全 文 ：果 树 学 报2 3 0 0 , 2 0 ( 4 ) : 3 0 5一 3 0 9
J o u nr
a l o f F ur i t S
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i
e n e e
草苟属低倍性野生资源在育种中
利用的研究进展
马鸿翔 ’ ,2 陈佩度 “
` 江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 , 江苏南京 21 001 ;4 2南京农业大学农业部作物细胞遗传
重点开放实验室 ,江苏南京 21 00 9 5)
摘 要 草毒低倍性野生种中蕴藏着丰富优良性状的基因资源 , 由于染色体倍性差异 , 将野生低倍性种质优良性状
基 因向栽培种凤梨草毒转移存在一定障碍 。 对采用有性杂交结合染色体加倍 、原生质体培养和体细胞融合获得种间
杂种的技术作了综述 ,并对种间杂交后代的鉴定作了简介 , 同时展望了我国原产草毒低倍性野生种质导人栽培品种
的意义和技术途径 。
关键词 草毒 ; 野生种质 ; 远缘杂交
中图分类号 : 5 66 8 .4 文献标识码 : A 文章编号 : 10 9一 9 98 0( 2o 3) 04一 305一 05
A d v a n c e s in R e s e a r c h o f U s i n g W i ld S t
r a w b e r r y S P e c i e s W i t h L
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P l o i d y i n S t r a w b e r yr B er e d i n g
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e u lt iv a t e d s t ar w b e叮 (丹`谬犷艺a an an as s a D u e h . ) . I t w o u ld b e q u it e u s e fu l t o u s e i n e o甲 o ar t e t h e s i n gl e e h a ar e t e r o f th e n a t iv e
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e叮 s p e e ie s o r t h e g e n o m e o f th e m t o bor ad e n i n g t h e g e n e t ie b a s is o f e u lt iv at e d s tarw b e叮
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s t a n t g e n o m e o f n a t iv e s p e e i e s a l w a y s b ir n g ab
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v ie w e d i n t h i s a rt i e le ; s o m e id e n t i if e at io n m e t h o d s o f hy b ir d o fs p ir
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K e y w o r d s S tawr b
e叮 ; N at i v e s t r a w l〕e呵 s p e e ie ; I n t e sr p e e i e s hy b i d i z at i o n
世界上草毒属植物约有 50 个种 , 由 x2 、 x4 、 x6 、
s x 等一系列染色体倍性构成 ,其中只有八倍体凤梨
草毒 (斤吧盯 at an an as 、 a )被广泛栽培利用 ,其余的多
为野生状态 , 分布于亚洲 、 美洲和欧洲的原产地 l[] 。
凤梨草毒为八倍体种弗州草葛 (R : i娜 in an a) 与智利
毒 (只 ch ilo 。。 司间的杂种 , 至今 尚无 明确证据证明
其余低倍性种对凤梨草葛栽培品种形成的贡献 ,分
布最广泛的二倍体种森林草毒 (只 二 ; 。 a) 可能是其
原始种之一 。 通过对草每品种的系谱和遗传多样性
分析 ,认为 目前栽培品种的遗传背景狭窄 2[] , 遗传多
样性的缺乏导致对病虫害和逆境抗性的减弱 ,新 品
种培育也因此受到限制 。 草墓野生种特别是低倍性
野生种质 中蕴藏着丰富的具有独特香气 、 四季结果 、
休眠浅 、 抗逆境及病虫害等优良性状的基 因资源 l,3 ,
4]
,这些资源可以作为栽培种凤梨草葛改 良的重要材
料 。 因此草毒育种家们十分重视将低倍性野生种质
的优良性状基因导人凤梨草墓 , 以克服草毒栽培品
种内的基因资源的贫乏 。
1 低倍性野生种质与栽培品种杂交的
障碍
自 Y a m el ls, 司系统地开展草毒种 间杂交以来 , 草
收稿日期 : 20 2一 10一 14 接受日期 : 20 03 一04 一 n
基金项 目 : 江苏省自然科学基金 ( B K 20 01 4 17 ) 。
马鸿翔 ,男 , 研究员 。
DOI : 10. 13925 /j . cnki . gsxb. 2003. 04. 016
果 树 学 报 20卷
葛育种工作者已做了不少努力 。 栽培种凤梨草毒为
八倍体 (Z n =x 8 =5 ) 6, 而草蓦属野生种除了少数为 4x
和 6 x 外 ,多数为 x2 , 具有优 良性状的 2x 野生种在
染色体倍性上与 8x 栽培种凤梨草毒存在很大差异 ,
因此 ,尽管在 2x 种间杂交取得 了部分成功 ,但采用
直接杂交的方法把 2x 野生种的特性结合到 8x 栽培
种 中却往往难以奏效 , 出现了杂交不结实 、 杂交种
种子不发芽 、 幼苗死亡 、 杂交种不育或育性太低而
难以做进一步杂交等现象卜 l0] 。 葛会波等日’ l利用我国
收集的二倍体森林草毒与凤梨草毒杂交 , 3 个组合
25 朵花也未能获得真正杂种 。
杂种 , 以此材料再与 x8 栽培种杂交得到了少量可育
的 I Ox 杂种 。 E l li s [, 9]用加倍的 4 x 森林草葛与 16 x 凤
梨草毒杂交也获得了高度能育的 10 x 杂种 。 此后 E -
va sn 陈 2l] 介绍了涉及 5 个草毒低倍性种质导入 8x 栽
培种的方法 。 其技术路线如下 :
( l ) Zx x Z x ( 2 ) Z x x Z x ( 3 ) Z x x 6 x ( 4 )6 x x Z x
2 x
上工
丰
4 x 火 4 x 4 x 4 x x 4 x x 4 x
丰丰 丰 丰
2 低倍性草蓦野生种质利用的方法
.2 1 染色体加倍结合有性杂交
2
.
