全 文 ：猕猴桃属种间体细胞杂种试管苗的抗寒性
万琳琛 肖尊安 ! 王英典 张崇浩 陈 星
北京师范大学生命科学学院，北京 #$$%&’(
摘 要 以中华猕猴桃与狗枣猕猴桃种间体细胞杂种无性系试管苗叶片为实验材料，分析了在 )$*、#$*、+*、$*
和,#’*温度处理下叶片细胞的可溶性蛋白质水平、超氧物歧化酶活性和过氧化物酶活性的变化。进行聚类分析的
结果表明：种间体细胞杂种无性系 -./ 和 -.#0 的抗寒性趋向于中华猕猴桃，而无性系 -.% 和 -.## 趋向于狗枣猕
猴桃。
关键词 中华猕猴桃1狗枣猕猴桃1体细胞杂交1抗寒性
中图分类号：2//03+ 文献标识码：4 文章编号：#$$#,55%$,（)$$#）,$0,#+%,$+
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狗枣猕猴桃原产俄罗斯，能耐较低低温 W#X，但其果实
小，商品价值低。通过猕猴桃属种间原生质体融合，
获得了中华猕猴桃（?+7),)@)3 +A),%6)6 D$3,+AB）与狗
枣猕猴桃（?B C#$#2)C73 S7F:I3）的四个体细胞杂种
无性系再生植株 W)X。研究这些体细胞杂种无性系是
否结合亲本的优良性状，是否具有较强的抗寒能力，
对于进一步研究体细胞杂种的遗传特征和改良猕猴
桃品种有较大的意义。
本文报道了在不同温度处理下，四个体细胞杂
种无性系与亲本试管苗叶片细胞的可溶性蛋白质含
量、超氧物歧化酶活性、过氧化物酶活性的差异，初
步探讨了体细胞杂种无性系的抗寒性差异。
# 材料和方法
@ 材料
中华猕猴桃和狗枣猕猴桃体细胞杂种克隆
-./、-.%、-.## 和 -.#0 试管苗，培养在 S2 培养
基（添加 $3’ IB Y 9 玉米素、0Z蔗糖）上。中华猕猴
桃子叶愈伤组织系再生试管苗 -)，培养在 S2 培养
基（添加 $3’ IB Y 9玉米素、0Z蔗糖）上。亲本狗枣猕
猴桃 .# 试管苗培养在 S2 培养基（添加 $3’ IB Y 9
[4、0Z蔗糖）上。培养温度 )+\)/*，光照强度
+ $$$ MF，光周期为照光 #/ <，黑暗 % <。称取 # 月左
右的试管苗适量叶片叶样于 #$$ I9 烧杯中，用
R7H7O:MI 封口，进行以下不同温度处理：! ,#’ *
0$ I:8； $* # <；# + * /$ <；$ #$* )+ <；% 室
温 )$*。
A 方法
#3)3# 蛋白质和酶提取液的制备 称取 $3’ B 叶样，
加入 )3$ I9 $3$’ I?M Y 9 G]&3% 磷酸缓冲液（R[2），
冰浴中研磨匀浆，+ $$$ H Y I:8 冷冻离心 )$ I:8，取
收稿日期^ )$$$,$5,)’ 接受日期^ )$$#,$#,)%
基金项目^国家自然科学基金资助项目05’&$’$#(。
万琳琛，女，硕士。
! 通信联系人。4AJ果 树 学 报 )$$#，#%（0）^#+%\#’#
_?AH87M ?O ‘HA:J 2;:=8;=
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2001.03.006
上清液，加入 !#的等量甘油，于$%&下保存备用。
!’%’% 可溶性蛋白的测定 依照林定波和刘祖淇等
方法()*，稍有改变。取适量上述酶液，加入 + ,- 蛋白
质测定试剂 ’!#（. / 0）考马斯亮蓝 1$%+，2’3#
（. / 0）乙醇，4’+#（. / 0）磷酸，摇匀，在 % ,56 至 ! 7
内用 3%1 型光电分光光度计测定 +8+ 6, 波长下的
