全 文 ：福建林学院学报　2008, 28(2):156-159 第 28卷 第 2期
JournalofFujianColegeofForestry 2008年 4月
收稿日期:2007-11-13　　修回日期:2008-03-10
基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(BK2004139)。
作者简介:徐进(1965-),女 ,安徽黄山人 ,副教授 ,从事分子细胞遗传学研究。
鹅掌楸属植物总 RNA提取方法的比较与分析
徐　进 , 李　帅 , 施季森
(南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 ,江苏 南京 210037)
摘要:以中国鹅掌楸 、北美鹅掌楸 、杂种鹅掌楸的幼芽为材料 , 利用 Trizol、CTAB、SDS和异硫氰酸胍法提取鹅掌楸植物总
RNA,结果表明 , (1)用 Trizol法提取的中国鹅掌楸 、北美鹅掌楸 、杂种鹅掌楸的 RNA具有 28S、18S、5SrRNA3条较清晰的
条带 , 很少有降解 , 其完整性很好;(2)用 Trizol法获得的 3种鹅掌楸 RNAD260/280值为 1.724-1.801, D260/230值为 2.154-
2.341, 说明其纯度也很好;(3)比较 4种方法对提取鹅掌楸植物总 RNA的得率发现 , 用 Trizol法提取的 RNA得率为 219.2
-256.7 μg· g-1 ,是其它 2种方法的 1-9倍。因此 , Trizol法可获得较高质量与产量的鹅掌楸植物总 RNA,可满足下一步
的研究。
关键词:鹅掌楸;RNA提取;幼芽
中图分类号:Q781;S792.21 文献标识码:A 文章编号:1001-389X(2008)02-0156-04
ComparisonandanalysisofthemethodsofRNAisolationforLiriodendrongenus
XUJin, LIShuai, SHIJi-sen
(KeyLaboratoryofForestGeneticsandBiotechnologyofMinistryofEducation,
NanjingForestryUniversity, Nanjing, Jiangsu210037, China)
Abstract:TotalRNAwasisolatedfromtheplumulesofLiriodendronchinense, L.tulipiferaandtheirhybrids(L.chinense×
L.tulipifera)withthemethodsofTrizol, CTAB, SDSandguanidiniumisothiocyanate.Theresultswereasfollows:(1)Thetotal
RNAisolatedfromallexperimentalmaterialsbythemethodofTrizolhadthreeclearbands-28SrRNA, 18SrRNA, 5SrRNA.In
addition, thetotalRNAwasundegradedandhighly-complete.(2)TheD260/280 absorbanceratioofalRNAfromexperimental
materialsbythemethodofTrizolrangedfrom1.724to1.801.AndtheirvalueofD260/230 rangedfrom2.159 to2.341.Theresults
demonstratedtheRNAwashighlypure.(3)ComparingtheyieldsofRNAisolatedbythefourmethods, RNAobtainedbythe
methodofTrizolhadhighestproductivity219.2-256.2μg· g-1.Thiswasbetweenoneandninetimesasmuchastheothertwo
methods.So, theRNAobtainedbythemethodofTrizolwasofhighquality, highyields, andsuitableforalldownstreamapplications.