1
.
1 染 色体加倍 采用秋水仙素处理 2x 种使染
色体加倍 , 或将不育的五倍体杂种染色体加倍 ,则
可获得可育的新类型 ,进一步可作为与栽培种进行
种间杂交的材料 。 在染色体加倍的研究中 ,最早的
报道是 D e mr en 和 D a r o w lz[] 以秋水仙素处理获得了
4 x 的森林草毒和 16x 的凤梨草毒 。 H u l 31用 .0 2%
秋水仙素处理凤梨草毒 (8x )与智利草毒 ( 8x )的杂交
种子 ,发现多数植株是 s x ~ 16x 的嵌合体 。 P et or v 等 l4]
用秋水仙素处理东方草毒 ( .F or i o nt 威、 ) (4x )种子得
到 了 s x 的加倍植 株 。 试 验分别 用 .0 05 % 、 0 . 1% 、
.0 2%
、
.0 4%和 1%的秋水仙素处理 ,结果表明草葛实
生苗具有耐 0 . 1%浓度的秋水仙素溶液的能力 。
在处理方法上 , S e b a s t i a m e n t 等 I,习设计了 4 种不
同处理方法 :秋水仙素浸泡法 i( m m er is on ) 、 吸油绳法
(w i
e k )
、 毛细管法 (t u b e ) 、 小液滴法 (d r o p p e )r 。 结果表
明 ,草毒实生苗对秋水仙素的敏感程度取决于被处
理的器官 , 将 实生苗完全浸入秋水仙素溶液 中 ,
1
.
5%的浓度使其完全致死 。 当仅处理茎尖 时 , 即使
浓度达到 3%时 , 成活率也超过 75 % , 以 2%秋水仙
素处理茎尖 24 ~ 28 h ,可得到高频率的多倍体 , 小液
滴法处理茎尖优于毛细管法 ,不 同的草毒种对秋水
仙素加倍具不同的结果 。 N i e m ior w i e z 一S i z e y t t 等 [ ,冈用
.0 0 1% 和 .0 0 5% 的秋水仙素添加人培养基 中增加了
森林草葛茎尖培养多倍体产生 。 雷家军等 1n[ 也对草
毒茎尖接种在含秋水仙素的培养基上使草蓦染色
体加倍的方法进行 了研究 , 通过对种子组培加倍 、
种子药液加倍的比较 , 发现利用组织培养技术诱导
染色体加倍效果最佳 。
2
.
1
.
