全 文 ：164
响应面法优化杨树花多糖超声提取工艺
焉 鑫，王碧莹，赵家洪，陈雪英，陈俭清，盛尊来*
(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030)
收稿日期:2015－09－17
作者简介:焉鑫(1992－)，男，硕士，研究方向:天然药物化学，E－mail:Elijahy92@ 163.com。
* 通讯作者:盛尊来(1979－)，男，博士，副教授，主要从事天然产物分析方面的研究，E－mail:shengzunlai@ neau.edu.cn。
基金项目:国宝自然科学基金(31201944)。
摘 要:采用 Plackett－Burman设计结合 Box－behnken响应面法优化杨树花多糖的超声提取工艺。以杨树花多糖得率
为考察指标，对影响杨树花得率的超声功率、超声频率、提取温度、提取时间、提取次数、液料比、颗粒大小、醇沉时间、
醇沉浓度等 9 个因素，采用 Plackett－Burman设计从中筛选出具有显著效应的因素－超声功率、提取温度、提取时间;进
一步以杨树花多糖得率为考察指标，采用 Box－behnken 设计响应面法对以上三个因素进行考察，确定最佳工艺条件
为:超声功率 195 W，提取温度 66 ℃，提取时间 43 min，以此条件提取的多糖含量为 63.18 ± 1.57 mg /g，与理论预测值仅
相差 2% ～3%。
关键词:杨树花，多糖，超声提取，Plackett－Burman设计，Box－behnken设计
Optimization of ultrasound－assisted extraction(UAE)of
polysaccharides from Flos Populi with response surface methodology
YAN Xin，WANG Bi－ying，ZHAO Jia－hong，CHEN Xue－ying，CHEN Jian－qing，SHENG Zun－ lai*
(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China)
Abstract:To investigate and optimize the ultrasound － assisted extraction procedure for the water － soluble
Polysaccharide from the Flos Populi，important variables and their levels were obtained using Plackett－ Burman
design and Box－Behnken design.A mathematical model was developed to show the effects of each variable and
their combinatorial interactions on extraction yield of Polysaccharide. A high coefficient of determination(Ｒ2 =
98.77%)indicated good agreement between the experimental and predicted values of Polysaccharide yield.The
optimum levels of these significant parameters were determined using response surface methodology(ＲSM)，
which revealed these as follows:ultrasonic output power 195 W，extraction temperature 66 ℃，extraction time
43 min. Under these conditions，63.18 ± 1.57 mg /g of polysaccharide was extracted，which had a difference of
2%～3% with the predicted value.
Key words:Flos Populi;polysaccharides;Ultrasound － assisted extraction;Plackett－Burman design;Box－Behnken
design
中图分类号:TS255.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)07－0164－06
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 07． 024
杨树花(Flos populi)为杨柳科(Salicaceae)植物
毛白杨 (Populus tomentosa)、加拿大杨 (Populus
canadensis)、或同属植物的干燥雄花序，味苦性寒，具
有清热解毒，化湿止痢之功效，为《中华人民共和国
兽药典》2010 版所收载［1］。杨树花含有丰富的黄酮
及多糖类化合物，目前，对其总黄酮的研究已有较多
报道［2－3］，但至今对杨树花多糖的研究较少，尤其缺
乏系统的杨树花多糖提取工艺的研究以及生物活性
评价。而大量药理及临床研究证实，植物多糖具有
增强免疫力、抗氧化、控制血糖、降胆固醇、降血脂等
广泛的生物活性［4－6］，作为食品、饲料添加剂等方面
具有广阔的前景［7］，因此对杨树花多糖提取工艺进行
优化具有十分重要的意义。
目前，提取植物多糖的方法有热水浸提法、酸碱
溶液提取法、微波提取法、超声提取法等多种方
法［8－9］，其中超声提取法操作简单，并且可以在较低
温度、较短时间下获得较高的得率［10］，已被开发运用
在多种植物活性成分的提取中。超声提取法需考察
的影响因素较多，而 Plackett Burman 设计结合响应
面法可确定影响得率的关键因素［11］，并对其进行优
化。因此，本文在单因素实验基础上，采用 Plackett
Burman设计筛选出影响杨树花多糖得率的主要因
素，进一步采用 Box－behnken design响应面法对其进
行优化，确定最佳工艺参数。
165
表 1 单因素实验设计
Table 1 Single－factor test design
考察因素
参数设置
超声功率
(W)
超声频率
(kHz)
粒径大小
(目)
提取温度
(℃)
提取时间
(min)
液料比
(mL/g)
提取次数
(次)
醇沉浓度
(%)
醇沉时间
(h)
超声功率 120～270 45 24 60 30 20 2 60 24
超声频率 180 45～100 24 60 30 20 2 60 24
粒径大小 180 45 10～80 60 30 20 2 60 24
提取温度 180 45 24 30～80 30 20 2 60 24
提取时间 180 45 24 60 10～60 20 2 60 24
液料比 180 45 24 60 40 10～35 2 60 24
提取次数 180 45 24 60 40 30 1～5 60 24
醇沉浓度 180 45 24 60 40 30 3 60～90 24
醇沉时间 180 45 24 60 40 30 3 80 12～48
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
杨树花 采摘于东北农业大学院内，采收期为
2013 年 9 月，经黑龙江中医药大学李彦冰教授鉴定
为杨柳科植物毛白杨的雄花序;D－无水葡萄糖(No.
