全 文 ：研究报告
Research Report
羊乳及其制品中掺入牛属牛乳和水牛乳的检测
黎颖 巫坚 1* 林波 2 曾庆坤 2
1广西分析测试中心,南宁, 530022; 2中国农业科学院广西水牛究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁, 530001
*通讯作者, 823561681@qq.com
摘 要 本研究分别对羊乳中掺入牛属牛乳和水牛乳的检测方法进行研究。以双重 PCR的方法对新鲜羊乳
及其制品，包括高温杀菌液态乳、酸乳和干酪，在其中分别掺入 1%、10%、90%、99%牛属牛乳和 5%、10%、
95%、99%水牛乳进行了检测。结果显示，在羊乳及其制品中掺入牛属牛乳能检测下限到达 1%的掺入比例；
在新鲜羊乳、高温杀菌液态奶和干酪中掺入水牛乳能检测下限到 5%的掺入比例，而在酸乳中掺入水牛乳能
检测下限到 10%的掺入比例。结果表明，双重 PCR对羊乳及其制品中牛属乳源和水牛乳源的掺入有不同下
限，与检测物种和乳制品种类有关，总体上该 PCR法特异性强，灵敏度好，可以作为检测羊乳中掺入牛属牛
乳和水牛乳的有效手段之一，为打击羊乳行业的掺假行为提供技术依据。
关键词 羊乳,牛乳,水牛乳,掺假, PCR,检测
Research on Detecting Method of Adulterating Bos Milk and Buffalo Milk
into Goat Milk and Its Products
Li Ying 1 Wu Jian 1* Lin Bo 2 Zeng Qingkun 2
1 Guangxi Analysis and Test Center, Nanning, 530022; 2 Guangxi Key Laboratory of Buffalo Genetics, Reproduction and Breeding, Guangxi Buf-
falo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning, 530001
* Corresponding author, 823561681@qq.com
DOI: 10.13417/j.gab.034.000977
Abstract This study is aim to investigate the detection method of adulterating bos milk and buffalo milk into goat
milk and its products. Duplex PCR method was applied to detect adulteration of fresh goat milk and its products,
including high temperature sterilized liquid milk, yogurt And cheese, with 1%, 10%, 90%, 99% bos milk and 5%,
10% , 95% , 10% buffalo milk, respectively. Results showed that the minimal detection threshold for bos milk
adulteration can reach 1% in fresh goat milk and its every products when they are mixed with bos milk. The minimal
detection threshold for buffalo milk adulteration in fresh goat milk, high temperature sterilized liquid milk and
cheese were 5%, whle the minimal detection threshold in yogurt was just 10% in this study. The results indicated that
duplex PCR method have different minimal detection threshold for bos and buffalo milk when they are adulated into
goat milk and production, and the threshold is related to the detecting species and dairy products, generally, this
duplex PCR methods have high specificity and sensitivity to detect adulation of bos and buffalo milk into goat milk
and its products, therefore, it can be used as a efficient method to hit the adulation in goat milk production industry.