2 杂交的技术路线 S co lt s]用经秋水仙素处理
得到的 4 x 森林草毒与 8x 凤梨草毒杂交产生 了 6x
4 x 4 x s x 4 x 4 x
丰工 工工 丰丰毒工
s x s x s x s x
Eva ns 2[, 23]发表了利用染色体加倍与有性杂交相
结合方法来源于 x2 野生种森林草蓦 , 绿色草蓦 ( 只
: ir id 、 )和西藏草葛 (只 nu b io ol a) 的人工合成 8x 杂种
G u e lP h 5 0 1 和 G u e lp h 5 0 2 。 G u e lP h 5 0 1 以 只
m o s e h at a (6
x
)和西藏草葛 ( Z x )的种 间杂种加倍而得 :
G u e lp h 5 0 2 是以森林草毒 (Z x )和绿色草毒 (Z x )的种间
杂种加倍再与西南草毒 (双 noI uP i ne ns is )件x) 杂交 ,然
后再将所得后代加倍而育成 。 uG el p h 5 0 1和 uG el p h
5 0 2 具有草毒生产中的重要性状 , 如迟花 、 花梗直
立 、 每株花序多 、 植株长势强 、 风味独特等 。 San ig a -
co m o 和 Sul h va n[ 刊评价了以此两材料为基础与栽培
草毒杂交的 3一 4 代园艺性状 ,发现通过远缘杂交和
选择的遗传材料花粉育性有了改 良 , 且已不是产量
的限制因子 , 产量和果实大小等同于或高于对照品
种的平均值 , 有些表现出四季结果 的习性 。 B au er f25]
通过染色体加倍与有性 杂交获得 了 1 x0 森林 一凤梨
草毒 品种 lF or k a , 果实中等大小 , 香味浓 ,适 于多年
一栽和 自采栽 。 rT aj k vo sk il闺利用 8x 的栽培种与 4x
森林草葛杂交所得的材料与 8x 栽培种回交进行性
状改良 , 所得材料在果实大小 、 硬度等方面仍不理
想 ,此后又通过杂交 、筛选 , 获得 了性状接近栽培品
种 的品系 9F 35 2 0 0 3 ,具有森林草毒的风味 , 抗叶部
病害 ,可育网 。
.2 2 体细胞融合
.2 2
.
1 草毒原生质体分 离与培养 2 0 世纪 80 年代
末期至 9 0 年代初期 , Kur l28[] 、 Ju n g n i e k e l囚 、 e a一l e t t a [翔
和 Sul h va n 31[] 提 出通过原生质体培养及体细胞杂交
手段向栽培种凤梨草幕转移低倍性草葛野生种质的
有用基因 。 N ym an 等 32[ 问研究了凤梨草毒叶肉原生
质体培养技术 , 以 Sen gan a 和 C an og a 两品种 的离体
培养植株为材料 ,酶解其叶肉原生质体获得了再生
植株 , fu af nt e 等134 也获得了森林草幕的再生植株 。
4期 马鸿翔等 :草墓属低倍性野生资源在育种中利用的研究进展
l )材料处理与原生质体分离 :原生质体培养的
成功与否与基 因型有很大关系 ,不同种间以及 同种
不同品种之间的原生质体分离与培养有很大差异 。
N ym a n 等 32[] 的试验表明 , 在同样 的条件下 , Sen g an a
从叶肉培养形成的原生质体产量比 Can go a 高 。
草毒原生质体分离使用较多 的材料是叶肉 , 利
用组织培养的试管苗叶片和叶柄切碎加以处理获
得 了成功 132 一 34] 。 利用愈伤组织和悬浮细胞制备草毒
原生质体 国内已有报道 , 史永忠阅等从草毒花药诱
导愈伤组织经继代培养 ,分离原生质体 , 经培养 获
得 了多细胞团 , 李卫东等 361[ 以宝交早 生草毒为试材
进行花药愈伤组织培养 , 诱导 出胚性愈伤组织 ,初
步建立了细胞悬浮系 , 为草葛愈伤组织为材料的原
生质体培养提供了基础 。
分离草毒原生质体受到酚类物质 的阻碍 , 一般
用于植株无性繁殖的培养基不适用于草毒原生质
体培养 。 在茎尖诱导培养基上茎尖能产生短叶柄 、
皱缩叶片 , 不产生根 ,在这种培养条件下 , 酶处理后
仅能产生极少量的原生质体 。 当茎尖转移到无激素
的培养基上会产生具伸展叶片 、 叶柄 、根的植株 , 但
原生质体产生量仍然很少 。 通过降低糖浓度可使原
生质体产量明显增加 ,方法是将幼嫩茎尖从诱导培
养基转移到无激素及低糖浓度 ( 1%蔗糖或葡萄糖 )
培养基 , 2一 3 周后再分离原生质体 f32] 。 N ym an 3I] 通过
进一步试验认为在茎尖诱导培养基中高 B A 含量不
