全 文 :要内源性因子[7]。
珍珠含有大量的微量元素和氨基酸,珍珠水解液具有很
高的药用价值。能抑制成纤维细胞的生长、抑制瘢痕的形
成[8]。本实验结果显示:皮肤瘢痕及正常皮肤来源的成纤维
细胞在不同浓度珍珠水解液作用后,的bFGF的mRNA和蛋
白表达上调,同时TGF-β1mRNA和蛋白表达下调,且呈浓
度依赖性,说明珍珠水解液可调节成纤维细胞bFGF、TGF-
β1的分泌,其可能对人体瘢痕的形成起到一定的抑制作用,
其作用功效及机制值得进一步研究。
参考文献:
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广西医科大学学报 2014Feb;31(1)
*基金项目:广西瑶族习用药材质量评价与标准研究项目
(No.MZY2012022)
△通信作者,Tel:0771-3130064,E-mail:hrs.3130064@163.com
1广西民族医药研究院 南宁 530001
2广西柳州食品药品检验所 柳州 545006
收稿日期:2013-10-25
HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和
百两金皂苷A含量的方法研究*
侯金玲 黄瑞松1△ 蒋秋香2 吴柳春2
(广西大学农学院 南宁 530004)
摘要 目的:建立瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A的含量测定方法,以控制该药材质量。方法:采用高效液相色谱—蒸
发光散射检测器(HPLC-ESLD),摸索确定色谱条件,采用正交设计方法,筛选确定供试品溶液制备方法。结果:HPLC色谱条
件:色谱柱为 Kromasil C18100A(250mm×4.6mm,5μm),柱温35℃;流动相为甲醇—水梯度洗脱,流速0.8mL/min;ESLD
参数为漂移管温度105℃,气体流量2.5L/min;进样量为对照品溶液5,20μL,供试品溶液5~20μL。供试液制备方法:药材
破碎度为过4号筛的粉末,甲醇浓度为75%,超声时间为20min。结论:建立的竹叶风含量测定方法简便准确,重复性好,可
作为竹叶风质量评价和控制的方法之一。
关键词 竹叶风;岩白菜素;百两金皂苷A;HPLC-ELSD
中图分类号:R-33 文献标志码:A 文章编号:1005-930X(2014)01-0050-05
竹叶风,又名斩龙剑、破凉散、竹叶马胎,百两金、蛇连
天,大 罗 伞[1~3],为 紫 金 牛 科 植 物 百 两 金 Ardisia crispa
(Thunb)A.DC.的全株。本品为广西瑶族民间常用药材,属
于瑶药“老班药”中“七十二风”药材之一。广西瑶族民间习
用本品治疗咽喉肿痛、扁桃腺炎、肺结核咳嗽、内伤瘀积、风
湿痹痛、闭经、产后瘀滞腹痛、肾炎水肿、跌打损伤、蛇伤、疥
癣等[1,3]。文献记载,竹叶风具有抗炎抑菌、抗病毒、解热、抗
生育和抗肿瘤等作用[4~6];本品主要含生物碱、岩白菜素、紫
金牛酸,百两金皂苷A、B、C,环状缩合肽FR900359、汉黄芩
素、千层纸素、汉黄芩苷、黄芩苷、异安五脂素、α-菠甾醇等成
分[5~9];其中岩白菜素和百两金皂苷 A 为主要的活性成
分[10,11]。至今有关竹叶风化学成分含量测定方法的研究甚
少,只有岩白菜素含量测定的报道[12],但其测定方法为纸层
析法,准确性和重复性均较低,未能作为评价和控制该药材
质量的依据。为正确评价该药材质量优劣,控制该药材质
·05· 广西医科大学学报 2014Feb;31(1)
DOI:10.16190/j.cnki.45-1211/r.2014.01.004
量,进一步开发利用瑶药资源,建立瑶药材竹叶风含量测定
方法具有重要意义。本文采用 HPLC-ESLD法,通过试验,
确定了色谱条件和供试品溶液的制备方法,建立了竹叶风岩
白菜素和百两金皂苷A含量测定方法,为该药材质量标准的
制订提供了技术支撑。
1 材 料
1.1 仪器:Waters 2695型高效液相色谱仪(四元泵,Em-
power色谱工作站,美国沃特斯公司),Altech ELSD 2000
ES型蒸发光散射检测器(美国奥泰科技公司),XWK-3A空
气泵(天津华生分析仪器厂),超声波清洗器AS7240BT(天津
