全 文 ：五种蔷薇属植物基因组 DNA的提取及鉴定
文晓鹏 1, 2　　　邓秀新 1
( 1.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室　武汉　 430070; 2.贵州大学农学院　贵阳　 550025)
摘要: 高质量基因组 DNA的有效提取是蔷薇属植物分子生物学研究的基础。本文以单宁、多糖含量高、极易褐化的 5种蔷
薇属植物的嫩叶 ,以及刺梨、月季组培苗和愈伤组织为材料 ,探索了改良 CTAB法、 SDS法及 CTAB微量法分离基因组
DN A的方法。 结果表明 ,采用材料裂解前加入不含 CTAB的缓冲液 ,及提取过程中用 4% β-巯基乙醇的改良 C TAB法 ,可
有效地控制田间材料的褐变及 DNA污染 ,分离出适合限制性酶切反应的高质量 DNA;该法获得的未经纯化的粗提 DNA
及 CTAB法分离的组培材料 DNA,可有效地用于蔷薇属植物基于 PCR扩增的分子生物学研究。
关键词　蔷薇属　 DNA提取　褐化
蔷薇属 (Rosa)植物有 200多个种 ,既包括玫瑰、月季等重要的观赏植物 ,也有果实中 Vc含量极高的新兴果树—— 刺梨 ,对该属
植物的亲缘关系鉴定 ,重要种质资源 DN A指纹图谱的构建 ,及品种遗传改良等研究在国内外受到广泛的重视 [1, 2 ]。植物高分子量及
高纯度基因组 DN A的获得是 PCR扩增 ,特别是限制性酶切等分子生物学研究的前提和基础。蔷薇属植物组织内单宁、酚类、色素及
多糖等物质含量丰富 , DNA被包裹在里面 ,在分离过程中 ,样品褐化严重 ,并出现粘稠的胶状物质 ,极大地制约了研究工作的开展。
最传统的做法是采用氯化铯梯度离心或柱层析纯化 DN A,但此法所需设备昂贵 ,操作繁琐 ,所需试材多 , DN A产量低 ,其应用受到
极大的限制。 本文对目前广泛采用的植物 DNA的 C TAB提取法进行了适当的修改 ,探索出针对田间幼叶、组培苗及愈伤组织等试
材的大量或微量提取方法 ,有效地分离出可用于 PCR扩增及限制性酶切的高质量 DNA。
1　材料和方法
1. 1　材料
贵农 5号刺梨 ( Rosa roxburghii T ratt cv. Guinong No. 5)、贵州缫丝花 (R . kweichonensis Yu et Ku)、金樱子 (R . laev igata
Michx )、萨曼莎月季 (R . chinensis Jacq cv. Sama tha )及多花蔷薇 (R .multiflora, Thumb)等种类的幼嫩叶片 ,刺梨、月季试管苗叶片及
愈伤组织。
1. 2　方法
1. 2. 1　 DNA的大量法提取
C TAB法: 参照 Po rebski等人的方法 [3] ,并做适当修改。具体操作为: 取尚未完全展开的幼嫩叶片 2～ 3g ,加入约 0. 5g非水溶性
PV P,在液氮中迅速研磨成粉末并转入 5 0ml离心管中 ,立即加入 15ml提取缓冲液 [ 0. 35M葡萄糖 , 0. 1M Tris -HCI ( pH7. 5) ,
0. 005MEDTA-Na , 2% PVP, 4% β -巯基乙醇 (现加现用 ) ] ,充分摇匀 ,冰浴 10～ 15min后 4℃离心 ,弃去上清液 ,沉淀物用于 DN A分
离 ;加入 15ml刚煮沸的裂解缓冲缓冲液 [2. 0 M NaCl, 0. 1 M Tris-HCl( pH8. 0) , 0. 02 M EDTA-Na , 2. 5% PV P, 2. 5% CT AB, 4% β -
巯基乙醇 (现加现用 ) ,轻轻摇匀 ,然后在 65℃下水浴 90min,冷却至室温 ;加等体积的氯仿: 异戊醇 ( 24∶ 1) ,轻轻颠倒数次 ,使管内物
成乳浊液 ( Emulsion) ,静置 20～ 30min,室温下 5 000g离心 15min,轻轻取上清液至另一离心管。 该步骤重复一次 ;加 1 /2体积 5M