9’:’值。重复 )次。用牛血清白蛋白（;<=）同步制作
标准曲线。根据下式计算蛋白质含量> 蛋白质含量
（,? / ?@A）B标准曲线查得的浓度（,? / ,C）D 稀释
倍数 D总体积（,C）/样品重量（?@A）。
!’%’) <9:活性测定 按 15E66FG-5H5I等方法 (2*，稍
有改变。2’+ ,C反应液中含 ) !C酶液，’+ ,F- / C
GJ3’4 磷酸缓冲液（K;<），!) ,,F- / C 蛋氨酸（LMH），
3+ !,F- / C 氮蓝四唑（N;O）、! 6,F- / C 乙二胺四
乙酸（P:O=），% !,F- / C 核黄素（最后加入核黄素），
反应温度为（%QR!）&，光照 Q -S，时间 % ,56。反
应结束后，立即在试管上盖上黑布终止反应。用 3%1
型光电分光光度计于 +Q 6, 处测定 9’:’值。以磷
酸缓冲液代替酶液作为最大光化还原管，以未光照
反应液为对照。重复 )次。一个酶活单位定义为抑
制 N;O还原率达 +#的酶液量。单位：T / ?@A。
!’%’2 过氧化物酶活性测定 依照林定波和刘祖淇
等方法()*，稍有改变。取酶液 ’!+ ,C，稀释至 Q ,C，
混匀。取酶液 ! ,C，加 ! ,C ’% ,F- / C，GJ+’的乙酸
缓冲液和 ! ,C ’!#愈创木酚，于 %+U)&下温育
! ,56。然后准确加入 ! ,C ’4#的过氧化氢溶
液，反应 % ,56。准时用 3%1 型光电分光光度计在
23 6, 处每隔 ) I 记录一次 9’:’值至 !+ I，即做
时间扫描。以不加过氧化氢的反应液为空白对照。重
复 ) 次。扫描曲线斜率为酶反应速率，以每分钟 9’
:’23增加 ’!为一个酶活单位。单位：T / ?@A。
% 结果与分析
!# 可溶性蛋白质水平的比较
如图 !所示，不同温度处理下各个细胞系自身
的可溶性蛋白质含量变化不大，总体的变化趋势十
分明显，根据各个细胞系可溶性蛋白质的平均含量
来看，狗枣猕猴桃的可溶性蛋白质水平最高（%’!2R
!’++ ,? / ?@A），其次为无性系 VW!!（!4’Q4R!’Q4
,? / ?@A），无性系 VW4、VW!) 和 VWQ 的可溶性蛋白
质平均含量依次降低，分别为 !%’3%R%’Q! ,? / ?@A、
4’42R’Q) ,? / ?@A 和 Q’Q2R%’%! ,? / ?@A，中华猕猴
桃的最低（3’!QR’+ ,? / ?@AX。体细胞杂种无性系
的可溶性蛋白质水平居于亲本之间，并且 VW!! 的
可溶性蛋白质含量接近于狗枣猕猴桃，表现出抗寒
性较强。
!! 超氧物歧化酶活性的变化
相对于 %&时的酶活性来说，超氧物歧化酶在
!&和 2&温度下活性降低；在 &和$!+&温度处
理时，酶活性均不同程度地提高，不同细胞系的超氧
物歧化酶活性降低和升高的差异较大（图 %）。抗寒
性最强的狗枣猕猴桃反应很稳定，酶活性变化不大，
平均值为 %8+’!QR!)’+2 T / ?@A。对抗寒力弱的中华
猕猴桃来说，其超氧物歧化酶活性在 !&和 2&下
降幅度很大，从 %%)’ T / ?@A 降低到 !)’! T / ?@A。
体细胞杂种 VWQ、VW!)、VW!! 和 VW4 的超氧物歧
图 ! 不同温度处理下超氧物歧化酶活性的变化
KY>狗枣猕猴桃；KZ：中华猕猴桃
@5?’% $%&’(’&’)* +, *-.)/+0’1) 1’*2-&3*) -41)/
1’,,)/)4& &)2.)/3&-/)*
KY> ! #$%$&’#()* KZ> ! +,’-.-/’/
) 期 !28