奥特赛恩斯仪器有限公司),微量电子分析天平XP26和电子
分析天平XS205(均为瑞士梅特勒公司)。
1.2 试药与材料:竹叶风药材分别采集于金秀县金秀镇、恭
城县莲花乡和全州县石塘镇。其中采于金秀县的对号腊叶
标本经广西植物研究所韦发南研究员和广西食品药品检验
所黄夑才主任药师鉴定,确定为紫金牛科植物百两金Ardisia
crispa(Thunb.)A.DC.;岩白菜素对照品(中国食品药品检
定研究院,供含量测定用,批号:111532-200202),百两金皂苷
A 对照品(成都曼思特生物科技有限公司批号:MUST-
12090902,含量≥98%),流动相所用甲醇、乙腈均为色谱纯
(美国Fisher公司),水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件摸索和确定
2.1.1 检测器的选择:采用紫外-可见分光光度计在190~
400nm波长范围分别对岩白菜素对照品甲醇溶液和百两金
皂苷A的甲醇溶液进行光谱扫描。结果:岩白菜素在275nm
处有最大吸收,百两金皂苷 A的甲醇溶液在203nm处有最
大吸收,此处为紫外末端吸收,如采用紫外检测器检测会受
到较大的干扰。故本文采用质量型通用检测器蒸发光散射
检测器进行检测测定。
2.1.2 蒸发光散射检测器参数的确定:经实验摸索,以漂移
管温度105℃、气体流量2.5L/min、放大系数2为检测器的
参数条件,岩白菜素和百两金皂苷A两有效成分峰与各杂质
峰分离度达到要求,峰型好。
2.1.3 色谱柱的选择:在同一色谱条件下比较了 Venusil
ASB C18、WondaSil C18、Diamonsil C18、Kromasil 100-5C18(进
口)、Kromasil C18100A(国产)(规格均为5μm,4.6mm×
250mm)柱子的分离效果。结果:前两根柱子分离效果欠佳,
后3根柱子均有较好的分离效果,故本文选用 Kromasil C18
100A柱。
2.1.4 流动相的选择:在同一色谱条件下分别采用甲醇-
水和乙腈-水系统为流动相,进行等度和梯度洗脱考察。结
果:等度洗脱分离效果差,以甲醇-水系统梯度洗脱的分离
效果较好,故本文采用之。其梯度洗脱程序,见表1。
2.1.5 流动相流速和柱温的选择:实验中比较了不同流速
(0.8,1.0,1.2mL/min)和不同柱温(30,35,40℃)对两组分
分离效果的影响。结果表明,随流速的加大,组分的保留时
间缩短,柱压升高,分离度有差异,以流速为0.8mL/min时
组分的分离效果较理想,且保留时间和柱压合适;而随着柱
温的上升,组分的保留时间缩短,柱压降低,分离度基本一
致,但为了保护柱子,延长使用寿命,确定柱温为35℃。
表1 流动相梯度洗脱程序
时间
(t/min)
流动相A
(%)
流动相B
(%)
0~8 18→30 82→70
8~10 30→70 70→30
10~27 70→55 30→45
27~35 55→18 45→82
2.2 供试品溶液制备方法的优化
2.2.1 提取溶剂及方法的选择:依据岩白菜素和百两金皂
苷A具有醇溶性的特性,分别采用甲醇和乙醇两种溶剂,分
别进行超声和回流提取,考察各种提取液的分离效果及白菜
素和百两金皂苷A的得率。结果:两种溶剂提取白菜素和百
两金皂苷A提取得率相近;但乙醇提取液色谱图岩白菜素峰
出现肩峰,分离效果欠佳;超声提取较回流提取得率稍高,且
超声处理操作简便。综合考虑,本文采用甲醇超声提取制备
供试品溶液,见表2。
表2 不同溶剂和方法制备的供试液岩白菜素和
百两金皂苷A得率
提取溶剂
和方法
岩白菜素
(%)
百两金皂
苷A(%)
总量
(%)
75%甲醇超声 0.069 5 0.289 8 0.359 3
75%乙醇超声 0.042 5 0.293 9 0.336 4
75%甲醇回流 0.073 5 0.285 0 0.358 5
75%乙醇回流 0.040 3 0.293 5 0.333 8
2.2.2 提取条件的优化:采用正交设计方法优化供试品溶
液制备条件。选择药材破碎度、甲醇的浓度和超声处理时间
作为考察因素,因素水平见表3。采用L9(34)正交表安排实
验,分别以岩白菜素得率(Y1)和百两金皂苷A(Y2)得率作为
考核指标,考察上述三因素三水平对岩白菜素和百两金皂苷
