全 文 :2015 年第 1 期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol.29 No. 1
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柑橘属植物疫霉病菌检测与鉴定的研究进展
廖 芳1 朱林慧2 牛春敬1 罗加凤1 任学毅3 黄国明1 李关荣2
(1.天津出入境检验检疫局 天津 300461;2.西南大学南方山地农业教育部工程研究中心;3.重庆市食品药品检验所)
Progress on detection and identification of Phytophthora spp. in citrus plants. Liao Fang1, Zhu Linhui2, Niu
Chunjing1, Luo Jiafeng1, Ren Xueyi3, Huang Guoming1, Li Guanrong2 ( Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine
Bureau, Tianjin 300461, China;2. Engineering Research Center of South Upland Agriculture of the Ministry of
Education, Southwest University;3. Chongqing Institute for Food and Drug Control)
Abstract There are a dozen Phytophthora pathogens in citrus across the world. The two important quarantine fungal
Phytophthora pathogens of citrus, Phytophthora hibernalis and P. syringae, are prohibited to entry into China. This
paper reviews the research progress of detection and identifi cation of Phytophthora pathogens diseased citrus plants
about the symptoms of observation and pathogen morphology identifi cation and molecular detection, providing some
useful reference for the detection and identifi cation of the phytophthora spp.
Key words Citrus; phytophthora ; detection; identifi cation; progress
摘要 在全世界危害柑橘属植物的疫霉有十几种,其中冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)和丁
香疫霉(P. syringae)为我国规定禁止进境的两种检疫性真菌病害。本文从传统的症状观察、病原菌
形态特征和分子检测等方面综述了柑橘属疫霉菌检测与鉴定的研究进展,可为柑橘属植物疫霉菌的口
岸检疫提供借鉴。
关键词 柑橘属;疫霉属病原菌;检测;鉴定;研究进展
中图分类号 S432.4+4
柑橘属植物(Citrus L.)统称为柑橘,包括
常 见 的 柠 檬(C. limon L.)、脐 橙(C. sinensis
Osbeck)、葡萄柚 (C. paradisi Macf.)等,是世界
第一大果树品种,全世界有135个国家和地区生产
柑橘,其种植面积和产量均居首位 [1-2]。近年来我
国大量进出口柑橘属水果,2013年仅鲜橙、柚和
基金项目:科技部十二五科技支撑项目(2012BAK11B02);国家质检总局科技计划项目(2012IK286、2013IK290)
收稿日期:2014-09-28
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2015 年第 1 期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol.29 No. 1
柑桔3种水果进口11.9万 t,金额1.5亿美元,出口
102.4万 t,金额11.3亿美元,进出口量都持续增加。
疫霉属(phytophthora)真菌是危害柑橘属
果树的重要病原菌。据报道,全世界为害柑橘的
疫霉有14种之多,不同国家或地区,不同柑橘种类
寄生的疫霉种类可能有所不同 [3-7],冬生疫霉(P.
hibernalis)和丁香疫霉(P. syringae)侵染柑橘
引起的疫病是毁灭性病害,为我国禁止进境的植
物检疫性病原菌 [6-7]。冬生疫霉是在澳大利亚西
部的柑橘果实上首次发现的 [8],随后在美国、法
国等多个国家和地区均有报道 [9];2011年天津出
入境检验检疫局在美国脐橙上截获丁香疫霉(P.