Keywords:Liriodendron;RNAIsolation;plumule
鹅掌楸属(Liriodendron)为木兰科中的一属 ,仅有 2种 ,一种为中国鹅掌楸(Liriodendronchinense),俗
称中国马褂木 ,分布在我国长江以南的广大山区 ,另一种为北美鹅掌楸(L.tulipifera),分布在北美东部和
东南部 [ 1] 。鹅掌楸属种间杂交有很强的可配性 ,杂种具有显著的生长优势和良好的适应能力 ,杂种鹅掌楸
在生长 、抗性及观赏等方面都表现出强劲的杂种优势 ,是优良园林绿化树种和工业用材树种 [ 2] 。
植物类特别是树木与其它生物(动物 ,微生物)在生物结构和化学组成方面有很大的不同 ,树木含有
大量的次生代谢物 ,如单宁 、萜烯 、色素 、酚 、醌等 ,以及蛋白质和多糖等有机大分子 ,这些生物大分子极大
地影响 RNA提取的产量和质量 ,对于 RNA的反转录 ,体外酶切 ,以及后续的其他分子生物学实验都有很
大的影响。本试验比较了以鹅掌楸为材料的不同 RNA的提取方法对 RNA产物和质量的影响 ,因为提取
高质量的总 RNA是从分子遗传角度分析杂种优势基因的表达与调控的基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
中国鹅掌楸 、北美鹅掌楸 、杂种鹅掌楸的幼芽均采自南京林业大学实习林场 。
1.2　方法
1.2.1　Trizol法　(1)取 0.1g样品用液氮研磨 ,磨成淡黄色粉末后转入盛有 1 mLTrizol的 1.5 mL离心管
DOI :10.13324/j.cnki.j fcf.2008.02.013
中 ,振荡混匀 ,室温放置 5min左右 , 4℃, 12 000 r· min-1离心 10 min;(2)取上清 ,用(原 Trizol试剂 1/5)
酸性酚和氯仿的等体积混合物抽提 ,混匀后 , 4 ℃, 12 000 r· min-1离心 10 min;(3)将上清液转入新的
1.5 mL离心管中 ,加入异丙醇(原 Trizol试剂 1/2),混匀 ,室温放置 15-30 min, 4 ℃, 12 000r· min-1离心
10 min,得白色沉淀;(4)加入体积分数为 75%乙醇(Trizol试剂等体积)漂洗 , 4 ℃, 7 500 r· min-1离心
5 min,在超净工作台无 RNase环境中干燥;(5)加入适量 DEPC水 ,充分溶解沉淀 。
1.2.2　CTAB法　参照文献 [ 3]方法 ,具体操作如下:(1)样品用液氮研磨成粉末 ,加入至已 65 ℃预热的
CTAB提取缓冲液中(每 1 mL中加入 20 μL巯基乙醇), 涡旋振荡 30-60 s后 ,于 65 ℃水浴中继续振荡
约 15 min;(2)取上清于新的离心管中 ,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)提取 2次 ,旋涡混匀 , 18 ℃或室
温 , 12 000r·min-1离心 10min;(3)取上清 ,加 1/4体积的 8 mol·L-1 LiCl,上下颠倒混匀 , 4℃沉淀过夜;
(4)4 ℃, 12 000 r·min-1离心 20 min,收集沉淀 ,用 500μLSSTE溶解沉淀 ,洗去 DNA及其他杂质;(5)加
入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提;(6)取上清加入 2倍体积无水乙醇 , -20 ℃放置 2h或 -70 ℃放置
30 min;(7)4 ℃, 10 000r· min-1离心 20 min,得沉淀用体积分数为 75%乙醇洗涤 ,将沉淀干燥;(8)加入
适量 DEPC水 ,充分溶解沉淀。
1.2.3　SDS法　参照文献 [ 4]方法 ,具体操作如下:(1)液氮研磨适量样品 ,加入至装有提取液 [ 6mLTris-
HCl(pH9.0)和 150μLβ-巯基乙醇 ]的离心管中旋涡混匀 ,室温静置 15min;(2)加入 250 μL20%SDS裂