A得率的影响。结果:各因素对岩白菜素和百两金皂苷A得
率的影响程度为:A> B> C,除了药材破碎度对岩白菜素
和百两金皂苷A得率有明显的影响外,其余因素均对得率无
显著影响。综合考虑,供试品溶液的制备条件优化为 A1B2
C1,即药材粉碎为过4号筛的粉末,以75%甲醇作为提取溶
剂,超声时间20min,见表3~表7。
2.3 溶剂制备
2.3.1 对照品溶液的制备:精密称取岩白菜素和百两金皂
苷A对照品各适量,加75%甲醇制成每1mL含岩白菜素
80μg、百两金皂苷A 250μg的混合溶液,作为对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备:取样品粉末(过4号筛)0.5g,精
·15·侯金玲,等 .HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A含量的方法研究
密称定,精密加入75%甲醇25mL,称定重量,超声处理(功
率240W,频率33kHz)20min,再称定重量,用75%甲醇补
足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液15mL,蒸干,残
渣加75%甲醇溶解,移置5mL量瓶中,加75%甲醇至刻度,
摇匀,作为供试品溶液。
2.3.3 阴性溶液的制备:以75%甲醇作为阴性对照溶液。
表3 甲醇超声提取的因素水平
水平
因素
A.药材破碎
度(筛号)
B.甲醇
浓度(%)
C.提取时间
(t/min)
1 过2号筛 50 20
2 过3号筛 75 30
3 过4号筛 90 60
表4 岩白菜素的正交试验与结果
列号 A B C D Y1(%)
1 1 1 1 1 0.027 0
2 1 2 2 2 0.024 8
3 1 3 3 3 0.024 9
4 2 1 2 3 0.094 5
5 2 2 3 1 0.087 1
6 2 3 1 2 0.073 7
7 3 1 3 2 0.076 5
8 3 2 1 3 0.073 1
9 3 3 2 1 0.061 9
K1 0.076 7 0.198 0 0.173 7
K2 0.255 4 0.184 9 0.181 2
K3 0.211 4 0.160 5 0.188 5
珡K1 0.025 6 0.066 0 0.057 9
珡K2 0.085 1 0.061 6 0.060 4
珡K3 0.070 5 0.053 5 0.062 8
R 0.059 6 0.008 2 0.004 9
表5 岩白菜素方差分析
方差
来源
离均差
平方和
自由
度(n)
均方
(MS) F P
A 5.778 8×10-3 2 2.89×10-3 89.13 <0.05
B 2.422 1×10-4 2 1.21×10-4 3.74 >0.05
C 3.637 5×10-5 2 1.82×10-5 0.56 >0.05
误差 6.483 2×10-5 2 3.24×10-5
总计 6.122 2×10-3 8
注:F0.01(2,2)=99.01,F0.05(2,2)=19.00
表6 百两金皂苷A的正交试验与结果
列号 1 2 3 4 Y2(%)
1 1 1 1 1 0.090 1
2 1 2 2 2 0.077 4
3 1 3 3 3 0.081 9
4 2 1 2 3 0.239 5
5 2 2 3 1 0.231 2
6 2 3 1 2 0.229 0
7 3 1 3 2 0.307 0
8 3 2 1 3 0.303 7
9 3 3 2 1 0.292 6
K1 0.249 4 0.636 6 0.622 8
K2 0.699 7 0.612 3 0.609 5
K3 0.903 3 0.603 5 0.620 1
珡K1 0.083 1 0.212 2 0.207 6
珡K2 0.233 2 0.204 1 0.203 2
珡K3 0.301 1 0.201 2 0.206 7
R 0.218 0 0.011 0 0.003 5
表7 百两金皂苷A方差分析
方差
来源
离均差
平方和
自由
度(n)
均方
(MS) F P
A 7.464 5×10-2 2 3.73×10-2 2 558.49 <0.01
B 1.959 5×10-4 2 9.80×10-5 6.72 >0.05