Keywords Goat milk, Bos milk, Buffalo milk, Adulteration, PCR, Detection
基金项目：本研究由广西科技基础条件平台建设项目计划(12-112-01C)和广西壮族在自治区重大专项计划项目(桂科重 1222003-2-3)
共同资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 5期，第 977-981页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.5, 977-981
在世界上大多数国家，牛乳和羊乳是乳品市场
的主要部分。特别是在我国，近几年来随着人们日常
生活水平的提高，大众对于羊乳品的消费逐渐增长。
与牛乳相比较，羊乳因其含有丰富的蛋白质、脂肪、
矿物质和维生素等，更利于人体消化吸(Huang et al.,
2011)，同时羊乳中不含过敏性蛋白，特别适合婴幼
儿、老年人和身体虚弱者饮用。但相对的，羊乳的产
量非常有限，因而目前市场上便出现了一些不法分
子为了降低成本而在其中掺入牛乳。这些行为严重
侵害了消费者的权益，同时也扰乱了市场的秩序，影
响行业的正常发展。目前已经有较多研究建立了液
体羊乳中掺入牛乳的检测方法，这些方法包括高效
液相色谱法(HPLC) (Romero et al., 1996)、高校液相
色谱与质谱联用方法(HPLC-MS)(Chenetal.,2004)、等电
点聚焦电泳(IEF) (Mayer et al., 2012)、毛细管电泳(CE)
(石燕等, 2010)、免疫学(ELISA) (Hurley et al., 2004)
和聚合酶链式反应技术(PCR) (Dalmasso et al., 2012)
等。然而，针对羊乳制品如干酪和酸奶等的掺假检测
方法还较少。PCR技术是基于 DNA的检测技术，目
前已有较多羊乳中掺入牛属牛乳的 PCR检测方法，
但对于水牛乳这类新兴的乳源尚无研究报道。因此，
本研究旨在利用 PCR方法，建立一种羊乳及其制品
中掺入牛属牛乳和水牛乳的检测技术，为羊乳行业
掺假检测提供更全面的技术支撑。
1结果与分析
1.1羊乳及其制品中中掺入牛属牛乳的检测
掺入一定比例牛属牛乳的新鲜羊乳、高温灭菌
羊乳、酸羊乳和羊乳干酪的双重 PCR检测结果显示
如图 1，结果发现在羊乳及其制品中掺入 1%、10%、
图 1羊乳及其制品中掺入牛属牛乳的双重 PCR检测
注: M: 100 bp Marker; +:羊乳和牛属牛乳以 1:1比例混合乳;
1:纯牛属牛乳; 2:纯羊乳; 3~6:掺入 1%, 10%, 99%和 90%牛
属牛乳的新鲜羊乳; 7~10:掺入 1%, 10%, 99%和 90%牛属牛
乳的高温灭菌羊乳; 11~14:掺入 1%, 10%, 99%和 90%牛属牛
乳的羊酸乳; 15~18:掺入 1%, 10%, 99%和 90%牛属牛乳的羊
乳干酪;-:双蒸水空白对照
Figure 1 Detection of goat milk and its products mixed with bos
milk by duplex PCR
Note: M: 100 bp Marker; + : Goat milk and bos milk with 1:1
mix; 1: Pure bos milk; 2: Pure goat milk; 3~6: Fresh goat milk
mixed with 1% , 10% , 99% and 90% bos milk, respectively;
7~10: High temperature sterilized liquid milk mixed with 1% ,
10%, 99% and 90% bos milk, respectively; 11~14: Yogurt mixed
with 1% , 10% , 99% and 90% bos milk, respectively; 15~18:
Cheese mixed with 1%, 10%, 99% and 90% bos milk, respectively;
-: ddH2O as blank
90%和 99%的牛属牛乳中均出现了羊特性条带和牛
属特性条带，表明牛属牛乳在这些掺入比例下均都
能检测出来。目前，对奶制品掺其它奶源的检测鉴别
技术方法研究非常之多，以 DNA为基础的 PCR技
术因其特异性强，灵敏度高，适应性广以及简单快捷
而得到普遍认可。本研究通过对羊乳经过加工后的
高温灭菌奶、酸奶和干酪的检测表明，DNA比蛋白
质等的稳定性更好，特别是经过食品加工过程后，还
能够提取到足够长度的有效 DNA片段，且检测灵敏
度达到了 5%的检测水平，完全能够满足生产实际中
的检测下限要求。
1.2羊乳及其制品中掺入水牛乳的检测
掺入一定比例水牛乳的新鲜羊乳、高温灭菌羊
乳、酸羊乳和羊乳干酪的双重 PCR检测结果显示如