图 # 不同温度处理下可溶性蛋白质水平的变化
KY：狗枣猕猴桃；KZ：中华猕猴桃
5’6# 78346)* +, *+9-:9) ./+&)’4 %+4&)4& -41)/
1’,,)/)4& &)2.)/3&-/)*
KY; ! #$%$&’#()* KZ>! +,’-.-/’/
万琳琛等：猕猴桃属种间体细胞杂种试管苗的抗寒性初探
果 树 学 报 ! 卷
化酶活性变化依次减小。在#!$%时，狗枣猕猴桃、体
细胞杂种 &’ 和 &’!! 的酶活性增加较高，分别为
(!!)*、(!+)*、(!,)$ - . /01；中华猕猴桃、体细胞杂
种 &’2 和 &’!( 的酶活性增加较低，分别为 *3)+、
*2!)*、*,$)! - . /01。无性系 &’和 &’!!与狗枣猕
猴桃相似。
!# 过氧化物酶活性
不同温度处理后各细胞系过氧化物酶活性无
明显的规律性变化（图 (）。除体细胞杂种 &’!! 和
&’2 的过氧化物酶活性变化较大外，其它细胞系的
变化都比较小。以各温度的过氧化物酶活性的平均
值进行比较，体细胞杂种无性系 &’!! 的过氧化物
酶活性最高，达到（* 24$)25! ++!)4）- .678·/01；其
它细胞系依次为狗枣猕猴桃（! $!$)+54+)$）- .6·
/01、&’（! (!4)+5(!*)*） - .678·/01、&’!(（!
+$)+5!(()3） - .678·/01、中华猕猴桃（,3+)(5
((3)+）- .678·/01 和 &’2（32)+5$24)*）- .678·
/01。表明体细胞杂种无性系 &’!! 和 &’ 偏向于
狗枣猕猴桃，而 &’!(和 &’2偏向于中华猕猴桃。
( 讨 论
植物中可溶性蛋白质的含量和超氧物歧化酶
与其抗寒有密切的关系9(，$:。马铃薯抗寒品种可溶性
蛋白质水平增加与其抗寒力的提高是一致的。柑橘
品种的抗寒性强弱与 ;<= 活性呈正相关92:。抗寒性
强的紫云英> 在#,?#!!%的严寒气候下> 细胞内超
氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性增强93:。
本实验中，抗寒力强的狗枣猕猴桃叶片细胞含有高
水平的可溶性蛋白质，超氧物歧化酶活性高；而中
华猕猴桃叶片的可溶性蛋白质含量低，超氧物歧化
酶活性较低。但是，与狗枣猕猴桃相比，抗寒力弱的
中华猕猴桃在不同温度处理下，超氧物歧化酶活性
变化的幅度很大。因此，超氧物歧化酶活性高低及其
变化幅度应共同作为分析抗寒性强弱的指标。也有
报道指出，低温下（+%、$%和 !+%）凤眼莲超氧物歧
化酶活性随处理时间逐渐下降 9:，本试验中超氧物
歧 化 酶 活 性 也 出 现 类 似 的 变 化 ，只 有 在
#!$%下酶活性才升高，其原因仍不清楚。
植物在低温胁迫初期过氧化物酶活性明显提高
9,:，长时间的低温处理使过氧化物酶活性降低 9:。本
试验中 +%和#!$%处理的时间比较短，所以除 &’
在 +%的过氧化物酶活性降低外，其它都发生酶活
性不同程度的升高；4%下处理 2+ @ 后酶活性都有
所降低。从各温度的过氧化物酶活性的平均值来分
析，抗寒力强的狗枣猕猴桃酶活性比抗寒弱的中华
猕猴桃高，与低温下黄瓜幼苗过氧化物酶活性与耐
低温能力呈正相关的报道相似9,:。但是，有的体细胞
杂种如 &’!! 的酶活性高于狗枣猕猴桃，而体细胞
杂种 &’2 的酶活性却低于中华猕猴桃。所以，以过
氧化物酶平均活性分析抗寒力强弱还有待于进一步
研究。
利用单一抗寒生理指标分析多个细胞系时，会
遇到一些问题，如体细胞杂种无性系 &’!! 的可溶