C 3.294 9×10-5 2 1.65×10-5 1.13 >0.05
误差 2.917 6×10-5 2 1.46×10-5
总计 0.074 9 8
注:F0.01(2,2)=99.01,F0.05(2,2)=19.00
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性和系统适用性试验:分别取2.3.1项岩白菜
素和百两金皂苷A混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照
溶液各20μL进样、测定。结果:供试品色谱中均有与岩白
菜素和百两金皂苷A保留时间相同的吸收峰,阴性对照品溶
液色谱则无此吸收峰,且岩白菜素和百两金皂苷A峰均可达
到基线分离,分离度均大于1.5,两者理论板数均在2 000以
上。说明本方法测定岩白菜素和百两金皂苷 A含量无阴性
干扰,专属性和系统适用性强,见图1。
2.4.2 线性关系考察:精密称取岩白菜素对照品10.05mg
置50mL量瓶中,加75%甲醇至刻度,摇匀;精密称取百两金
皂苷A对照品15.81mg置25mL量瓶中,加75%甲醇至刻
度,摇匀。分别精密吸取上述两种对照品溶液各0.4,1.0,
2.0,3.0,4.0,5.0mL置同一10mL量瓶中,各加75%甲醇
至刻度,摇匀,作为不同浓度的混合对照品溶液。将上述对
照品溶液照上述2.1确定的色谱条件分别进样20μL,以对
照品的进样量(μg)为横坐标,峰面积积分值的对数为纵坐
标,绘制标准曲线。结果:岩白菜素回归方程为y=1.650 x
+5.980,r=0.999 5,进样量在0.160 8~2.01μg范围时与
峰面积的对数呈良好线性关系;百两金皂苷 A回归方程为
·25· 广西医科大学学报 2014Feb;31(1)
y=1.560 x +5.940,r=0.999 7,进样量在0.505 8~
6.323μg范围时与峰面积的对数呈良好线性关系。
2.4.3 精密度试验:①重复性试验:取同一份供试品溶液
(金秀县),照2.1确定的色谱条件,连续进样测定6次。结
果:6次测定的岩白菜素峰面积平均值为869 960,RSD=
2.2%;百两金皂苷 A 峰面积平均值为5 221 359,RSD=
1.8%,表明本方法重复性良好。②重现性试验:取同一批样
品(金秀县)粉末,照2.3.2方法平行制备6份供试品溶液,分
别测定并计算平均回收率和RSD。结果:6份样品测得岩白
菜素含量平均值为0.078%,RSD=1.3%;百两金皂苷 A含
量平均值为0.305%,RSD=1.7%,表明本方法重现性良好。
2.4.4 稳定性试验:取同一份供试品溶液(金秀县),照2.1
确定的色谱条件,分别于0,2,4,6,8,12,24h进样测定。结
果:24h内各次测得的岩白菜素含量的RSD为0.7%;百两
金皂苷A含量的RSD为2.5%。说明供试品溶液中岩白菜
素和百两金皂苷A的含量在24h内基本稳定。
2.4.5 回收率试验:精密称取岩白菜素对照品10.10mg置
25mL量瓶中,加75%甲醇至刻度,摇匀;另精密称取百两金
皂苷A对照品12.64mg,置25mL量瓶中,加75%甲醇至刻
度,摇匀。分别精密吸取上述岩白菜素对照品溶液4mL、百
两金皂苷 A对照品溶液15mL置同一250mL量瓶中,加
75%甲醇至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。
分别取已知含量的同一样品(金秀县)粉末约0.25g共
6份,精密称定,各加上述岩白菜素和百两金皂苷 A混合对
照品溶液25mL,照2.3.2方法制备供试品溶液,测定并计算
平均回收率及 RSD。结果:岩白菜素含量平均回收率=
103.2%,RSD=1.7%(n=6);百两金皂苷A含量平均回收
率=98.0%,RSD=1.0%(n=6),见表8、表9。
2.4.6 仪器最低检出限试验:分别取岩白菜素和百两金皂
苷A对照品用75%甲醇溶液进行稀释,计算信噪比3∶1时
注入仪器的量。结果:岩白菜素的最低检出限为0.003 22μg,
百两金皂苷A的最低检出限为0.012 6μg。
2.4.7 耐用性试验:1色谱柱的考察:分别采用Kromasil C18
100A柱、Diamonsil C18柱和 Agilent Eclipse XDB-C18柱等3
