全 文 ：世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药种质资源生物化学跨学科研究及其在南药中的实践
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-07-02
修回日期：2014-07-12
＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81102764）：基于改进Mauve算法的贯众类药材 DNA条形码序列预测与验证，负责人：马新业；广东省科技厅
博士启动项目（S2011040005237）：广东省水龙骨科药用植物资源 DNA条形码鉴定研究，负责人：马新业；广东省教育厅高等院校学科与专业建设
专项（重点实验室滚动支持）（2013CXZDA011）：春砂仁等“十大广药”DNA条形码标准化研究，负责人：陈蔚文。
＊＊ 通讯作者：马新业，副研究员，主要研究方向：中药资源学；陈蔚文，本刊编委，教授，主要研究方向：中药资源保护与合理开发利用。
基于psbA-trnH序列的鳞毛蕨属贯众药材
基原植物的鉴定研究＊
刘 锋，蒋研风羊，詹若挺，马新业＊＊，陈蔚文＊＊
（广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心/岭南中药资源教育部重点实验室 广州 510006）
摘 要：目的：研究 psbA-trnH序列在近缘贯众基原物种鉴定中的有效性。方法：对常见鳞毛蕨属贯众
基原物种 psbA-trnH 序列进行 PCR 扩增及测序，原始峰图通过 CodonCode Aligner 软件查看、拼接和校对，
并根据 GenBank 注释截取标准条形码数据。利用 TaxonGap 方法在实验物种范围（9 物种 19 样品）和扩大
范围（17物种 44样品）内评估该序列的鉴定效率。结果：物种鉴定范围扩大后 psbA-trnH序列鉴定成功率
由 100%（9/9）降至 82.4%（14/17），种内异质性数值高于种间可分离性的比例，由 11.1%（1/9）上升为
52.9%（9/17）。结论：psbA-trnH序列可作为整体贯众同名异物品种鉴定的推荐条形码，实际应用中需注意
种内采样代表性的问题。
关键词：贯众 鳞毛蕨属 DNA条形码 psbA-trnH
doi: 10.11842/wst.2014.07.007 中图分类号：R285.5 文献标识码：A
贯众最早记载于《神农本草经》，被列为下品，
历代本草多记载其防疫抗疫效果。2000 版和 2005
版《中国药典》收录贯众类药材仅有绵马贯众（粗茎
鳞毛蕨 Dryopteris crassirhizoma），2010 版增收紫萁
贯众（紫萁 Osmunda japonica），但不同地区实际作
为贯众入药的原植物种类甚多，有文献统计此类同
名异物竟包括 11 科 18 属 58 种之多 [1]。由于其来源
复杂导致临床效果不一，贯众类药材急需进行品种
整理和评价，然而作为基础工作的物种鉴定目前尚
未有高效解决方案。
DNA 条形码技术已用于多个分类学类群的物
种鉴定研究 [2~5]，有望成为快速、准确识别贯众类药
材不同基原植物的新型手段，关键前提是新方法通
用性和有效性的验证。前期实验 [6，7]已表明，通过对
比多个热点推荐条形码标记，psbA-trnH 序列在常
见药用蕨类植物中引物通用性最好；本研究将通过
考察该基因间区碱基信息对鳞毛蕨属内常见 9 个贯
众类药材基原物种的分辨力，初步探讨 psbA-trnH
分子标记对整体贯众同名异物品种鉴定的价值。
1 材料与方法
1.1 材料
鳞毛蕨属常见贯众类基原物种实验材料（表 1）
由中国科学院华南植物园董仕勇博士采集鉴定，共
9 个物种 19 个样品，数字影像信息及凭证标本保存
于中国科学院华南植物园标本馆。表 2 为 GenBank
下载数据，共 25 条 psbA-trnH 序列，代表 15 个鳞毛
蕨属物种。用于在较大范围（实验物种数据+网络数
据）内进行 psbA-trnH 序列鉴定分析的最终数据为
44 个，17 个物种。
1482
2014 第十六卷 第七期 ★Vol.16 No.7
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序
称取硅胶干燥叶片 30 mg，液氮研磨，使用植物基
因组 DNA试剂盒（天根生物技术公司）提取总 DNA，
psbA-trnH 序列扩增引物及反应条件参考文献 [8]，
PCR产物使用 ABI 3730XL 测序仪直接双向测序。
1.2.2 数据处理方法
测序原始峰图通过 CodonCode Aligner 软件（V
3.7）进行查看、拼接和校对，以碱基质量（QV）不低
于 20 为标准。根据 Genbank 序列
注释去除 psbA 和 trnH 基因区段
获得最终可分析数据。使用 Tax－
onGap 软件 [9]进行物种鉴定力分
析，以最大种内遗传距离（异质
性）描述种内变异程度，以最小种
间遗传距离（可分离性）衡量种间
变异状况，结果以示意图形式展
示。遗传距离由相似性矩阵获得，
相似性矩阵由软件 MatGat（V
2.01）[10]计算。
2 结果与分析
2.1 实验样品范围内 psbA-trnH
序列物种鉴定力分析
在实验样品范围内 psbA -
trnH 序列物种鉴定效果由 Taxon－
Gap 软件可视化方式展示（图 1），
所有物种两两间都存在可分离性
（深色 bar），最小种间遗传距离值
为 D. Championii 和 D. erythrosora