1108332200503) 中国药品生物制品鉴定所;蒽酮
(分析纯) 上海科峰生物技术有限公司;95%乙醇、
硫代巴比土酸、三氯化铁、脱氧核糖、乙二胺四乙酸、
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、双氧水、氯仿、
正丁醇、浓硫酸、标准葡萄糖等(均为分析纯) 杭州
化学试剂有限公司;1，1－二苯基－2－苦基苯肼自由基
(DPPH)、抗坏血酸 西格玛化学试剂公司;所用水
为去离子水。
UV－8000A紫外分光光度计 上海市元析仪器
有限公司;DH6000A 电热恒温水浴锅 天津市泰斯
特仪器有限公司;DHG－9070 型热恒温鼓风干燥箱
上海恒科学仪器有限公司;S224 分析天平 赛多利
斯科学仪器(北京)有限公司。KQ－300VDE 三频数
控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司;ＲE－
52AA旋转蒸发器 上海亚荣生物化学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的制备及含量测定 采用蒽酮－硫
酸法［12］，取葡萄糖对照品配成 100 μg /mL的溶液，分
别取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 溶液置于干燥试管
中，加蒸馏水至 2 mL，于冰水浴中加入 0.2%蒽酮－硫
酸溶液 4.0 mL，100 ℃水浴反应 10 min，冷却至室温
后，静置 20 min，于 620 nm下测定吸光度。
精密称取多糖 0.1 g，以水溶解并定容至 100 mL，
精密量取 2 mL 并定容至10 mL得到杨树花多糖样品
溶液，精密量取样品溶液 1.0 mL置于 10 mL具塞试管
中，加蒸馏水至 2 mL，于冰水浴中加入 0.2%蒽酮－硫
酸溶液 4.0 mL，100 ℃水浴反应 10 min，冷却至室温
后，静置 20 min，于 620 nm下测定吸光度 A，代入回归
方程计算多糖的浓度，每组实验做 3次平行。
1.2.2 超声波提取的工艺流程 称取杨树花粉→按料
液比加水配液→超声提取→离心分离(3000 r /min，5 min)，取
上清液→加乙醇，于 4 ℃静止→离心分离(3000 r /min，5 min)
→多糖沉淀。
1.2.3 杨树花多糖提取条件单因素实验 准确称取
杨树花粉末 0.5 g，按照表 1 的方案分别对各参数进
行考察，并依据公式(1)分别测定其在不同功率时多
糖的得率(以每克原料药中含有多糖的毫克数计)，
确定各因素的中心点。
多糖得率 =多糖含量(mg)
原料重量(g) 式
(1)
1.2.4 响应曲面法实验设计 在 Plackett Burman 实
验结果基础上，采用 Box－Behnken 设计进行实验，利
用 Design－expert 8.0 软件对实验结果进行分析，优化
出最佳提取工艺，并对该工艺进行验证。实验因子
和水平表见表 2 和表 3。
表 2 Plackett Burman实验分析因子及水平表
Table 2 Variables and experimental design levels
for Plackett Burman design
因子
水平
－ 1 1
超声功率(W) 150 210
超声频率(kHz) 45 100
粒径大小(目) 10 50
提取温度(℃) 50 70
提取时间(min) 30 50
液料比(mL/g) 25 35
提取次数(次) 2 4
醇沉浓度(%) 70 90
醇沉时间(h) 12 36
表 3 Box－Behnken实验分析因子及水平表
Table 3 Variables and experimental design levels
for response surface methodology
因子
水平
－ 1 0 1
X1 超声功率(W) 150 180 210
X2 提取温度(℃) 50 60 70
X3 提取时间(min) 30 40 50
1.3 数据统计分析
Plackett Burman及 Box－Behnken 实验所测得数
据，均经 Design－ expert 8.0 软件进行方差分析(F 检