解液 ,轻轻混匀 ,室温静置 5 min, 12 000 r· min-1离心 10 min;(3)取上清 ,加入 1/3体积的 8 mol· L-1
LiCl,上下颠倒混匀后 ,于 4 ℃冰浴 2-3 h;(4)4℃, 15 000 r·min-1离心 20 min,去上清;(5)用 500 μL
SSTE溶解沉淀 ,再加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)旋涡混匀 , 12 000r·min-1离心 10 min;(6)取上清至新的
1.5 mL离心管中 ,加入等体积的氯仿旋涡混匀 , 12 000 r· min-1离心 10 min;(7)取上清 ,加入等体积异丙
醇 , -20℃放置 30min;(8)同 CTAB法(7)-(8)。
1.2.4　异硫氰酸胍法　参照文献 [ 5]方法 ,具体操作如下:(1)液氮研磨适量样品 ,加入至装有 RNA提取
液(4 mL的 4mol· L-1异硫氰酸胍和 150μLβ-巯基乙醇)中旋涡混匀 ,室温静置 10 min;(2)用等体积的
酚∶氯仿(1∶1)抽提 2次 ,每次于 4 ℃, 12 000 r· min-1离心 10 min;(3)用等体积氯仿抽提 1次 , 4 ℃,
12 000 r·min-1离心 10min,取上清 , (3)加入 2倍体积无水乙醇 , -20 ℃放置 30 min,沉淀 RNA4 ℃,
12 000 r·min-1离心 10min,收集沉淀并用 75%乙醇洗涤;(4)用 500 μL无 RNase水溶解沉淀 ,加入等体
积的氯仿旋涡混匀 , 12 000 r· min-1离心 10 min;(5)取上清 ,加入 1 /10体积的 4mol· L-1LiCl和 2倍体
积的无水乙醇 , -20 ℃放置 30 min;(6)同 CTAB法(7)-(8)。
1.3　RNA完整性分析
取 1-2 uL上述 4种方法得到的 RNA,用 1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.4　RNA纯度检测
用紫外分光光度计测量 RNA样品的 D260 /D280 、D260、D280和浓度 。
2　结果与分析
2.1　不同提取方法对 RNA完整性的比较
分别采用 Trizol、CTAB、SDS和异硫氰酸胍法等 4种植物组织常使用的总 RNA提取方法来提取杂种
鹅掌楸及其亲本的总 RNA,对总 RNA的完整性用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测 ,结果见图 1。
由图 1可见 ,用 Trizol法所提取的鹅掌楸属植物总 RNA有 3条清晰的条带(28S、18S、5.8SrRNA),可
以看出其中 28SrRNA条带的亮度约为 18SrRNA条带亮度的 2倍。用 CTAB法提取的总 RNA中 ,可以看
到 28S、18SRrna2条带 ,但是 28SrRNA条带的亮度与 18SrRNA条带亮度几乎一致 , 没有呈现出 28S
rRNA条带的亮度为 18SrRNA条带亮度的 2倍的状况 ,而 5.8SrRNA没有检测到 ,但观察到有 DNA大量
的存在 。用 SDS法提取的总 RNA的检测结果与 CTAB法相似 ,没有呈现出 28SrRNA条带的亮度为 18S
rRNA条带亮度的 2倍的状况 ,而且 18SrRNA条带亮度反而更亮些 ,说明用 CTAB、SDS法提取 RNA的完
整性不够 ,效果不佳。而异硫氰酸胍法提取的总 RNA效果不佳 ,得到的样品无清晰条带出现 ,呈小分子弥
散状分布 ,可能已经降解。
157　第 2期 徐进等:鹅掌楸属植物总 RNA提取方法的比较与分析
A:Trizol法 , B:CTAB法 , C:SDS法 , D:异硫氰酸胍法;1、2为北美鹅掌楸 , 3、 4为杂种鹅掌楸 , 5、6为中国鹅掌楸.