之间的 0.2。结果表明 psbA-trnH
序列可将所有 9 个实验物种有效
分离，鉴定成功率为 100%。在所
有含 2 份以上样品（可计算种内
变异，用浅色 bar 显示）的 5 个物
种中，有 1 个物种（D. rosthornii）
种内变异性大于种间可分离性
（浅色 bar 长度值大于深色 bar）。
2.2 扩大样品范围后 psbA-trnH
序列物种鉴定力分析
在扩大样品范围内（实验数
据+网络数据），14 个物种与相邻
物种间存在种间遗传距离（最小
值为 0.2），但《中国药典》规定正品绵马贯众 D.
crassirhizoma 与其他两个近缘种豫陕鳞毛蕨 D. pul－
cherrima 和大羽鳞毛蕨 D. wallichiana 的碱基信息相
同，不能被有效区分，结果表明 psbA-trnH 序列在
17 个物种 44 样品范围内鉴定成功率为 82.4%。另
外，在含 2 份以上样品的所有 10 个物种中，9 个物
种的种内异质性数值上均大于相应种间可分离性。
见图 2。
表 1 实验样品信息
表 2 Genbank 数据信息
中文名 拉丁名 Genbank编号
多鳞鳞毛蕨 D. barbigera JN189431
阔鳞鳞毛蕨 D. championii AB575742、JN189480
粗茎鳞毛蕨 D. crassirhizoma GU592467、GU592468、GU592469、
AB575746、JN189435
桫椤鳞毛蕨 D. cycadina JN189436
红盖鳞毛蕨 D. erythrosora EF590692、AB575749、JN189473
欧洲鳞毛蕨 D. filix-mas JN189398、JQ936671
黑足鳞毛蕨 D. fuscipes AB575752
华北鳞毛蕨 D. goeringiana JN189474
豫陕鳞毛蕨 D. pulcherrima JN189406
密鳞鳞毛蕨 D. pycnopteroides AB575781、JN189476
稀羽鳞毛蕨 D. sparsa AB575794、JN189491
狭鳞鳞毛蕨 D. stenolepis JN189445
浅裂鳞毛蕨 D. sublacera JN189446
变异鳞毛蕨 D. varia AB575798
大羽鳞毛蕨 D. wallichiana JN189388
中文名 拉丁名 GenBank登录号
变异鳞毛蕨 D. varia KM208811、KM208803、KM208804、
KM208808
川西鳞毛蕨 D. rosthornii KM208815、KM208816
大羽鳞毛蕨 D. wallichiana KM208820
红盖鳞毛蕨 D. erythrosora KM208819
黑足鳞毛蕨 D. fuscipes KM208809
阔鳞鳞毛蕨 D. championii KM208810、KM208805、KM208802
脉纹鳞毛蕨 D. choongensis KM208817
密鳞鳞毛蕨 D. pycnopteroides KM208814、KM208818
稀羽鳞毛蕨 D. sparsa KM208812、KM208806、KM208807、
KM208813
1483
世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药种质资源生物化学跨学科研究及其在南药中的实践
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
2.3 不同范围内 psbA-trnH 序列物种鉴定效率
比较
在实验样品（9 物种 19 样品）和扩大样品范围
（17 物种 44 数据）内分别进行 psbA-trnH 序列物种
鉴定力分析，从表 3 可知，对于可对比的 9 个实验
物种，扩大鉴定范围后最小种间距离（可分离性）变
小的物种有 7 个，占 77.8%，最小种间距离保持不
变的有 2 个，占 22.2%；在邻近物种的比较中，扩大
鉴定范围后有 6 个物种（66.7%）发生明显变化（序
列相同的物种变化不计）。对于表格所列前 5 个物
种（含 2 份以上样品且和网络物种有重复的实验物
种），最大种内距离（异质性） 增大的有 3 个，占
60%，数值保持不变的有 2 个物种，占 40%。综合分
析，可知扩大鉴定范围后种内最大变异数值高于种
间最小变异的情况（9/17，52.9%），较实验样品范围
内（1/9，11.1%）显著增加，邻近物种关系发生明显
变化，总体鉴定成功率下降。
3 讨论
DNA 条形码技术是目前国内生药鉴定领域的
重大突破之一 [11]，利用遗传物质 DNA 片段的碱基序
列信息识别物种，便于标准化操作。相对传统的基
原、性状、显微和理化鉴定等经典方法而言，该技术
在（尤其涉及科属众多）中药同名异物品种鉴别方
面具有独到优势。
应用 DNA 条形码技术的前提是引物通用性和
碱基序列信息物种（特别是近缘种）识别能力验证。
在蕨类相关研究中，Li F W 等 [5]认为 matK 和 rbcL
序列联合具有最大的变异性，可作为蕨类物种鉴定
核心条形码使用，但操作上并没有强调使用通用性
引物，实验材料也相对较少（74 个种）。本课题组前
期研究表明 [6，7]，在常见药用蕨类植物中 psbA-trnH
序列引物通用性优于 matK、rbcL 和 ITS2 等其他标
记，物种识别效率良好，适宜作为药用蕨类植物鉴
定的优先片段。本研究中，psbA-trnH 序列可有效分