验)，以分析各因素对得率的影响。
166
2 结果与讨论
2.1 单因素实验提取条件选择
图 1 各单因素对杨树花多糖得率的影响
Fig.1 Effect of different parameters on extraction yield of Polysaccharide from the Flos Populi
注:超声功率(A)、超声频率(B)、粒径大小(C)、提取温度(D)、提取时间(E)、
液料比(F)、提取次数(G)、醇沉浓度(H)、醇沉时间(I)。
各因素对杨树花多糖得率影响的结果如图 1 所
示。由图 1A可知，随着超声功率的增大，多糖得率
先上升后下降，并在 180 W 时出现最高点。这是因
167
表 4 Plackett－Burman实验设计及响应值
Table 4 Plackett－Burman test design and results
实验号
超声频率
(kHz)
超声功率
(W)
粒径大小
(目)
液料比
(mg /mL) 提取次数
醇沉浓度
(%)
醇沉时间
(h)
提取温度
(℃)
提取时间
(min)
得率
(mg /g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
－ 1(45)
1(100)
－ 1
1
－ 1
1
－ 1
1
－ 1
－ 1
1
1
－ 1(150)
－ 1
1(210)
1
1
1
1
－ 1
－ 1
－ 1
1
－ 1
1(50)
1
－ 1(10)
1
1
－ 1
1
－ 1
－ 1
－ 1
－ 1
1
－ 1(25)
1(35)
1
－ 1
－ 1
－ 1
1
－ 1
1
－ 1
1
1
1(4)
1
1
－ 1(2)
1
－ 1
－ 1
1
－ 1
－ 1
1
－ 1
1(90)
－ 1(70)
－ 1
－ 1
1
1
－ 1
－ 1
1
－ 1
1
1
－ 1(12)
－ 1
1(36)
1
1
－ 1
－ 1
1
1
－ 1
－ 1
1
1(70)
－ 1(50)
1
－ 1
－ 1
1
1
1
－ 1
－ 1
－ 1
1
1(50)
1
1
1
－ 1(30)
1
－ 1
－ 1
1
－ 1
－ 1
－ 1
60.3
48.73
52.81
39.54
26.85
57.73
35.54
43.73
48.27
32.73
30.12
38.27
为功率加大可加大细胞的破碎程度，有利于成分的
溶出［13］，但功率过大可使更多脂溶性成分溶解而影
响多糖的得率。由图 1B 可知，与超声功率相比，超
声频率对杨树花多糖得率的影响较小(51.6 ～
56.5 mg /g)，所以在 45 kHz 下的超声频率足以获得
良好的得率。图 1C表明随着粒径变小，多糖得率先
上升后下降，并在 24 目时出现最高点。这是因为粒
径越大与溶剂接触面积越大，所以先随粒径的变小
得率增高［14］;但如药粉过细，药粉本身会对成分产生
吸附，反而影响了成分的溶出。提取温度对杨树花
多糖得率的影响见图 1D，在较低提取温度下，杨树花
多糖得率仍较高。随着提取温度升高，多糖提取得
率逐渐上升，直到 60 ℃时达到最高点，然后有所下
降。这主要是由于温度升高使多糖的溶解度增加，
并且扩散系数增加，促进提取速度加快［15］。然而温
度过高，一些多糖类化合物被破坏，使得率反而降
低。提取时间对杨树花多糖得率的影响见图 1E，杨
树花多糖得率随着提取时间的延长而增大，在40 min
时达到最大值，继续延长时间得率变化不大。这说
明40 min时已达到溶解平衡。液料比对杨树花多糖
得率的影响见图 1F，随着液料比的增加，杨树花多糖
的得率也在增加，但由曲线的斜率可知，液料比从
25 mL /g增加到 35 mL /g 时，得率变化不大，为节省
溶剂选取 25 mL /g 液料比进行提取。提取次数对杨
树花多糖得率的影响(图 1G)，前三次提取，多糖的
得率增加较大(斜率较陡)，而 3～5 次不同提取次数
所获多糖产率相差不大(斜率较缓)，说明前三次已
能较完全的将多糖从杨树花药材溶出。醇沉浓度对
杨树花多糖得率的影响(图 1H)，增加醇沉浓度可增
加多糖得率，但乙醇浓度达到 80%以上时，多糖得率