图 2~图 5，结果发现在羊乳及其制品中掺入 10%、
95%和 99%水牛乳后，经 PCR扩增均出现羊特异性
条带和水牛特异性条带，但在掺入 5%水牛乳的羊酸
乳中仅有羊特异性条带，未出现水牛特异性条带，表
明 PCR法在检测不到掺入 5%的水牛乳外，其余的
都能检测出来。PCR检测的特点是特异性高，因为
DNA本身具有同一物种保守性，使得这种以物种间
基因差异为基础的分子生物学检测方法可以高效的
鉴别多种不同物种。本研究中，设计了水牛特异性引
物与羊特异性因为进行双重 PCR检测结果表明，水
牛引物特异性好，与羊和牛属牛特异性差异明显。
PCR技术理论上对于体系中存在一个拷贝的模板都
图 2掺入水牛乳的新鲜羊乳双重 PCR检测
注: M: 100 bp Marker; +:羊乳和水牛乳以 1:1比例混合乳; 1:
纯水牛乳; 2:纯羊乳; 3~6:掺入 99%, 95%, 5%和 10%水牛乳
的新鲜羊乳;-:双蒸水空白对照
Figure 2 Detection of fresh goat milk mixed with buffalo milk by
duplex PCR
Note: M: 100 bp Marker; +: Goat milk and buffalo milk with 1:1
mix; 1: Pure buffalo milk; 2: Pure goat milk; 3~6: Fresh goat milk
mixed with 99%, 95%, 5% and 10% buffalo milk, respectively;-:
ddH2O as blank
羊乳及其制品中掺入牛属牛乳和水牛乳的检测
Research on Detecting Method of Adulterating Bos Milk and Buffalo Milk into Goat Milk and Its Products 978
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 3掺入水牛乳的高温灭菌羊乳双重 PCR检测
注: M: 100 bp Marker; +:羊乳和水牛乳以 1:1比例混合乳; 1:
纯水牛乳; 2:纯羊乳; 3~6:掺入 99%, 95%, 5%和 10%水牛乳
的高温灭菌羊乳;-:双蒸水空白对照
Figure 3 Detection of high temperature sterilized liquid milk
mixed with buffalo milk by duplex PCR
Note: M: 100 bp Marker; +: Goat milk and buffalo milk with 1:1
mix; 1: Pure buffalo milk; 2: Pure goat milk; 3~6: High tempera-
ture sterilized liquid milk mixed with 99%, 95%, 5% and 10%
buffalo milk, respectively;-: ddH2O as blank
图 4掺入水牛乳的羊酸乳双重 PCR检测
注: M: 100 bp Marker; +:羊乳和水牛乳以 1:1比例混合乳; 1:
纯水牛乳; 2:纯羊乳; 3~6:掺入 99%, 95%, 5%和 10%水牛乳
的羊酸乳;-:双蒸水空白对照
Figure 4 Detection of goat yogurt mixed with buffalo milk by du-
plex PCR
Note: M: 100 bp Marker; +: Goat milk and buffalo milk with 1:1
mix; 1: Pure buffalo milk; 2: Pure goat milk; 3~6: Goat yogurt
mixed with 99%, 95%, 5% and 10% buffalo milk, respectively;-:
ddH2O as blank
图 5掺入水牛乳的羊乳干酪双重 PCR检测
注: M: 100 bp Marker; +:羊乳和水牛乳以 1:1比例混合乳; 1:
纯水牛乳; 2:纯羊乳; 3~6:掺入 99%, 95%, 5%和 10%水牛乳
的羊乳干酪;-:双蒸水空白对照
Figure 5 Detection of goat cheese mixed with buffalo milk by du-
plex PCR
Note: M: 100 bp Marker; +: Goat milk and buffalo milk with 1:1
mix; 1: Pure buffalo milk; 2: Pure goat milk; 3~6: Goat cheese
mixed with 99%, 95%, 5% and 10% buffalo milk, respectively;