NaCl至上清夜 ,轻轻摇匀以除多糖 ,然后加入 2倍体积的冰冻乙醇 ,上下颠倒混匀 , - 20℃下静置 15min,离心析出 DNA;用 70% ～
76%乙醇浸泡 DNA2～ 3次 ,每次 2～ 3h;风干后用 2ml T E溶解 ,加入 30μl浓度为 10μg.μl- 1的 RNA酶 , 37℃下处理 5～ 6h获得粗
提的 DNA;加入等体积 ( 2ml)平衡酚 (苯酚∶氯仿∶ 异戊醇 = 25∶ 24∶ 1)轻轻摇匀 ,离心后取上清液至新管 ,加入 1 /2体积 5 M
NaAc及 2倍体积的冰冻乙醇 ,离心沉淀出 DN A,用 76%乙醇浸泡 ,风干 ,加入 200μl TE溶解后即为纯化的 DNA, - 20℃保存备用。
SDS法 :参照Wilkie推荐的方法 [4] ,做适当修改 :提高 NaCl和β -巯基乙醇的浓度 ,以去多糖和防止褐化。提取缓冲液的组成 :
0. 1 M Tris-HCl, 1. 0 M NaCl, 0. 05 M EDT A, 4% β-巯基乙醇 , p H8. 0。
1. 2. 2　 DNA的 CT AB微量提取法
取 0. 05～ 0. 10g叶片或愈伤组织于 1. 5ml的冰冻离心管 ;加入石英砂少许 (约 0. 1g ) ,用灭菌的尖头玻棒快速将材料捣碎 ;立即
加入 600μlC TAB提取液 [ 0. 1 M Tris-HCl( pH 8. 0) , 1. 5M NaCl, 0. 05M EDTA , 1% PVP, 2. 5% CTAB, 4% β -巯基乙醇 ] ,轻轻混匀 ,
65℃水浴 60～ 90min;加入 700μl苯酚∶氯仿∶异戊醇 ( 25∶ 24∶ 1) ,轻轻倒置混匀 10min, 10 000～ 12 000r /min离心 5～ 10min,吸取
上清液转至另一离心管 ;加入 700μl氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1) ,轻轻倒置混匀 10min, 10 000～ 12 000r /min离心 5 min,小心吸取上层液
至另一离心管 ;加入 1ml冷冻无水乙醇 ,轻轻颠倒混匀 , - 20℃冰箱中放置 30min, 8 000～ 10 000r /min离心 2～ 3min后析出 DN A;
加 70%酒精 1ml浸泡 , 2～ 3后更换一次过夜 , 8 000r /min离心 3min后弃酒精 ,风干 ;每管用 50～ 100μl TE充分溶解 ,然后加入
25μRN A酶 , 37℃水浴过夜 , - 20℃保存备用。
·18·
种子　 Seed　 2002年　第 6期　 (总第 126期 )
国家自然科学基金及贵州省自然科学基金资助项目。
DOI : 10. 16590 /j . cnki . 1001 -4705. 2002. 06. 069
1. 3　 DNA的检测
1. 3. 1　含量检测
取 DNA原液 5μl稀释至 3m l,在 UV-1601型紫外分光光度计上测定 260nm及 280nm波长处的吸收值 ( OD)。 根据 OD( 260) /
OD( 280)比值确定 DNA的纯度 ,并通过 OD( 260)计算出 DN A的产量。
1. 3. 2　 PCR扩增及电泳检测
PCR扩增在 PTC-200( M J, USA) PCR仪上完成。 采用 25μl反应体系: 2mM MgCl2 , 0. 2mM dN TP, 0. 4μM随机引物 ( OPBA-
435, CAGCGACTGT; OPAA-07, CTACGCTCAC) , 1. 2U Taq, DN A多聚酶 ( Pr omega生产 ) ,及 40ng模板 DN A。扩增程序为:第一
循环 94℃变性 2min, 37℃退火 1min, 72℃延伸 2min;接着 40个循环 94℃变性 1min, 37℃退火 2min; 72℃延伸 2min;最后 72℃延伸
