,无法用于试验,去掉 GA3 后培养,植株枝叶伸展,叶片大
小适中;而有些品种(荷花蔷薇和光叶蔷薇)只有在含 GA3
的培养基中才能长势健壮,枝叶伸展。由此可见不同基因型
的蔷薇属植物对 GA3 的反应不同。
62302 安徽农业科学 2011 年
表 2 各试验材料腋芽萌发情况(接种 20 d)
Table 2 The sprouting of axillay buds
品种
Species
外植体数
Explant
number

发芽外植
体数 Explants
producing
axillay
buds∥个
萌发率
Sprouting
rate∥%
芽生长情况
白梅蒂朗 R.
White Meidilan 30 23 77
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿,叶片伸展
无刺月季 R.
carefree 30 21 70
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
无刺 3号
R.‘inermis3’ 30 29 97
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
无刺 4号
R.‘inermis4’ 30 28 93
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
无刺 11 号 R.
‘inermis11’ 30 27 90
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
荷花蔷薇
R. carnea 30 26 87
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
香水月季
R. odorata 30 23 77
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
光叶蔷薇 R.
wichuraiana 30 28 93
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
法国蔷薇
R. gallica 30 23 77
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
月季花
R. indica 30 26 87
有丛生芽,生长健壮
叶色嫩绿、叶片伸展
表 3 各材料幼芽的最适增殖培养基及丛生芽生长情况
Table 3 The efficient culture mediums of different cultivars and the
growth of adventitious bud
品种
Species
最适培养基代号
The code of efficient
culture mediums
增殖率
The multiplication
rate∥%
白梅蒂朗 R. White Meidilan 16 4. 5
无刺月季 R. carefree 5 3. 1
无刺 3号 R.‘inermis’' 5 3. 2
无刺 4号 R.‘inermis4’ 5 3. 3
无刺 11号 R.‘inermis11’ 5 3. 5
荷花蔷薇 R. carnea 14 3. 6
香水月季 R. odorata 5 3. 8
光叶蔷薇 R. wichuraiana 11 3. 3
法国蔷薇 R. gallica 2 3. 5
月季花 R. indica 3 3. 5
2. 3 生根及炼苗移栽结果 由表 4 可知,试管苗在不同浓
度 NAA的培养基上均可诱导产生不定根,一般诱导 10 d左
右就有根不断生成,平均根数 3 ~ 10根,根系呈放射状,各品
种生根率均在 70% ~100%,且以添加 NAA浓度为 0. 1 mg /L
和 0. 2 mg /L的培养基生根效果最佳,根生长良好,健壮(图
2)。开瓶炼苗后,成活率可以达到 95%左右。
表 4 NAA浓度对试管苗生根的影响
Table 4 Influence of NAA concentrations on the induction of root
NAA浓度
mg /L
生根率 Rate of rooting∥%
白梅蒂朗
R. White
Meidilan
无刺月季
R. carefree
无刺 3号
R.
‘inermis3’
无刺 4号
R.
‘inermis4’
无刺 11号
R.
‘inermis11’
荷花蔷薇
R. carnea
香水月季
R. odorata
光叶蔷薇
R.
wichuraiana
法国蔷薇
R. gallica
月季花
R. indica
0. 1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
0. 2 80 90 90 90 90 90 100 90 90 90
0. 5 70 80 90 90 90 90 90 90 90 80
注:A.法国蔷薇;B.白梅蒂朗;C.香水月季;D.月季花。
A,R. gallica;B,R. White Meidilan;C,R. odorata;D,R. indica.
图 2 在含 0. 1 mg /L NAA的培养基中不同蔷薇属植物幼苗生根情况
Fig. 2 The rooting of Rosa spp. plants
3 结论与讨论
有关蔷薇属植物快繁的研究最早是在聚花月季(Rosa
multiflora)上,并成功进行了其芽的繁殖和诱导幼苗生根[15]。
随后,涌现出大量对有关蔷薇属植物组织快繁研究情况的相
关报道。
纵观近 20年来的研究报道,细胞分裂素、生长素和赤霉
素都被广泛用于蔷薇属植物组织培养中。细胞分裂素有利
于提高丛生芽的数量,6-BA 被认为是最有效的细胞分裂
素[15 -17],在蔷薇属植物组织培养中,6-BA的浓度一般在 0. 5
~3. 0 mg /L,并常与生长素联合使用,低浓度促进生长,高浓
度引起玻璃化[13]。生长素可以诱导细胞的伸长,在蔷薇属
组织培养中最常使用的是 NAA。另外,在增殖培养基中加入
低浓度的 GA3 能进一步改善芽的繁殖,提高增殖率
[18],有利
于不定芽的伸长[19 -21]。
在诱导腋芽萌发阶段,10 种蔷薇属植物在诱导培养基
MS +0. 5 mg /L BA +0. 1 mg /L NAA上均可萌发腋芽。萌发
的腋芽健壮,叶片舒展。当将腋芽继代到所试增殖培养基上
后,反应各不相同。有些继代生长很好,有些出现黄化死亡,
可见,萌发后的腋芽在继代过程中受植物激素的影响较大。
(下转第 20420页)
7230239卷 33期 郭艳超等 蔷薇属植物无菌体系的建立
3 结论与讨论
3. 1 结论 以乙醚为溶剂,采用水蒸气蒸馏法分别对陕西
产和江苏产延胡索药材挥发油进行提取,其出油率分别为
0. 240 0%、0. 216 4%。从陕西和江苏产药材挥发油中分别
鉴定出 35种和 30种化合物。2个产地挥发油主要化学成分
的种类和含量接近,其含量最高的均为 4-甲氧基-2-羟基苯乙
酮,含量分别为 24. 52%和 18. 43%,其次是 2-β-甲氧基-5-α-
胆甾烷酸、棕榈酸等,单萜及单萜类衍生物含量最少,但相对
百分含量也有显著差异。陕西样品挥发油中检出的雪松烯、
雪松烯醇、3-苯基-2-丙酸、刺柏烯、松香芹酮在江苏药材中均
未检出,说明不同产地延胡索挥发油的种类有一定差异。这
些差异可能与延胡索分布区的气候、温度和降雨量等不同有
关,也可能与样品的贮存环境、前处理过程和仪器设备的检
测灵敏度差异等有关。
3. 2 讨论 挥发油中的多种化学成分都存在生理活性,具
有一定的工业和医药价值。这些组分的活性与该药材的功
效具有一定相关性,如 a-没药醇已被证实具有消炎和解痉挛
的作用,欧洲民间广泛用于医疗[5]。在 2个产地均含有的 4-
甲氧基-2-羟基苯乙酮,又称丹皮酚,是一种具有镇痛、治疗心
血管病、抗肿瘤等功效的活性物质[6]。由于延胡索挥发油的
化学成分和含量不同,其药理作用及药效也不同。因此,该
研究为不同产地延胡索挥发油的化学成分分析提供了科学
依据,并为商品延胡索及中成药的质量控制提供了参考。
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207 -209.
(上接第 20327 页)
其中光叶蔷薇和荷花蔷薇在继代增殖过程中,必须添加
0. 1 mg /L的 GA3 才能得到较好的增殖效果,丛生芽也生长较
好。其余 8种植物材料在添加 0. 1 mg /L GA3 的培养基上表
现出丛生苗枝叶紧凑,叶片狭小;在去掉 GA3 的培养基上则
表现为丛生苗舒展,叶片大小适中。在生根阶段,10 种植物
材料在含 NAA的培养基上均能生根,但在含 0. 1 ~ 0. 2 mg /L
NAA的培养基上生根最佳。
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02402 安徽农业科学 2011 年