syringae),是我国首次截获该病菌,目前该病害在
我国尚未发生 [10]。近年来,随着我国对外开放,大
量而频繁的柑橘水果交易,增加了检疫性有害生
物入侵的风险,迫切的需要准确快速的检测以保
护我国柑橘产业的安全。本文对柑橘属疫霉菌的
形态学鉴定和分子检测技术两方面进行了综述,
为疫霉菌的口岸检疫提供借鉴,促进口岸把关,有
效保护农业生产安全和果农利益。
1 传统形态学鉴定方法
1.1 症状观察
疫霉属真菌常多种病菌侵染同株果树,寄主
植物出现脚腐、根腐、冠腐、果腐和叶疫等多种病
害,为害植株的根、颈、叶、果实等 [11],具有流行性
和毁灭性,可导致植物大量减产,甚至绝产、死亡,
给柑橘生产带来巨大损失。疫霉菌侵染柑橘属植
物常造成柑橘脚腐病、根腐病和流胶病。柑橘脚
腐病可由恶疫霉、烟草疫霉、柑桔褐腐疫霉等10种
菌引起,病菌侵染引起植株皮层腐烂,发病橘树根
颈部皮层死亡。柑橘根腐病由寄生疫霉和棕榈疫
霉引起,发病后植株地下部分症状为主根、侧根腐
烂,皮层组织解体,根部干缩,因不同的病原菌而
存在一定差异,地上部分表现为叶片变小、黄化、
脱落,树枝干枯,树势明显衰弱 [12]。柑橘流胶病
的致病菌为柑橘褐腐疫霉和烟草疫霉,能引起幼
苗的死亡和成熟果树的老化和枯萎,主要发生在
主干上,主枝、小枝上也可发生 ,病斑不定型,病
部皮层变褐色,水渍状,并开裂和流胶 [13]。单一
由冬生疫霉侵染柑橘属植株会导致植株主枝和小
枝枯萎、果实呈褐色病变,丁香疫霉侵染引起根
腐、颈腐和果腐等症状,单一菌引起的症状与多种
病原菌同时侵染引发的症状不易甄别,所以单凭
症状鉴别疫霉菌种并不准确。
1.2 病原菌形态特征
传统的菌种检测和鉴定方法主要根据病原菌
的形态特征、培养性状及生理特性鉴定。成家壮 [4-5]
等对柑橘属样品上分离的疫霉菌进行形态学和生
物学研究,将菌落形态、孢子囊的形态和脱落性、
有性器官的产生和形态、厚垣孢子的有无、菌丝的
生长温度等作为鉴定各疫霉菌的重要依据。针对
检疫性真菌丁香疫霉和冬生疫霉出入境口岸检疫
主要采用形态学方法,二者在菌落形态上存在一
定区别,在 V8培养基上丁香疫霉菌落呈星状、菊
花瓣状,花瓣区域较小、较窄,冬生疫霉菌落成玫
瑰花瓣状,花瓣区域较圆、较宽;丁香疫霉孢子囊
为款卵圆形或倒梨形,不易脱落,孢子囊较大,冬
生疫霉孢子囊为长卵圆形或椭圆形,易脱落,孢囊
柄较长,孢子囊较小;丁香疫霉雄器绝大多数侧
生,冬生疫霉雄器多围生,偶侧生 [14-15]。
2 分子生物学技术在疫霉菌检测中的应用
疫霉菌的形态和生物学性状易随环境及寄主
而表现较大的变异性,而且要获得分离培养物需
要较长时间,传统的症状观察及形态学方法无法
满足口岸检疫便捷准确的需要。近年来,分子生
物学技术的快速发展,为疫霉菌的快速检测提供
了有力的支持。目前在柑橘属疫霉菌检测中主要
包括免疫学技术和核酸技术两大方面。
2.1 免疫学技术
柑橘属疫霉菌的免疫学技术主要采用酶联
免 疫 吸 附 技 术 (Enzyme Linked Immunsorbent
Assay,简称 ELISA)。在美国疫霉菌的 ELISA试
剂盒已被商业化生产,并已被广泛应用 [16]。利
用 ELISA试剂盒可检测柑橘根茎组织、土壤和
灌溉水中的疫霉菌,Ali-Shtayeh等用 ELISA试
剂盒测定灌溉水中疫霉属和腐霉属病菌,分别检
测出 Phytophthora parasitica, P. citrophthora、P.
cryptogea 等4种疫霉菌及 Pythium coloratum, P.
rostratum, P. middletonii等5种腐霉菌。Timmer[17]
等用 ELISA方法鉴定柑橘根部和土壤中的寄生
疫霉和柑橘褐腐疫霉,分别用两种试剂测定疫霉
菌的繁殖体浓度,选择出适合根据土壤繁殖体浓
度鉴定寄生疫霉的试剂。
利用 ELISA技术可快速检测柑橘罹病组织
内的疫霉菌,ELISA试剂盒在田间病害即时诊
断及口岸现场检疫中可发挥重要作用,但由于血
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清制备困难、种特异性差及检测成本高等原因,
ELISA方法在口岸检疫上的应用受到限制 [18]。
2.2 核酸技术
分子检测方法特别是 PCR技术的发展使得
病原菌实现了快速、准确、灵敏的检测,因而也被
广泛应用于疫霉菌的检测当中。近年来,分子生
物学方法广泛应用,已成为实验室检测最常用的
手段,主要包括常规 PCR、巢式 PCR、多重 PCR、
实时荧光 PCR(Real-Time PCR)和LAMP技术等。