10min。 扩增产物在含有 ( 0. 5～ 0. 6μg. ml- 1 ) EB的 1. 6%琼脂糖凝胶上电泳检测 ,在紫外凝胶成像仪上观察照像。
1. 3. 3　酶切检测
取一定量的模板 DNA,按 5U.μg- 1DNA的标准加入限制性内切酶 EcoR I或 HindⅢ ( Promega生产 ) , 37℃酶切过夜 ,琼脂糖凝
胶电泳检测。
表 1　大量法及微量法提取 DNA的产量及纯度
材料 外观 OD(260) /OD ( 280) DN A产量
CT AB SDS CT AB( Mini ) C TAB SDS CTAB(Mini ) CT AB SDS CT AB( Mini )
刺梨
1幼叶 白色 褐黄色 淡黄色 1. 87 1. 38 1. 65 21. 7 45. 2 31. 5
2组培苗 淡黄色 1. 71 34. 8
3愈伤 白色 1. 73 17. 6
贵州缫丝花 白色 褐色 1. 78 1. 29 18. 1 47. 9
金樱子 白色 淡褐色 1. 70 1. 35 23. 1 55. 9
月季
1幼叶 白色 淡褐色 淡黄色 1. 82 1. 58 15. 5 43. 7
2组培苗 淡黄色 1. 75 30. 6
3愈伤 白色 1. 78 28. 6
多花蔷薇 白色 淡褐色 1. 95 1. 39 19. 3 42. 5
2　结果和分析
2. 1　 DNA的产量及纯度
不同的方法提取的 DNA在产量
上存在很大差异 (表 1)。 其中以 SDS
法的产量最大 ,在 42. 5～ 55. 9ng·
mg- 1鲜重之间 , CTAB微量法次之 ,
而 CTAB法最低 ,仅为 15. 5～ 23. 1
ng· mg- 1鲜重。 CT AB法提取愈伤组
织 DNA时 ,产量非常低 ,几乎检测不
出来 ,这可能是该方法的实验流程过
多 ,致使 DN A损失严重。
在质量上 ,以 CT AB法最好 ,分
离出的 DNA均为白色 , OD( 260) /OD
( 280)比值在 1. 70～ 1. 95之间 ,分子量大在 23Kb以上 (图 1); SDS法最差 , DN A呈褐色至褐黄色 ,个别样品如金樱子呈粘稠的胶状
物 ,很难溶于 TE, OD( 260 /280)比值为 1. 29～ 1. 58,不宜用于分子生物学研究 ; C TAB微量法获得的 DNA质量较好 ,外观为白色至
淡黄色 ,在月季和刺梨上 ,根据所用的材料不同 ,其 OD( 260 /280)比值为 1. 65～ 1. 78。
以随机引物 OPBA-435进行 RAPD扩增 ,电泳分析显示 (图 1) ,无论哪个种 ,采用 CTAB法分离的 DNA均可扩增出清晰的带
纹 ,可有效地用于基于 PC R扩增的分子生物学研究。采用 EcoR I对 CTAB法分离出的 DN A进行酶切 (图 3) ,发现酶解充分 ,电泳后
产生均匀的模糊 ( Smea r )条带。
实际工作中 ,特别是对组培材料进行分子生物学研究时 ,实验材料常常很少 ,建立稳定可靠的 DNA微量提取技术十分必要。我
们采用 OPAA-07引物检测刺梨试管苗及愈伤组织 DNA微量提取技术的可靠性 ,结果表明 (图 2) ,采用 CT AB微量法分离出的
DN A的扩增带与 C TAB大量法一致。这意味着本研究中的 DN A的 C TAB微量提取法 ,可有效地用于蔷薇属植物组培的 PCR研究
中。
图 1　 5种蔷薇属植物
基因组 DN A电泳图
注: 1.月季 , 2.刺梨 , 3.多花蔷薇 , 4.金樱子 , 5.
贵州缫丝花 , M:λDN A/ HindⅢ标记。
图 2　 5种蔷薇属植物的
POBA-435( AAGCGACC TG)扩增图
注: 1.月季 , 2.刺梨 , 3.多花蔷薇 , 4.金樱子 ,
5.贵州缫丝花 ,M: 1kb标记。
图 3　刺梨基因组 DN A的 CTAB提取法
的 OPAA- 07( C TACGCTCAC)扩增
注: 1.愈伤组织微量法 , 2.试管苗微量法 , 3.