-: ddH2O as blank
可以进行扩增反应，但是实际上还要受到许多抑制
因素的制约，例如体系中存在的有机杂质。本研究
中，对掺入 5%比例水牛乳的羊酸奶样品检测，未能
检测出水牛特异性条带的原因可能与 DNA提取过
程中，产生的蛋白污染和杂质比较多有关。所以，研
究人员往往会测定 DNA的质量后利用 18S rRNA的
引物进行预实验，以排除由于 PCR体系本身抑制因
素的存在或者无效 DNA模板造成的假阴性干扰。
2讨论
PCR技术理论上对于体系中存在一个拷贝的模
板都可以进行扩增反应，但是实际上还要受到许多抑
制因素的制约，例如体系中存在的有机杂质。所以，研
究人员往往会测定 DNA的质量后利用 18S rRNA的
引物进行预实验，以排除由于 PCR体系本身抑制因
素的存在或者无效 DNA模板造成的假阴性干扰。本
研究，增设了一对羊特异性引物，以双重 PCR体系检
测羊乳中掺入牛属乳或水牛乳的情况。因而，可以减
少用 18S rRNA的引物进行预实验步骤，同时还可以
检验抽提出来的 DNA模板的有效性。
本方法能在新鲜羊乳、高温灭菌羊乳、酸羊乳和
羊乳干酪中检出掺入 1%牛属牛乳，在新鲜羊乳、高
温灭菌羊乳和羊乳干酪中检出掺入 5%水牛乳，而在
酸羊乳中检出掺入 10%水牛乳，这可能是因为受酸
乳 PH的影响，降低了蛋白酶的活性，从而使 DNA
的抽提效率受到了影响。但总的来说，本研究的方法
不失为在羊乳中掺入牛乳检测的一个有效，灵敏，快
捷方法。
3材料与方法
3.1实验设计
在羊乳中分别掺入 1%、10%、90%、99%牛属牛
乳(荷斯坦和娟姗牛乳的等比例混合乳)和 5%、10%、
95%的水牛乳，从而得到新鲜混合羊乳；采用新鲜混
合羊乳分别制作得到高温杀菌液态奶、酸奶、干酪。
将上述混合羊乳及其乳制品进行前处理后采用 QIA-
GEN食品 DNA抽提试剂盒(DNeasy mericon food kit,
Cat. No. 69514)抽提 DNA。根据文献(López-Calleja et
al., 2005; De et al., 2011) (SN/T 1119-2002.进口动物
源性饲料中牛羊源性成分检测方法-PCR方法[s])合
成牛属牛、水牛和羊特异性引物见表 1，然后进行双
重 PCR扩增，扩增产物进行电泳检测。如在混合羊
乳或其乳制品中可扩增出水牛的基因片段，则表明
979
羊乳及其制品中掺入牛属牛乳和水牛乳的检测
Research on Detecting Method of Adulterating Bos Milk and Buffalo Milk into Goat Milk and Its Products
表 1本研究所用 PCR引物及其序列
Table 1 Primers used in this study
引物名称
The name of the primer
牛属牛特异性引物
Bos specific primers
水牛特异性引物
Buffalo specific primers
羊特异性引物
Goat specific primers
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA
AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT
CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA
TTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT
TATTAGGCCTCCCCCTTGTT
CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC
片段长度(bp)
Fragment length (bp)
346
220
294
可能有水牛乳掺入。
3.2主要试剂和仪器
PCR引物，由捷瑞生物工程(上海)有限公司合
成；PCR Mix、DNA Marker均购自天根生化；PCR管
(Applied Biosystems)；定性 PCR 仪 (Applied Biosys
tems GeneAmp PCR System 9700)；凝胶成像系统
(BIO-RAD)；恒温水浴锅等。
3.3高温灭菌奶、酸奶和干酪的制作
高温杀菌奶的制作：采用 100℃水浴，到达温度
后维持 2 min，然后冷却即得；羊乳酸奶制作参照曾
庆坤等(2001,中国奶牛, 2: 47-49)的方法制作；羊乳
干酪参照杨炳壮等(2008)的方法制作。
3.4样品前处理及 DNA提取
3.4.1鲜羊乳及液态羊乳制品样品的 DNA提取
取 50 mL乳样于 50 mL离心管中，2 500 r/min
离心 20 min，用小勺撇去离心管上层的乳脂，再用吸
管将上清液吸出，保留最底部的沉淀，用无菌棉球或
棉签擦除离心管壁上残存乳脂；然后向离心管中加