2.2.1 常规PCR
疫霉菌 rDNA的 ITS区域在真菌种间变异度
高、种内稳定等特点,为疫霉菌分子检测提供了理
想的靶序列,以 ITS序列分析为基础,目前已成功
开发了多种疫霉的分子检测引物。张海峰 [7]等根
据冬生疫霉 ITS区域设计了特异引物对冬生疫霉
进行了扩增。D. Montenegro[19]等基于疫霉属 ITS
区域设计的特异引物只对冬生疫霉扩增出407 bp
的条带,其他疫霉菌株则无扩增条带,该引物对已
被我国出入境检验检疫行业标准采用。
2.2.2 巢式PCR
巢式 PCR技术经过两轮扩增,能有效保证检
测结果的特异性与灵敏性。Antonio等 [20]依据烟
草疫霉、柑橘褐腐疫霉和其他真菌的 ITS序列设
计了3对引物,利用巢式 PCR成功检测出烟草疫
霉和柑橘褐腐疫霉,并且对不同来源的菌株灵敏
度没有差异。Grote等 [21]应用常规 PCR和巢式
PCR检测不同的疫霉菌种,结果显示巢式 PCR可
直接检测出烟草疫霉,且巢式 PCR的灵敏度比常
规 PCR至少高出三个数量级。Ippolito[22]等设计
了烟草疫霉和柑橘褐腐疫霉特异性引物,根据特
异性引物建立了巢式 PCR方法,该方法准确鉴定
了柑橘果树根部和土壤中的烟草疫霉和柑橘褐腐
疫霉。
2.2.3 多重PCR
多重 PCR检测技术是在同一 PCR反应体系
中加入两对或两对以上引物,同时扩增出多个核
酸片段的 PCR反应,其反应原理与常规 PCR相
同。柑橘属植株通常为多种疫霉菌同时侵染,为
快速、准确的检测这几种疫霉菌,需建立多重 PCR
技术。Mingzhu Li 等 [23]分别根据烟草疫霉 ITS
区域和栗黑水疫霉 Ypt1基因设计了特异性引物,
两对特异引物结合18S rDNA设计的通用引物建
立了同时检测烟草疫霉和恶疫霉的三重 PCR方
法。
2.2.4 实时荧光PCR
实时定量 PCR是在 PCR基础上发展起来的
定量及定性 PCR技术,克服了原有 PCR检测技
术的不足,具有灵敏、特异、简便、快速等特点,已
被广泛应用疫霉病菌的检测。Leonardo[24]等从柑
橘树上分离多种病原真菌,烟草疫霉、柑橘褐腐疫
霉、褐座坚壳菌和黄萎病菌,分别根据烟草疫霉、
柑橘褐腐疫霉和褐座坚壳菌的 ITS以及黄萎病菌
的 IGS基因设计引物进行实时荧光 PCR扩增,鉴
定出从土壤和带病的柑橘植株根部分离的菌株为
烟草疫霉和柑橘褐腐疫霉,从植株的根部、树皮和树
枝分离的为褐座坚壳菌和黄萎病菌。杜洪忠等 [25]
根据冬生疫霉的 ITS基因序列,设计了其实时荧
光 PCR引物及探针,建立了冬生疫霉的实时荧光
PCR检测方法,该方法对冬生疫霉稳定性好、特
异性强、灵敏度高,为口岸检疫该病菌提供更加稳
定、高效的检测技术。
2.2.5 LAMP技术
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal
amplifi cation,LAMP)是日本学者 Notomi等 [26]于
2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法。该技术
有灵敏度高、特异性强、方便简捷、检测周期短和仪
器设备要求低等优点,具有很高的应用价值。目
前该技术已广泛应用于临床、食品安全、农业等领
域,植物上主要集中在植物病毒、细菌、真菌性病
害及转基因的检验检疫等工作,具有较大的开拓
空间。
LAMP在植物病毒、细菌方面的应用已相当
成熟,如 Fukuta[27-28]等应用 LAMP检测番茄黄化
曲叶病毒(TYLCV)和番茄斑萎病毒(TSWV),
Okuda[29] 等建立了黄龙病的 LAMP 检测方法。
LAMP在疫霉菌病害检测上也有应用,如苜蓿疫
霉根腐病菌 (Phytophthora medicaginis) 是一种
侵染紫花苜蓿的病原菌,被我国列为重要检疫对
象,张裕君 [30]等根据苜蓿疫霉根腐病菌的 SCAR
标记序列 (AY251053) 设计了一套苜蓿疫霉的
LAMP特异引物,根据该引物对苜蓿疫霉建立了
特异性好、灵敏度强的 LAMP检测方法。LAMP
方法具有快速、准确、灵敏、便捷的优点,在柑橘疫
霉菌检测方面有较大的应用前景。
2.2.6 DNA条形码
DNA 条形码(DNA barcode)技术是利用有
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足够变异且容易扩增的相对较短的标准 DNA片
段,在种内的特异性与种间的多样性中建立的一
种新的生物身份识别系统,从而实现了对物种进
行快速准确的识别和鉴定 [31]。该技术已广泛应