影响原生质体的产量 , 在含 Z m留 L B A 的培养基上
培养的茎尖所分离 的原生质体每克鲜重达 3 . 3 xl 0 “
个 。 在森林草 毒的培养上 , 采用 了将茎尖移到 含
l m g / L B A 和 1% 蔗 糖 的培 养基 中培养 2 周 ,再
在黑暗中培养 1 周的方法获得 了成功 34[] 。 因此在酶
解之前通过预培养可有利于原生质体的分离 。
分离草蓦原生质体的酶液主要是纤维素酶和
果胶酶 。 通常采用一步法 , 即将棍合酶液中所有成
分配在一起 , 酶解一次完成 。 幼嫩叶片去壁相对容
易 , l %的 C e l l u l y s i n 、 0 . 1%的 M a e e r o z y m e 或 0 . 0 5%的
p e e to l y a s e 对草薄来说即可达到要求 。 p e e t o l y a s e 对
提高草葛原生体产量有利 ,但降低了植板率 132 ,3] 。 不
同基因型的材料对酶液反应不 同 , 森林草葛以 2%
的 C e l l u l a s e R 10 、 0 . 4%的 M a e e or z ym e 效果较好 134 。
2 ) 原生质体培养 : 液体培养方式具有通气性
好 、 便于添加培养基 和转移培养物的优点 , 草蓦原
生质体培养常采用此法 , 但草毒原生质体在液体培
养基中易聚集 。 采用琼脂糖包埋的培养方式可防止
原 生质体聚集 , 同时固定也使膜稳定 ,减少 了细胞
壁前体从原生质体的离散 , 另外此法还提供了一个
在不干扰细胞和不改变细胞密度的情况下改变培养
基的可能性 , 经常更换包围的培养基可能还会减少
细胞 生长所产生的抑制及有毒物质 3nI , 因此 比液体
培养效果好 l3[ 。
草毒原生质体生长相对缓慢 。 细胞壁形成 比烟
草慢 ,第 1 次分裂比烟草晚 1一 Z d 。 高的原生质体密
度刺激初期分裂 , 但在某些品种 中则抑制了其后 的
分裂 。 因此 ,稍低 的初期密度对持续生长 ,特别是对
在难以稀 释的胶状介质 中生长 的原生质体是必需
的 。 几天以后 ,一些品种形成了棕色沉淀物 ,可能是
酚类物质 ,将抑制其继续生长 。 相反 ,其他品种形成
了一些淡色多细胞的聚积体 38[] 。
葡萄糖是草葛原生质体培养 中理想的渗透稳定
剂和碳源 , 改变葡萄糖浓度不影响植板率 ,但降低渗
透压加快了细胞生长 , 减少了酚类物质生成量 。生长
素和细胞激动素的浓度在初期 的培养基 中也很重
要 , 部分草毒和野生草毒品种用附加 Z m岁 L N A A
和 0 . 5 m g / L T D Z 的改 良 s p 培养基 [ , 8]较用 1 m g / L Z ,
4一 D 和 .0 5 m盯 L B A 具较高的植板率倒 。
3) 植株的再生 :草毒原生质体先发育成愈伤组
织 ,然后分别诱导芽和根 。 相对而言草毒较易发芽 、
发根 ,植株再生时间短 。将愈伤组织转入 固定培养基
上诱导器官形成 , 分化培养基使用含有 2%蔗糖的
M S 培养基即可 。 T D Z 在低浓度时具有细胞分裂素
功能 , 在草毒芽分化上应用比 B A 效果好 , M S 培养
基上 附加 Z m岁 L B A 和 .0 2 m留 L N A A Z 个 月 后
60 %愈伤组织再生植株 。 在 TD Z 培养基上 自原生质
体发生的愈伤组织也能再生植株 3I] 。 而对于森林草
毒来说 , B A 就足够了 , 但森林草葛的再生植株率低
于栽培草蓦品种 l34] 。
.2 .2 2 体细胞融合 在体细胞融合中应用普遍 的是
PE G 化学融合和电融合 。 Wal in 等 l3n 使用化学融合
方法在草蓦上做了试验 ,原生质体能成功聚集 、 融合
并存活 ,但细胞壁形成缓慢 , 且分裂使原生质体固定
在培养皿底部 。 底部的条件对于生长不理想 ,从而导
致原生质体难以分裂 。 至新的细胞壁形成 1一 Z d 后 ,
快速生长的原生质体从培养皿底部释放出来 。 如果
原生质体被琼脂胶包埋则会刺激草葛原生质体的不
断生长3I] 。 但在 PE G 融合原生质体固定在底部之后
则无法刺激其生长 。
电融合在草毒上应用获得 了成功 , W al in 等国
通过电融合方法获得了森林草毒与凤梨草幕的体细
胞杂种 , 交流电场强度采用了 45 ~ 65 V / e m , 12 ~ 25 5 。
2 0 卷
高压直流脉冲强度为 1 0 0 0 ~ 1 30 V /c m , 5 0 协m 。