辨所有 9 个同属实验物种，在扩大数据分析范围后
也能保持 82.4%的成功率，验证了该序列的近缘种
鉴别有效性，可进一步应用于整体贯众同名异物品
种鉴定，但在实际操作中需要考虑种内代表性样品
数量和辅助标记问题（本文结果 psbA-trnH 不能有
效将绵马贯众正品和两个近缘种分开，需筛选其它
DNA 片段加以区别）。
图 1 基于 psbA-trnH 序列的常见鳞毛蕨属贯众类基原
物种鉴定效果图（Taxongap 方法）
注：种间最小遗传距离由深色 bar 长度值表示，种内最大遗传
距离由浅色 bar表示；实验材料共 19样品，代表 9个物种。
图 2 常见鳞毛蕨属贯众类基原及近缘物种 psbA-trnH 序
列鉴定效果图（Taxongap 方法）
注：分析数据包括实验数据和网络数据，共 44 序列代表 17
个物种。
D. championi
D. fuscipes
D. varia
D. sparsa
D. pycnopteroides
D. rosthornii
D. choongensis
D. erythrosora
D. wallichiana
D. erythrosora
D. erythrosora
D. sparsa
D. choongensis
D. rosthornii
D. wallichiana
D. rosthornii
D. championi
D. rosthornii
psbA-trnH
psbA-trnH
D. barbigera
D. championii
D. choongensis
D. crassirhizoma
D. cycadina
D. erythrosora
D. filix-mas
D. fuscipes
D. goeringiana
D. pulcherrima
D. pycnopteroides
D. rosthornii
D. sparsa
D. stenolepis
D. sublacera
D. varia
D. wallichiana
D. filix-mas
D. erythrosora
D. filix-mas
D. wallichiana
D. wallichiana
D. championii
D. barbigera
D. erythrosora
D. barbigera
D. wallichiana
D. rosthornii
D. crassirhizoma
D. filix-mas
D. barbigera
D. sparsa
D. barbigera
D. pulcherrima
1484
2014 第十六卷 第七期 ★Vol.16 No.7
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
表 3 鳞毛蕨属物种不同范围对 psbA-trnH 序列种内和种间变异的影响
物种
最大种内距离 最小种间距离 邻近物种
A B A B A B
D. championii* 0 1.7 0.2 0.2 D. erythrosora D. erythrosora
D. rosthornii* 0.7 0.7 0.5 0.2 D. wallichiana D. crassirhizoma
D. varia* 0.5 0.5 9.4 9.1 D. sparsa & D. choongensis D. barbigera
D. sparsa* 0.2 2.9 2.7 2 D. choongensis D. filix-mas
D. pycnopteroides* 0.7 3.1 1 0.7 D. rosthornii D. rosthornii & D. crassirhizoma
D. fuscipes NA 0.7 0.5 0.2 D. erythrosora D. erythrosora
D. choongensi NA NA 2.4 1.2 D. rosthornii & D. wallichiana D. filix-mas
D. erythrosora NA 1.7 0.2 0.2 D. championi D. championii & D. fuscipes
D. wallichiana NA 1.9 0.5 0 D. rosthornii D. pulcherrima & D. crassirhizoma
D. crassirhizoma NA 1.7 NA 0 - D. wallichiana & D. pulcherrima
D. filix-mas NA 0.7 NA 0.2 - D. barbigera
D. pulcherrima NA NA NA 0 - D. wallichiana & D. crassirhizoma
D. barbigera NA NA NA 0.2 - D. filix-mas & D. goeringiana
D. cycadina NA NA NA 0.5 - D. wallichiana & D. pulcherrima
D. stenolepis NA NA NA 2.9 - D. barbigera & D. goeringiana
D. sublacera NA NA NA 4 - D. sparsa
D. goeringiana NA NA NA 0.2 - D. barbigera
参考文献
1 楼之岑,秦波.常用中药材品种整理和质量研究(北方篇)(第 2册).北
京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1995∶55~84.