嫩叶大量法 , 4.嫩叶大量法粗提 DN A, M:
1kb标记
·19·
种子　 Seed　 2002年　第 6期　 (总第 126期 )
2. 2　 DNA中蛋白质对 PCR的影响
为了验证 DNA样品中蛋白质对 PCR的影响 ,将去除 RN A后尚未纯化的 DN A进行检测。 外观上 ,采用 C TAB法提取的 5种
DN A的颜色在纯化前后差异不大。 OD比值变化也不大 ,在 1. 68～ 1. 95之间。 但 DNA的产量很高 ,为 43～ 63 ng. mg- 1 ,比纯化后
的产量高 1～ 2倍 (表 2)。 用 O PAA-07引物在刺梨上进行扩增 ,发现无论 DNA纯化与否 ,其 RAPD带纹一致 (图 2)。 因此 ,在一定
范围内 DN A样品中蛋白质含量的高低 ,可能不是影响 PCR扩增的重要因素 ,这和汪小全等在银杉等植物上的研究结果一致 [5];
Wilkie等在葱属植物的研究上 ,用 DN A的粗提样品与氯化铯纯化的样品进行 RAPD分析 ,也获得了同样的结果 [6]。 实际上 , DNA
提取、纯化过程中的残留成分 ,如 CT AB、 SDS、苯酚、氯仿、异丙醇或乙醇等去垢剂或蛋白质沉淀剂 ,会严重影响扩增结果 [5]。
DN A的纯化过程复杂、烦琐 ,所需药品也较昂贵 ;同时 ,若操作不熟练 ,样品中掺杂苯酚、氯仿等有机物 ,反而会影响 Taq多聚
酶酶的活性。 改良 CTAB法分离的 DNA可不经纯化 ,直接用于 PCR扩增。 但是 ,用 EcoRI和 HindⅢ检测表明 ,未纯化的 DNA不
能用于酶切 (未列出 )。
图 4　 CTAB法分离 DNA的 Eco R I酶切电泳图
注: 1.月季 , 2.多花蔷薇 , 3.金樱子 , 4.刺梨 , 5.贵州缫
丝花 , M: 1k b标记。
表 2　蔷薇属植物未纯化 DNA的检测
材料 颜色 OD( 260)
OD( 280)
DN A产量
( ng. mg- 1f resh w eigh t )
刺梨 白色 1. 87 43. 2
贵州缫丝花 白色 1. 71 52. 1
金樱子 白色 1. 68 63. 7
月季 淡褐色 1. 83 47. 4
多花蔷薇 白色 1. 92 56. 1
2. 3　样品的防褐
蔷薇属植物的酚类、单宁及色素含量高 ,采用 SDS提取法褐化严重 ,有色
物质将 DN A包裹起来 ,很难溶于 TE缓冲液。 CTAB既能裂解细胞 ,又是去垢
剂 ,能有效沉淀次生物质。 但采用经典的 CT AB法时 , DN A褐化现象也很严
重 ,特别是月季和刺梨。在样品裂解前用不含 CTAB的提取液进行前处理 ,同
时将 p-巯基乙醇浓度提高到 4% ,可有效防止样品的褐化 ,获得白色的模板
DN A。
采样时期对褐化有一定的影响 ,在刺梨上尤为突出。 一般情况下 ,刺梨能
抽春、夏和秋三次新梢 ,褐化最轻的是尚未完全展开的春梢叶片 , DNA的产量
也最高。 采样后的保存时间也有一定作用 ,以现采现用最好 ,在- 20℃下保存
不宜超过两周。
3　讨论
高质量的 DN A是蔷薇属植物分子生物学研究的前提和基础 ,不同研究
目的对 DNA的纯度和产量要求不同。以 PCR为基础的遗传分析 ,要求 DN A
的量能使用 100次以上 [4] ;质量上 ,酶切反应要求较高 ,而 PCR扩增要求相对
较低。 DN A的质量和产量通常是对立的 ,任何提取方法都是在质量和产量之
间折中考虑的结果。
植物 DNA的分离通常采用 CT AB或 SDS破坏细胞膜 ,使细胞内含物释放出来 ,但 CTAB通过与 DN A结合形成复合物 ,有利
于 DN A与变性蛋白及多糖分开 ,而 SDS是与蛋白质和多糖结合成复合物 ,经离心后与 DNA分开。DNA样品中酚类、单宁及多糖等
次生物质含量过高 ,会抑制 Taq多聚酶及限制性内切酶的活性 [5, 7, 8]。 采用通常的提取方法 ,特别是 SDS法 ,蔷薇属植物田间材料基
因组 DNA污染严重 ,影响 PCR的稳定性和酶切效果。 许多研究显示 ,在提取液中加入 β -巯基乙醇和水溶性的 PVP,可抗氧化并除