入 20 mL pH 7.4的 PBS，轻轻敲打离心管使沉淀悬
浮，2 500 r/min离心 20 min，用吸管将上清液吸出，
保留最底部的沉淀，再用无菌棉球擦除离心管壁上
残存乳脂；如果乳脂残存过多，再次重复向离心管中
加入 20 mL pH 7.4 PBS、离心、除脂的操作步骤；最后
将上清液吸出，保留最底部的沉淀，按照 QIAGEN食
品 DNA抽提试剂盒说明书中步骤抽提 DNA。
3.4.2发酵羊乳样品的 DNA提取
取一定量(约 10 mL或 10 g)样品于 50 mL离心
管中，然后向离心管中加入 20 mL pH 7.4的 PBS，轻
轻敲打离心管使沉淀悬浮，2 500 r/min离心 20 min，用
小勺撇去离心管上层的乳脂，再用吸管将上清液吸
出，保留最底部的沉淀，再用无菌棉球擦除离心管壁
上残存乳脂；如果乳脂残存过多，再次重复向离心管
中加入 20 mL pH 7.4的 PBS、离心、除脂的操作步骤；
最后将上清液吸出，保留最底部的沉淀，按照 QIA-
GEN食品 DNA抽提试剂盒说明书中步骤抽提DNA。
3.4.3羊乳干酪样品的 DNA提取
取 2 g干酪样品，充分研碎后置于 50 mL离心管
中；然后向离心管中加入 20 mL pH 7.4的 PBS，捣碎
并剧烈震荡使沉淀悬浮，2 500 r/min离心 20 min，用小
勺撇去离心管上层的乳脂，再用吸管将上清液吸出，
保留最底部的沉淀，再用无菌棉球擦除离心管壁上残
存乳脂；如果乳脂残存过多，再次重复向离心管中加
入 20 mL pH 7.4的 PBS、离心、除脂的操作步骤；最后
将上清液吸出，保留最底部的沉淀，按照 QIAGEN食
品 DNA抽提试剂盒说明书中步骤抽提DNA。
3.5 PCR 扩增
3.5.1羊乳中掺入牛属牛乳的双重 PCR检测
双重 PCR体系和反应程序如下：PCR总反应体
系为 25μL；其中模板 DNA2μL，2×PCRMix 12.5μL，
牛属牛和羊特异性的上下游引物 (10 μmol/μL)各
0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序为：94℃预变性
3min，94℃变性 30 s，56℃退火 45 s，72℃延 30 s，40个
循环；72℃后延伸 10 min；-20℃保存。
3.5.2羊乳中掺入水牛乳的双重 PCR检测
双重 PCR体系和反应程序如下：PCR总反应体
系为 25μL；其中模板 DNA2μL，2×PCRMix 12.5μL，
水牛和羊特异性的上下游引物(10μmol/μL)各 0.5μL，
ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序为：94℃预变性 3 min，
94℃变性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延 30 s，40 个循
环；72℃后延伸 10 min；-20℃保存。
3.6琼脂糖凝胶电泳分析
配制 1.5%的琼脂糖凝胶，调整电泳仪至 80 V电
980
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
泳约 30 min，置于凝胶成像分析系统观察结果。
作者贡献
黎颖为本研究提供了整体的研究框架和思路；
通讯作者巫坚进行具体的实验工作和论文撰写；林
波对论文进行了修改及版式设计；曾庆坤进行了实
验设计。
致谢
本研究由广西科技基础条件平台建设项目计划
(12-112-01C)和广西壮族在自治区重大专项计划项
目(桂科重 1222003-2-3)共同资助。
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Molecular Plant Breeding (online, ISSN 1923-8266) is an open access and peer reviewed jour-
nal. It publishes original research papers involving in the transgenic breeding and marker as-
sisted breeding in plants, particular in the areas of transgene, molecular genetics, crop QTL
analysis, germplasm genetic diversity, and advanced breeding technologies. The primary crite-
ria for publication are the interestings that need not only to meet specific interesting of plant
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