变化不大，并且过高的醇沉浓度会导致杂质的增多，
因此醇沉浓度 80%时，比较适合获取杨树花多糖。
醇沉时间对杨树花多糖得率的影响(图 I)，醇沉 24 h
较醇沉 12 h所得多糖产率提高了近 16%，而继续延
长醇沉时间，多糖得率变化不大，说明 24 h能够使多
糖得以充分的沉淀。
2.2 Plackett－Buman实验设计筛选关键因素
在单因素实验基础上，确定了 Plackett － Buman
实验设计的各个因素和水平，Plackett－Buman 实验设
计及响应值见表 4，结果利用 Design－expert 8.0 软件
进行方差分析，确定关键因素，结果见表 5。
表 5 各个因素的显著性检查
Table 5 Significance test of each factor
模型值 估值 标准偏差 F值 p
模型值
超声频率
超声功率
粒径大小
液料比
提取次数
醇沉浓度
醇沉时间
提取温度
提取时间
1291.72
0.22
72.29
21.77
4.26
9.11
5.96
20.50
321.85
835.77
143.52
0.22
72.29
21.77
4.26
9.11
5.96
20.50
321.85
835.77
68.43
0.10
34.47
10.38
2.03
4.34
2.84
9.78
153.46
398.51
0.0145*
0.7770
0.0278*
0.0843
0.2903
0.1726
0.2340
0.0889
0.0065＊＊
0.0025＊＊
注:* 表示 p ＜ 0.05，＊＊表示 p ＜ 0.01。
由表 5 可以看出，超声功率(p ＜ 0.05)、提取温度
(p ＜ 0.01)、提取时间(p ＜ 0.01)对得率具有显著
影响。
因此，在下一步采用 Box－Behnken 响应面设计
对其进一步优化。对于不显著因素，根据单因素实
验结果选取各因素的中心点进行实验，即依据单因
素考察结果，选取超声频率 45 kHz，粒径大小 24 目，
液料比 30 mL /g，提取次数 3 次，醇沉浓度 80%，醇沉
时间 24 h。
2.3 Box－Behnken设计进一步优化关键因素
2.3.1 回归模型的建立及方差分析 应用响应面法
对杨树花中多糖的提取方法进行优化，所有 15 个实
验用于 Box－ Behnken 设计，优化 3 个自变量。表 6
显示根据析因设计的实验条件和结果。
通过对实验数据进行多重回归分析，响应值和
168
表 7 响应面回归模型 ANOVA分析结果
Table 7 ANOVA results for extraction yield of polysaccharides
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
Model 916.64 9 101.85 44.63 0.0003 ＊＊
X1 162.63 1 162.63 71.27 0.0004 ＊＊
X2 369.65 1 369.65 161.99 ＜ 0.0001 ＊＊
X3 101.60 1 101.60 44.52 0.0011 ＊＊
X1X2 24.65 1 24.65 10.80 0.0218 *
X1X3 7.40 1 7.40 3.24 0.1317
X2X3 12.36 1 12.36 5.41 0.0675
X1
2 113.12 1 113.12 49.57 0.0009 ＊＊
X2
2 128.42 1 128.42 56.28 0.0007 ＊＊
X3
2 28.02 1 28.02 12.28 0.0172 *
残差 11.99 5 2.4
失拟项 11.41 3 3.8 13.01 0.0722
纯误差 0.58 2 0.29
总和 918.61 14
注:Ｒ2 = 98.77%，Ｒ2Adj = 96.56%，CV = 2.93%，AP = 18.751;
* p ＜ 0.05;＊＊p ＜ 0.01。
实验的变量关系遵守以下二阶多项式方程:
Y = － 454.54121 + 2.00586X1 + 6.83530X2 +
4.33832X3 + 8.26923E－003X1X2 －4.53294－003X1X3 －