去酚类物质 ;也有在菊属植物上用非水溶性 PV P,及在梨上用 Vc取得最好效果的报道 [9, 10 ]。 本研究通过用不含 C TAB的提取液进
行前处理 ,提高 β-巯基乙醇的浓度 ,并结合适当使用 PV P和较高浓度的 C TAB,有效地防止了样品的褐化 ,获得了分子量大而纯化
的基因组 DN A。 D-巯基乙醇有毒 ,一般来说使用浓度在 2% 以下 [3, 4, 11 ]。在蔷薇属植物上 ,当 β -巯基乙醇浓度在 3%以下时 ,尽管也采
用前处理 ,褐化现象仍很严重。 只有在 4%左右时 ,才能得到有效的控制。
关于除多糖的方法 ,国内外报道较多 [3, 12～ 14]。很多人集中于高浓度的盐 [3, 12 ];程运江等先用乙醚和 NaCl将大部分多糖去除 ,再
沉淀 DNA可大大提高效率 [14 ]; Candelario等通过调节材料的取样时期、使用量 ,在氯仿处理后加含 2% CTAB的分离缓冲液 ( Sepa-
ra tion buffer ) ,及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖 [13 ]。我们借鉴 Po rebski等人的方法 [3 ] ,发现大部分材料效果较
好 ,唯金樱子例外 ,仍呈粘稠状。但通过样品裂解前进行前处理 ,情况得到很大程度的改善 ,可能所采用的提取液不单能防褐 ,也有助
于对多糖等次生物质的清除。
参考文献
1　陈向明 ,郑国生 ,孟丽 .玫瑰、月季、蔷薇等蔷薇属植物 RAPD分析 [ J].园艺学报 , 2002, 29( 1): 78～ 80
2　 Balla rd R, Rajapakse S, Abbo t A, DN A markers in ro se and their use fo r cultiva r identification and genomic mapping [ J]. Acta
Ho r t, 1996, 424: 265- 268.
3　 Proberki S L , Bailey G , Baum R B, Modifica tion of a CT AB DN A ex tr action pro toco l fo r plant containing high poly saccharide and
po lypheno l compinents [ J]. Plant Mo l. Rep. , 1997, 12: 8～ 15.
4　Wilkie S,基因组总 DN A的分离 [ A ].植物分子生物学 -实验手册 [M ] , Cla rk MS主编 ,顾红雅 ,瞿礼嘉主译 ,北京: 高等教育出
版社 , 1998, 3～ 12
5　汪小全 ,周喻年 ,张大明等 . RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题 [ J].植物学报 , 1996, 39( 12): 954～ 962
·20·
种子　 Seed　 2002年　第 6期　 (总第 126期 )
6　Wilkie S E, Isaac P G , Slater R J, Random amplified polymo rphic DNA ( RAPD) markers for g ene tic analysis in Allium [ J]. Theo r
Appl Genet, 1993, 86: 497- 504.
7　 Deragon J M , Landry B S, RAPD and o the r PCR-based ana ly ses o f plant genomes using DN A ex tr action from small lea f disks
[ J]. PCR Methods Appl, 1992, 1: 175- 180.
8　 Uta P, Ingo S, M inipr ep method for iso la tion of DN A fr om plants w ith a high contant o f po lypho lics [ J]. Nucleic Acids Res, 1993,
21( 14): 3328- 3330.