图 1　不同提取方法鹅掌楸属植物的总 RNA凝胶电泳
Fig.1　 1% agarosegelelectrophoresisoftotalRNAextractedbythemethodsofTrizol, CTAB, SDSandguanidiniumisothiocyanate
2.2　不同提取方法对 RNA纯度的影响
由于异硫氰酸胍法提取的总 RNA效果不佳 ,得到的样品无清晰条带出现 ,故放弃了对其提取 RNA纯
度的检测。而对其它 3种不同的方法(Trizol、CTAB和 SDS法)提取杂种鹅掌楸及其亲本的总 RNA,用紫
外分光光度计测量 RNA样品 ,分析 3种提取方法提取鹅掌楸植物 RNA的纯度 ,结果见表 1。
表 1　不同提取鹅掌楸属植物方法的结果比较
Table1　ComparisonofRNAisolationfromLiriodendronbydiferentmethods
方法 材料 D260/230 D260/280 浓度 /(μg· μL-1) 得率 /(μg· g-1)
Trizol法 北美鹅掌楸 2.159 1.726 1.284 256.7
杂种鹅掌楸 2.068 1.766 1.096 219.2
中国鹅掌楸 2.341 1.801 1.103 220.6
CTAB法 北美鹅掌楸 1.912 1.748 0.740 148.0
杂种鹅掌楸 2.111 1.816 0.637 127.4
中国鹅掌楸 1.923 1.754 0.758 151.6
SDS法 北美鹅掌楸 1.633 1.924 0.144 28.8
杂种鹅掌楸 1.621 1.826 0.341 68.2
中国鹅掌楸 1.811 1.902 0.202 40.4
　　用紫外分光光度计分别测量 Trizol、CTAB和 SDS法提取鹅掌楸属植物及其杂种总 RNA的 D260 /230 ,
D260/280值 ,这 3种提取方法的 D260 /280值均为 1.726-1.924,说明 RNA纯度较高 ,几乎无蛋白质污染;D260/230
值为 1.621-2.341,说明此 3种方法提取的 RNA几乎没有多糖和酚类的污染。
2.3　不同提取方法对 RNA得率的比较
由表 1可以看出 ,用 Trizol法提取鹅掌楸植物的 RNA的浓度和得率明显要比其它 2种方法高。如北
美鹅掌楸得率为 256.7 μg· g-1 ,杂种鹅掌楸为 219.2 μg· g-1 ,中国鹅掌楸为 220.6 μg· g-1 ,分别比
CTAB法提取的总 RNA高出约 1倍左右 ,比 SDS法提取的总 RNA要高出 3-9倍 。因此 ,用 Trizol法提取
鹅掌楸植物 RNA的产量是这 3种方法中最高的 。而 SDS法提取的鹅掌楸植物总 RNA产量最低 。
3　结论与讨论
(1)用 Trizol、CTAB、SDS和异硫氰酸胍法提取的北美鹅掌楸 、杂种鹅掌楸及中国鹅掌楸总 RNA均是
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Trizol法提取的完整性最好 ,异硫氰酸胍法提取的最差 ,基本无清晰条带出现 ,呈弥散状态。
从提取总 RNA的纯度来看 , 4种提取法 D260 /280值为 1.726-1.924,符合一定的 RNA纯度标准 。而从
提取总 RNA的产量来看 ,用 Trizol法所获的总 RNA产量都比较高 ,达到 200 μg·g-1以上 ,而 CTAB、SDS
法在北美鹅掌楸 、杂种鹅掌楸及中国鹅掌楸中相对较低 。
(2)通过数次反复实验后 ,发现异硫氰酸胍一步快速提取法并不适合于鹅掌楸幼芽 RNA的提取 。可
能由于鹅掌楸幼芽中多糖含量较高 ,而该法不能有效地将其去除 [ 6] 。而多糖的理化性质与 RNA很相似 ,
在去除多糖的同时 RNA也随之被带走 ,造成 RNA产量降低 。而在沉淀 RNA时 ,多糖也随之沉淀 ,这样很
难将二者分离 ,从而造成一定量 RNA的降解和丢失 ,且含有多糖的 RNA沉淀难溶于水 ,或溶解后的溶液
很粘稠 ,而且多糖会抑制许多酶的活性。