性蛋白质水平和超氧物歧化酶活性的平均值都低于
狗枣猕猴桃，而过氧化物酶活性则高于后者，相似的
情况还出现在 &’2 和中华猕猴桃之间。因此，对多
个细胞系的多指标分析中需要综合进行分析。张德
舜等对多个抗寒指标用模糊聚类方法分析了常绿阔
叶树种的抗寒强弱，确定了常绿阔叶树种引种的优
化链9!+:。本试验用 ;A;;)+ 统计软件对体细胞杂种
无性系的可溶性蛋白质水平、超氧物歧化酶和过氧
&B;C + $ !+ !$ *+ *$
DEFGH I#########I#####I####I####I#####I
&’ 2
&’ !(
中华猕猴桃
! #$%&’&(%(
狗枣猕猴桃
! )*+*,%)-.
&’ !!
&’
图 $ 猕猴桃种间体细胞杂种抗寒性的聚类分析
%&’$ ()*+,-. /0/)1+&+ 23 42)5 6/.50-++ 32. +27/,&4618.&5+
8-,9--0 ! #$%&’&(%( /05 ! )*+*,%)-.
图 # 不同温度处理下过氧化物酶活性的变化
AJK狗枣猕猴桃LAJK中华猕猴桃
%&’# :-.2;&5/+- /4,&<&,1 81 ,.-/,7-0,+ 23 ,-7=-./,*.-+
AJ/! )*+*,%)-.0 AM：! #$%&’&(%(
!$+
! 期 #
化物酶活性的平均值进行了聚类分析，采用
$%&’(’)*%)(+ 聚类分析法，欧氏距离平方计算组间距
离，不同温度下测定的所有数据进行 ,- 的标准转
换。所得结果如图 .所示。无性系 /0和 /01与
狗枣猕猴桃聚为一类，抗寒性较强；/02 和 /0! 与
中华猕猴桃聚为一类，抗寒力较弱。用体细胞杂种
的叶片厚度、脯氨酸水平、电导率和丙二醛含量的
平均值进行同样的聚类分析，也得到类似结果34。
综上所述，分析不同温度下猕猴桃种间体细胞
杂种及其亲本的可溶性蛋白质含量、超氧物歧化酶
和过氧化物酶活性，发现体细胞杂种无性系 /0
和 /01 的抗寒性遗传趋向于狗枣猕猴桃，而体细胞
杂种无性系 /02 和 /0! 的抗寒性遗传趋向于中
华猕猴桃。
参 考 文 献
34 刘祖祺，张石诚5植物寒害及抗寒生理3645北京7高等教育出版社，
88.51-.!5
394 肖尊安，韩碧文5猕猴桃属种间体细胞杂种3:45植物学报，88; ,- ;5
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3#4 陈少裕 5膜脂过氧化与植物逆境胁迫 3:45 植物学通报，818<2：
9-9;5
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其同工酶活性的影响3:45园艺学报，882<9!：!1.-!125
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国草地，88#314 刘成运<孟庆梅5冷害条件下凤眼莲某些生理特性变化的研究3:45
武汉植物学研究，88!<：!.#-!#!5
384 马德华，卢育华<庞金安5低温对黄瓜幼苗膜脂过氧化的影响3:45园
艺学报，881<9#：2-2.5
3,4 张德舜< 刘红权< 陈玉梅5八种常绿阔叶树种抗寒性的研究3:45园
艺学报，88.<9：91!-91;5
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遗传的初步分析 3:45 北京师范大学学报 U自然科学版V<9,,,,-,.5
万琳琛等：猕猴桃属种间体细胞杂种试管苗的抗寒性初探