0.017527X2X3 － 6.02869E － 003X1
2 － 0.057857X2
2
－0.026429X3
2
X1，X2，X3 分别代表超声功率、提取温度和提取
时间。上述回归方程的方差分析结果见表 7。
表 6 杨树花多糖得率响应面方案及结果
Table 6 Ｒesponse surface analytical plan
and experimental results
序号
X1 超声功率
(W)
X2 提取温度
(℃)
X3 提取时间
(min)
Y得率
(mg /g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
0
0
0
－ 1
0
1
－ 1
0
－ 1
－ 1
0
1
1
0
1
－ 1
1
－ 1
1
1
0
0
0
0
－ 1
0
0
－ 1
0
1
－ 1
1
1
0
－ 1
－ 1
1
0
－ 1
0
0
1
0
0
0
37.27
60.09
47.64
46.22
56.75
52.91
51.41
59.09
41.29
39.96
59.26
57.59
44.13
58.25
60.32
由表 7 的 ANVOA分析可知:本实验模型的 p 值
小于 0.001，表示这一模型适用于本实验。失拟项的
p = 0.0722 ＞ 0.05，失拟不显著，说明本实验的模型成
立。相关系数 Ｒ2 = 0.9877 和调整系数 Ｒ2Adj = 0.9656
也表明模型拟合程度较好。2.93%的变异系数(CV)
说明模型的重现性很好，该模型可用于优化杨树花
多糖提取的工艺条件。
从各个因素的显著性水平差异可知，对杨树花
得率的影响次序为:提取温度 X2 ＞超声功率 X1 ＞提
取时间 X3。并且交互项 X1X2 及二次项 X1
2、X2
2、X3
2
均对多糖得率具有显著的影响。
2.3.2 响应面分析 用 Design－Expert.8.0 绘制杨树
花多糖提取各个影响参数的响应面，三维的响应面
图和二维的等高线图(响应面水平方向的投影)的结
果见图 2，同时各个影响参数的相互作用也反映在图
中，交互作用的强弱可以从等高线的形状中反映出
来，其中，椭圆形代表两个因素交互作用较强，圆形
则较弱［16］。从图 2 可以看出，提取温度、超声功率的
交互作用较明显(二维等高线图为椭圆形)，当超声
功率较低时，得率随温度的变化并不明显;当超声功
率较高时，得率随着温度的提高而显著提高，说明适
当的提高温度与功率有利于杨树花多糖的提取。
图 2 超声功率(X1)和提取温度(X2)对得率的响应面分析
Fig.2 ＲSM analysis for interactive effects of
ultrasonic power(X1)and extraction temperature(X2)
2.3.3 最佳工艺确定及验证 将表 3 数据经 Design
－Expert 8.0 软件处理，得到杨树花多糖的最佳提取
条件为:超声功率为 195.7 W、提取温度为 66.5 ℃、提
取时间为 43.3 min。考虑到实验的可操作性，将其调
169
整为超声功率 195 W、提取温度 66 ℃、提取时间
43 min。在此条件下，多糖的得率为 63.18 ± 1.57 mg /g
(N = 3)，与理论预测值仅相差 2% ～ 3% (预测值
62.84 mg /g)，说明优化的模型可靠。
3 结论
单因素实验最优值结果如下:超声功率 180 W、
超声频率 45 kHz、粒径大小 24 目、提取温度 60 ℃、
提取时间 40 min、液料比 25 mL /g、提取次数 3 次、醇
沉浓度 80%、醇沉时间 24 h。
本研究的结果表明超声辅助提取杨树花多糖是
一种有效、操作方便、可靠和可行的方法，其最佳提
取工艺条件为超声功率 195 W，提取温度 66 ℃，提取
时间 43 min。在此条件下，杨树花多糖的得率为
63.18 ± 1.57 mg /g(N = 3)，与预测值 62.84 mg /g 相
近，说明实验结果与模型符合性良好，所优化的工艺
参数准确、可靠。
参考文献
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