2 Saunders G W. Applying DNA barcoding to red macroalgae: a pre－
liminary appraisal holds promise for future applications. Philos Trans
R Soc Lond B Biol Sci , 2005, 360(1462) ∶1879~1888.
3 Kress W J, Wurdack K J, Zimmer E A, et al . Use of DNA bar－
codes to identify flowering plants. Proc Natl Acad Sci U S A ,
2005, 102(23) ∶8369~8374.
4 Liu Y, Yan H F, Cao T, et al . Evaluation of 10 plant barcodes in
bryophyta (mosses). JSE , 2010, 48(1) ∶36~46.
5 Li F W, Kuo L Y, Rothfels C J, et al . rbcL and matK earn two
thumbs up as the core DNA barcode for ferns. PLoS One, 2011, 6
(10) ∶e26597.
6 Ma X Y, Xie C X, Liu C, et al . Species identification of medicinal
pteridophytes by a DNA barcode marker, the chloroplast psbA-trnH
intergenic region. Biol Pharm Bull , 2010, 33(11) ∶1919~1924.
7 马新业 .药用蕨类植物 DNA 条形码筛选和评价 .北京 :中国医学
科学院、北京协和医学院药用植物研究所 ,2010.
8 Chen S L, Yao H, Han J P, et al . Validation of the ITS2 region as
a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS
One, 2010, 5(1) ∶e8613.
9 Slabbinck B, Dawyndt P, Martens M, et al . TaxonGap: a visualiza－
tion tool for intra -and inter -species variation among individual
biomarkers. Bioinformatics, 2008, 24(6) ∶866~867.
10 Campanella J J, Bitincka L, Smalley J. MatGAT: an application
that generates similarity/identity matrices using protein or DNA se－
quences. BMC Bioinformatics , 2003, 4 ∶29.
11 陈士林 ,姚辉 ,韩建萍 ,等.中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 .
中国中药杂志 ,2013,38(2) ∶141~148.
注：A. 实验样品范围（19 样品 9 个物种），B. 扩大样品范围（44 样品 17 个物种）；*. 和网络物种有重复的实验物种；NA. 物种
内仅 1 份样品，无法计算种内距离；-. 无相关内容。
Identification of Original Plants of Guanzhong (Dryopteris Species) by Chloroplast psbA-trnH
Intergenic Region
Liu Feng, Jiang Yanfengyang, Zhan Ruoting, Ma Xinye, Chen Weiwen
1485
世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药种质资源生物化学跨学科研究及其在南药中的实践
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
（责任编辑：张丰丰 张志华，责任译审：王 晶）
(Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Key Laboratory of Chinese Medicinal
Resource from Lingnan, Ministry of Education, Guangzhou University of Chinese Medicine,
Guangzhou 510006, China)
Abstract: This article was aimed to study the species identification capability of psbA-trnH among Guanzhong herbs
from Dryopteri. The nucleotide sequence information of psbA-trnH region was abstracted using standardized manners
from 9 Dryopteri species (19 samples). The identification efficiency of psbA-trnH was analyzed based on TaxonGap
among both tested materials (9 species, 19 samples) and tested materials plus GenBank data (17 species, 44 samples
in total). The results showed that with the expanded species range, the discriminative efficiency of psbA-trnH de-
clined from 100% (9/9) to 82.4% (14/17), while the proportion of within-specific heterogeneity larger than between-
specific separability increased from 11.1% (1/9) to 52.9% (9/17). It was concluded that psbA-trnH can be recom-
mended as the valuable barcode for homonym distinguishment among Guanzhong herbs, with attention of adequate
sampling within species.
Keywords: Guanzhong, Dryopteri, DNA barcodes, psbA-trnH
1486