(3)Trizol、SDS和 CTAB法虽然都可以用于鹅掌楸植物总 RNA的提取 ,但总 RNA的质量和产量上有
很大的差异 。CTAB法最初用于木本植物 DNA的提取 ,该方法是在异丙醇沉淀总核酸后 ,采用氯化锂
(10mol· L-1)和无水乙醇(过夜)的多级沉淀 ,取出大量的 DNA而分离出完整的 RNA。SDS法加入了蛋
白质的强烈变性剂 ,使样品的蛋白质变性凝集 ,用酚∶氯仿(1∶1)抽提 ,除去蛋白成分。此方法在提取的过
程中也采用了氯化锂沉淀方法 。但是它们与 Trizol法比较 ,实验的操作时间过长 ,而且体积分数为 70%乙
醇洗涤不能完全去除痕量的 Li+残留 ,这对以后的反转录反应会有直接的影响。此外 ,不能排除 RNA中
有痕量的 DNA残留 ,根据杨传平等[ 7]研究 ,即使有 1ng级的 DNA,也会严重影响 RT-PCR和差别显示的实
验结果 。因此 ,该方法提取的 RNA在进行上述实验时需经过 DNA酶消化或分离 mRNA,这不仅增加了实
验的步骤 ,也增加了 RNA被污染的机会。
图 2　Trizol法提取总 RNA不同抽提次数的比较
Fig.2　ComparisonoftheextractiontimestototalRNAbyTrizol
　　Trizol提取试剂由酚与异硫氰酸胍组成 。可用于多
种生物(人类 、动物 、植物 、细菌等)总 RNA、DNA或蛋白
质的提取 ,而且快速简捷 、所需试剂种类少 、适于小样品
提取。但在本研究中发现 Trizol一次法并不能非常完整
有效地去除细胞中的蛋白质 ,所以在第 1次沉淀溶解
后 ,再用氯仿重新抽提 1次就可以获得非常纯净的
RNA。但是抽提次数不能太多 ,否则 RNA丢失的现象
会非常严重(图 2)。
因此 ,对 Trizol法提取鹅掌楸植物的总 RNA时 ,在
异丙醇沉淀后 ,用 DEPE水溶解 ,再用酚∶氯仿(1∶1)抽
提 1-2次 ,加大对蛋白质的去除力度 。另从提取 RNA的产量方面来看 , Trizol法提取的鹅掌楸植物的总
RNA的得率达到 219.2-256.7 μg· g-1 ,是其它 2种(SDS、CTAB)方法得率的 3-9倍。
综上所述 , TRIZOL为鹅掌楸属植物总 RNA提取的首选方法 ,该方法对于鹅掌楸属植物总 RNA的提
取不但高效 、经济而且省时省力 。
参考文献
[ 1] 吴征镒.中国种子植物属的分布区类型 [ J] .云南植物研究 , 1991(增刊):1-6.
[ 2] 南京林产工业学院林学系育种组.亚美杂种鹅掌楸的育成 [ J] .林业科技通讯 , 1973(12):10-11.
[ 3] KieferE.HelerW, ErnstD.AsimpleandeficientprotocolforisolationoffunctionalRNAfromtissuerichinsecondary
metabolites[ J] .PlantMolBiolRep, 2000, 18:33-39.
[ 4] ZhouJH, PesacretaTC, BrownRC.RNAisolationwithoutgelformationfromoligosacchariderichonionepidermis[ J] .
PlantMolBiolRep, 1999, 17:397-407.
[ 5] ChomczynskipP, SacchinN.Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction
[ J] .AnalytBiochem, 1987, 162(1):156-159.
[ 6] 胡国斌 , 梅兴国 ,刘怡.改良异硫氰酸胍一步法细胞提取红豆杉 RNA[ J] .生物技术 , 2001, 11(5):31-33.
[ 7] 杨传平 , 姜静 ,那冬辰 , 等.白桦花芽 RNA的快速提取 [ J] .东北林业大学学报 , 2002, 30(3):1-4.
(责任编辑:江　英)　　
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