3 杂种后代的鉴定
.3 1 表型特征鉴定
表型特征有助于种间杂种的鉴定 。 早期种间杂
交研究的后代鉴定主要通过形态学特征 ,诸如植株
形状 、叶片形态 、果实性状等来鉴别种间杂种 。 形态
学评估是判断所 获得 的植株是否 有用 的基本而又
重要的标准 。 细胞学分析是另一种信息量大又相对
较容易的方法 。 体细胞染色体数目观察结合植株形
态特征可以推测出杂交后代的杂种本质 , 特别是对
于完全染色体组转移 ,可较 为可靠的证实其染色体
组成的不 同来源 , 因而在草毒种间杂交研究中被较
多地采用 1 ’ , ’“ ,2, 23, 25, 峋 。
.3 2 细胞学鉴定
草毒的染色体相对较小 , 利用体细胞染色体进
行细致 的染色体组成分析 , 如核型 、 染 色体分带分
析等有一定困难 , 而进行了杂交后代的 PM C 减数分
裂中期研究 , 观察 了染色体的配对特征 , 则可较好
地揭示种间杂种染色体的来源 15, 6, `“ ,40 ,l4] 。
.3 3 生化及分子检测
R F L P
、
R A PD 等 DN A水平的多态性 检测技术
可用作杂交后代更详细的 D N A分析 。 在 D N A 分子
检测技术发明以前 , 同工酶分析可作为一种简易 、
低价 的杂种分析方 法 , A ur l s e k a r 和 B r i n gh u r s t 等 l42]
较早阐明了草毒同工酶分析的方法 , 但未用于杂种
鉴定 。 D NA 分子技术应用于草墓育种始于 2 0 世纪
90 年代初 l43] ,对草毒属种质的分子标记研究 已涉及
R AP D t4,
4习 、叶绿体 D N A 限制性片段变异阅等 ,此技
术可进一步用于鉴定检测杂种后代的 D N A 组成 。
染色体倍数还可通过流体细胞仪快速 准确地测定
出 , W al l in l39) 采用 了流体细胞仪对原生质体融合的种
间体细胞杂种的 D N A 含量的测定来鉴定草墓体细
胞杂种 。
4 我国原产草毒野生种质的应用
近年来我国草葛生产得到了突飞猛进的发展 ,
但所用品种都为 国外引入或利用少数 国外 引进 品
种杂交而得 ,栽培草墓遗传背景狭窄影响了我 国草
毒的品种改 良 。 我国是草葛属植物原产地之一 ,俞
德浚 l1[介绍至少有 9 个种的分布 , 其中 7 个为 x2 种 ,
2 个为 4 x 种 ,雷家军等队 451 通过野生资源调查发现
另有 2 个野生种的分布 , 它们长期生长在野外 ,对
我 国各地的生态条件有 良好适应性 ,且多数果实可
食用 ,还具有果实芳香 、抗高温 、 抗旱或抗叶部病害
等特点 4[, 47, 48] 。 若能将这些野生种质的优良性状基因
导人凤梨草毒 , 对我国草毒品种改良和草毒生产无
疑具有重要意义 。 但由于我 国原产的草毒野生种质
的染色体倍性低 , 与栽培品种杂交亲和力差 ,要将野
生草葛 中的优良性状 的基因转入栽培品种存在着一
定的障碍 , 因此在草萄属低倍性野生种的利用上 ,可
借鉴国外野生草毒种质利用的方法 , 并及时吸收相
关学科最新研究成果 。 可考虑采取不同技术路线将
低倍性种质向栽培品种转移 , 如采用秋水仙素加倍
结合有性杂交 、 体细胞融合或采用未成熟胚拯救技
术克服杂交 中出现的障碍获得种 间杂种或双二倍
体 。 在此基础上将种间杂交后代的双二倍体与栽培
品种回交 ,通过染色体工程方法获得异附加系 、 异代
换系 ,利用辐射 、 组织培养等方法通过减数分裂时染
色体间交换重组获得异源染色体片段易位系 。 后代
材料可利用 P M C 染色体配对分析 、 荧光原位杂交
( FI SH )或 D NA 分子标记等方法鉴定被转移的外源
染色体或染色体片段 。 从而达到转移草毒属低倍性
野生种 中优良性状基因的目的 。 可喜的是 , 目前我国
对草幕野生种在育种中的利用研究已经起步 , 利用
染色体加倍或以五倍体 、 六倍体的草毒野生种作为
桥梁亲本与栽培品种杂交 ,取得了初步成果 1[ ’ , ’刀。 相
信通过进一步研究 , 完全可使多个野生种的优良基
因转人栽培草墓中 ,并剔除野生种质中的不利基因 ,
获得可在生产上应用的草幕新品种 。
参 考 文 献
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17 4 ~ 17 9
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