9　戴思兰 ,陈俊愉 ,高英孚等 . DN A提取方法对 9种菊属植物 RAPD的影响 [ J].园艺学报 , 1996, 23( 2): 169～ 174
10　胡春根 ,郝玉 ,邓秀新等 . RAPD分析用的梨 DN A提取方法 [ J].遗传 , 1998, 20( 4): 31～ 33
11　张潞生 ,李传友 ,贾建航等 .猕猴桃雌雄性别的 AFLP鉴别中 DN A模板的制备 [ J].果树科学 , 1999, 16( 3): 171～ 175
12　 Dellapo rta S L, Wood J, Hicks J B, A plant DN A minipr epa ration: v ersionⅡ [ J] , Plant Biol. Rep. 1983, 1( 4): 19- 21.
13　 Candelario M J, Na talia D, Bruce P B, DNA ex t raction from severa l cacti [ J]. Ho r t Science, 2000, 35( 6): 1124- 1126.
14　程运江 ,伊华林 ,庞晓明等 .几种木本果树 DN A的有效提取 [ J].华中农业大学学报 , 2001, 20( 5): 481～ 483
The Ex traction o f Genomic DN A from Five Species of Rosa
Wen Xiaopeng1, 2 ,　 Deng Xiuxin1
( 1. National Key Labo ra tor y o f Crop Genetic Improvement , Hua zhong Ag ricultur al Univ er sity , Wuhan, China 430070)
( 2. Ag ricultural Colleg e, Guizhou Univ e rsity , Guiyang , China, 550025)
Abstract: Many species of Rosa are o f g reat o rnamental im po rtance, a s well a s surprising high Vc concentra tion in Rosa roxburghii
T rat t. To satisfy their inc reasing researches in Bio lo gy , the pro tocols fo r ex tr action o f high quality DNA from five Rosa species us-
ing modified CTAB, SDS, and miniprep CTAB method are described in the pr esent paper. These species contain high content of
polypheno l, tannin and poly saccharide compounds that prevent the DNA f rom isolation. The results suggest that, modified C TAB
method using ex traction buffer without CTAB befo re lysis buffer , and as high as 4% of β -mercapto ethanol in the pro toco l, the
brow ning and po ly saccharide contamination can be effectiv ely minmimized in fo lding leaves fr om field- g rown plant with C TAB
method. The DNA isolated with modified CTAB me thod can be used a s rest rict endonuclease enzymolysis, w hile its rough DNA
samples w ithout purfica tion, and the DNA of tissue culture ma teria ls isolated by minipr ep CT AB method a re effectiv e in PCR-
based analysis.
Key words　Rosa　 DN A ex trac tion　 Brow ning
(上接 9页 )
Requirements of Seed Germination of
Buddleja fallowiana Balf. f. et W. W. Smith
Sun Weibang,Kong Fancai
( Kunming Institute of Bo tany , the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204)
LAM-WING-HIME Mickael
( La-Reunion Univ ersity, Sainte Clo tilde, 97490 Reunion Island, France)
Abstract: B ud dleja f allow iana Ba lf. f. et W. W. Smith is an o rnamental shrub mainly na tiv e to Lijiang and Zhongdian o f NW Yunnan
at altitudes of 2700～ 3800 meter s. The seed is long elliptic, brow n and sur rounded w ith the w ing . The seed-size is some 0. 5mm×
0. 5m m, and th e 1000-seed-w eight is sbout 0. 055g . The experiments show ed ty at the germina tion rate if da y 15 w as 94% and 98%
respectiv ely with temperatures o f 20℃ and 25℃ under da rkness. Unde r the inhibited tempera ture o f 30℃ , lighting intensities o f 1
800lx～ 3 000lx and photoperiods o f 16h～ 20h could stimulate the seed ge rmination obviously . The seed germina tion could be ahead
o f 1～ 3 days if the light w as provided under the optimun tempera ture o f 25℃ . The highe r elev ation and the low er temperatur e of
the na tural habitat tog ethering with the requirements of the seed germination, ar e possibly one of the main reasons to limits natur al
r eg enera tion as a w eedy species.
Key Words　 Brd dlejs f allowiana Balf. f. et W . W . Smith　 Seeds　 Germina tion requirements
·21·
种子　 Seed　 2002年　第 6期　 (总第 126期 )