根不同品牌色谱柱(规格均为5μm,4.6mm×250mm),测
定同一供试品溶液(金秀县)中岩白菜素和百两金皂苷 A的
含量。结果:三根色谱柱测定岩白菜素平均值为0.078%,
RSD=1.2%;百两金皂苷 A含量平均值为0.27%,RSD=
3.0%。2色谱仪的考察:分别采用 Waters2695和岛津LC-
20AT两台不同品牌的色谱仪,测定同一供试品溶液(金秀
县)中岩白菜素和百两金皂苷 A的含量。结果:两台色谱仪
测定岩白菜素平均值为0.074%,RAD=0.04%;百两金皂苷
A含量平均值为0.26%,RAD=0.1%。
图1 混合对照品(A)、供试液(B)、阴性对照液(C)HPLC色谱图
1:岩白菜素;2:百两金皂苷A
·35·侯金玲,等 .HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A含量的方法研究
表8 岩白菜素加样回收率试验结果(n=6)
编号 样品中含量(m/mg)
加入量
(m/mg)
测得量
(m/mg)
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD
(%)
1 0.175 1 0.161 6 0.342 4 103.5
2 0.175 4 0.161 6 0.341 6 102.8
3 0.175 6 0.161 6 0.344 0 104.2 103.2 1.7
4 0.175 5 0.161 6 0.341 7 102.9
5 0.175 1 0.161 6 0.345 6 105.5
6 0.175 3 0.161 6 0.337 3 100.3
表9 百两金皂苷A加样回收率试验结果(n=6)
编号 样品中含量(m/mg)
加入量
(m/mg)
测得量
(m/mg)
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD
(%)
1 0.682 2 0.758 4 1.416 4 96.8
2 0.683 3 0.758 4 1.422 1 97.4
3 0.684 1 0.758 4 1.427 8 98.1 98.0 1.0
4 0.683 6 0.758 4 1.432 0 98.7
5 0.682 0 0.758 4 1.421 9 97.6
6 0.682 8 0.758 4 1.437 1 99.5
2.5 样品含量测定:分别取岩白菜素对照品、百两金皂苷A
对照品及3批竹叶风药材样品,照2.3.2方法制备对照品溶
液和供试品溶液,照2.1确定的色谱条件测定样品中岩白菜
素和百两金皂苷A的峰面积,以外标两点法对数方程计算其
含量。结果:3批样品按药材干燥品计算,岩白菜素含量分别
为0.30%(恭城县)、0.08%(全州县)和0.08%(金秀县);百
两金皂苷A含量分别为0.31%(恭城县)、0.25%(全州县)和
0.28%(金秀县)。
3 讨 论
3.1 文献记载,竹叶风含生物碱、岩白菜素、紫金牛酸,百两
金皂苷 A 、B、C等成分[5,7~9],其中岩白菜素具有抗炎、抗
HIV病毒、止咳、抗溃疡、护肝等作用[10],百两金皂苷A具有
抗肿瘤、收缩子宫等作用[5,6,11],两者均为该药材的有效成
分,故本文选择它们作为该药材含量测定的考核指标;有关
该药材含量测定的方法过去有采用纸层析法测定岩白菜素
含量[12],该方法准确度低,重现性差。竹叶风中百两金皂苷
A含量测定则未见文献报道。本文采用 HPLC-ESLD建立
这两种成分的含量测定方法,对正确评价该药材质量优劣,
控制药材质量具有重要意义。
3.2 本文通过对 HPLC-ESLD的摸索试验和正交试验,确
定了本方法的色谱条件和供试品溶液的制备方法。经方法
学考察,证实确定的含量测定方法专属性强,重复性和重现
性好,供试液中的岩白菜素和百两金皂苷 A含量在24h内
稳定,欲测成分的回收率符合规定,且本方法在试验范围内
对不同色谱柱和不同液相色谱仪的耐用性均较强。说明本
方法符合中草药含量测定的技术要求,可作为该药材含量测
定的方法。
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·45· 广西医科大学学报 2014Feb;31(1)