用于动物、植物和真菌的物种鉴定。
适用于真菌 DNA条形码的基因有功能蛋白
基因如β-tubulin基因、TEF-1α(翻译延长因
子)基因、RPB2(RNA 聚合酶)基因、CAL
(钙调蛋白)基因、rDNA的18S和28S基因,以
及 rDNA 的 ITS序列等。β-tubulin 基因既有保
守的外显子又有许多可变的内含子,因此常被作
为标识片段用于真菌的物种鉴定。Samsonet等
通过对青霉亚属的180株代表性菌株的序列分析,
证实β-tubulin 基因是一种理想的物种标记 [32]。
Geiseret等建立的 TEF-1α(翻译延长因子)基
因序列数据库,可对镰刀菌属物种进行有效辨别
[33]。18S和28S基因比 ITS等基因的变异率低,不
适合大多数真菌类群的物种鉴定。然而在球囊菌
门(Glomeromycota)真菌中,由于其无性孢子含
有大量的异源细胞核,ITS 序列变异过大,不适
合近缘种的区分等缺陷,目前主要利用18S基因
进行物种鉴定和系统演化分析 [34]。rDNA的 ITS
序列被广泛应用于真菌的物种鉴定。ITS作为真
菌 DNA条形码的优势在于扩增片段大小合适、引
物通用性强、扩增成功率高、便于高通量测序及分
析,并且是 GenBank等数据库中最多的 DNA片
段序列 [35]。疫霉菌分子检测大多是以 rDNA的
ITS区域为靶序列,尚无疫霉属 DNA条形码检测
技术报道,因此,可根据 ITS基因及部分功能蛋白
基因序列开展疫霉属 DNA条形码的相关研究。
3 展望
柑橘属水果疫霉过去主要采用形态学鉴定,
但形态学鉴定疫霉属真菌需要丰富的专业知识,
比较耗时且容易受其他菌落干扰;酶联免疫法在
国外已广泛应用于疫霉病害的诊断和检测,促进
了检测技术的发展,但其特异性差,灵敏度低,与
其他菌种的交叉反应限制了其广泛应用。核酸技
术以其灵敏、准确、快速的特点越来越受到人们的
重视,特别是 PCR技术更突显出优势,常规 PCR、
巢式 PCR和实时定量 PCR等是实验室检测最常
用的手段。目前,我国柑橘上检疫性疫霉冬生疫
霉的检测标准为普通 PCR;多重 PCR能同时检
测多种疫霉菌,与实时荧光 PCR技术结合可进行
定量测定,有助于对柑橘属疫霉菌进行系统研究。
LAMP方法是近年来应用于检验检疫的新技术,
它具有灵敏度高、特异性强、简捷方便和检测周
期短等优点,在植物检疫领域具有良好的实用价
值和广阔的发展前景。目前以分子生物学为基础
的 DNA条形码技术对真菌物种的检测与鉴定将
具有很大应用潜力,该技术可对每一种生物建立
DNA条形编码,从而实现对生物物种的快速、准
确识别与鉴定,为进出口病原菌检疫鉴定提供可
靠的技术支撑。
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福建口岸从南美原木中截获多种重要林木害虫
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多达9种害虫,其中中对长小蠹(Platypus parallelus)、赤材小蠹(Xyleborus ferrugineus)为检疫性有害生物,
另有靓眼斑天牛(Agaone notabilis)、拆斑尼胸天牛(Nyssodrysternum signiferum)、黑齿斑天牛(Odontocera
molorchoides)、刺膝天牛(Chlorida festiva)、Odontocera javieri、Cycnidolon batesanium和Chrysobothris
amabilis,后3种为我国首次截获。此前,福建局曾从厄瓜多尔柚木(Tectona grandi)中截获尼虎天牛
(Neoclytus sp. ),该种天牛我国无分布;从阿根廷重蚁木(Caesalpinia paraguariensis)中截获刺腿天牛(Ambouns
interrogationis)和线斑尼虎天牛(Neoclytus sobrinus),线斑尼虎天牛为我国首次截获。
上述原木均带有树皮,所截获的害虫均为活体,虫口密度大,为害重,且部分种类我国无分布,一旦传
入扩散将严重威胁我国林业生产和生态安全,具有重要的检疫意义。此外,国外官方出具的植物检疫证书显
示,这些原木均已在出口国实施过熏蒸处理,但入境时仍截获到大量活的重要林木害虫。由此可见,南美植
物疫情复杂,有害生物随进境带皮原木传入的风险很大,不容忽视。
福建出入境检验检疫局 董文勇 林谷园 李文举 宋 菁
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