全 文 ：第 45 卷第 2 期 郑 州 大 学 学 报( 理 学 版) Vol. 45 No. 2
2013 年 6 月 J． Zhengzhou Univ．(Nat． Sci． Ed．) Jun. 2013
收稿日期:2012-10-06
基金项目:国家科技基础条件平台建设子项目，编号 2005DK21006;兵团国际科技合作项目，编号 2010YD37;兵团科技攻关计划项目，编
号 2011AB015;塔里木大学校长基金硕士项目，编号 TDZKSS07001．
作者简介:张玲(1977 －) ，女，讲师，硕士，主要从事植物分子生物学研究，E-mail:zhlzky010@ 163． com;通讯作者:李志军(1963 －) ，女，教
授，博士，主要从事植物学研究，E-mail:lizhijun0202@ 126． com．
不同保存条件下白刺属植物基因组 DNA的提取
张 玲1，2， 王旭哲3， 李先勇1， 李志军1，2， 舒尊哲1，4，5
(1．新疆生产建设兵团 塔里木盆地 生物资源保护与利用重点实验室 新疆 阿拉尔 843300;
2．塔里木大学 植物科学学院 新疆 阿拉尔 843300;3．塔里木大学 动物科学学院 新疆 阿拉尔 843300;
4．塔里木大学 生命科学学院 新疆 阿拉尔 843300;5．郑州大学 化学与分子工程学院 河南 郑州 450001)
摘要:以硅胶干燥的白刺叶片为材料，分别在 － 84 ℃、－ 20 ℃冰箱保存和常温保存，对三种不同保存条件下的白刺
叶片进行 DNA的提取，结果表明，在 － 84 ℃和 － 20 ℃冰箱里保存 1 ～ 2 年的材料均可采用 3 × CTAB法有效去除多
糖、酚及蛋白质，可获得高质量基因组 DNA，而常温保存半年的材料无法获得 DNA．通过进行 ISSR-PCR实验，提取
的 DNA扩增均可得到稳定、清晰、多态性好的 PCR扩增图谱，－ 84 ℃保存的材料所得到的 DNA在 ISSR-PCR扩增
中条带数目和清晰度明显优于 － 20 ℃保存的材料．
关键词:白刺属;保存方法;DNA提取
中图分类号:Q 943 文献标志码:A 文章编号:1671 － 6841(2013)02 － 0099 － 05
DOI:10． 3969 / j． issn /1671 － 6841． 2013． 02． 022
0 引言
白刺属(Nitraria L．)植物主要分布于西北干旱、半干旱地区，是荒漠地区生态系统植物群落的重要建群
种或优势种之一，该属植物具有耐旱、耐盐碱、抗风蚀、耐沙埋等特点［1］，是西北地区典型的优抗植物，在维
持生态平衡上发挥着重要的作用．新疆是典型的荒漠地区，也是白刺属植物的主要现代分布中心和分化中
心［2］．在天山以南分布有五种白刺［3］，在生态坏境的维持和稳定方面起到了重要作用．白刺一直是研究者们
比较青睐的研究对象，近几年在形态解剖学［4 － 5］、系统发育［6］、抗性研究［7 － 9］、生态学［10 － 11］、分子系统分类和
标记方面均有所发展［12 － 14］．
基因组 DNA的提取是一个常规的实验，也是分子实验非常重要的前提和基础．得到高质量的 DNA是后
续分子实验能顺利进行和实验结果可靠性保证的必要条件． CTAB 法是最常用的植物基因组 DNA 提取方法
之一，Murray等［15］用 CTAB法去除多糖，从植物中快速提取了 DNA． Doyle在 1987 年建立并改进植物总 DNA
的 CTAB法，经多次实验改进后形成了现在较为普遍的、简洁的方法．由于细胞结构或细胞内含有大量的次
生代谢产物，使得难以提取到高质量的 DNA，尤其是环境恶劣条件下生长的干旱区、荒漠植物等．提取植物
基因组 DNA最主要的就是要去除多糖、酚以及蛋白质，这是影响 DNA 得率和质量的重要影响因素，也是分
子实验能否顺利进行的关键因子之一．
为了克服多酚、多糖等次生物质对 DNA纯度的干扰，提高 DNA 的得率和质量，作者对新疆天山以南五
种白刺属植物的 DNA进行了提取．针对硅胶干燥后不同保存条件下白刺属植物叶片材料，探讨和确定白刺
属植物保存时间长短对基因组 DNA提取的影响，并建立合适的提取方法，使 DNA适用于 PCR扩增、其他分
子生物学研究和遗传学分析，为白刺属植物的后续研究奠定基础．
郑 州 大 学 学 报 ( 理 学 版 ) 第 45 卷
1 实验部分
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料 2008 年、2009 年分别在 5 ～ 6 月间采集白刺属植物的幼嫩叶片，用硅胶干燥后保存至
－ 84 ℃冰箱中;2009 年的部分样品用硅胶干燥后，常温保存和 － 20 ℃冰箱中保存．
1． 1． 2 仪器及试剂 冷冻高速离心机、灭菌锅、摇床、PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、冰箱、制冰机等． CTAB
提取缓冲液的配制:3%或 4%CTAB，0． 1 mol /L Tris-HCl(pH 8． 0) ，0． 25 mol /L EDTA(pH 8． 0) ，1． 2 mol /L
NaCl，3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)． ISSR引物由西安沃尔森生物技术有限公司合成，Taq 酶(2 U /mol)、500 bp
DNA Ladder Marker购自 BBI技术有限公司．
1． 2 基因组 DNA的提取方法
改良 CTAB法:根据文献［15］方法，先加入 PVP和抗坏血酸、石英砂，然后加液氮进行多次研磨，使材料
成细粉状，立即装入 2． 0 mL离心管．用丙酮或 STE清洗材料 3 遍，弃上清液．加入 700 μL 2 × CTAB 提取液
(0． 1 mol /L Tris-HCl、0． 05 mol /L EDTA、2% PVP，2% β-巯基乙醇，2% CTAB) ，然后将离心管置于 65 ℃温
育，每 10 min进行颠倒混匀．取出离心管冷却至室温，以 8 000 r /min 离心 10 min 后，弃上清液，加入等体积
的氯仿 －异戊醇(体积比 24∶ 1) ，充分混匀 20 min，抽提 2 ～ 3 次，加入 2 mL －20 ℃预冷的异丙醇，温和混匀，
静置沉淀 1 ～ 2 h后以 12 000 r /min离心10 min，弃异丙醇，用 70%乙醇及无水乙醇洗涤沉淀 2 ～ 3 次，风干后
溶解于 TE中，待 DNA完全溶解后，－ 20 ℃下保存备用．
3 × CTAB法:样品置冰冷研钵中，先加入 PVP 和抗坏血酸、石英砂，然后加液氮进行多次研磨，使材料
成细粉状，立即装入 2． 0 mL离心管．加入 900 μL无 CTAB缓冲液及 50 μL β-巯基乙醇，65 ℃放置 15 min，使
材料和缓冲液充分混匀，可用牙签搅拌均匀，其间不断摇动． 取出放置室温后，以 8 000 r /min 4 ℃离心
10 min，弃上清液．重复 2 次，直至上清液不再黏稠． 加入 3 × CTAB 缓冲液 750 μL，温和混匀，65 ℃放置
45 min．加入氯仿 －异戊醇(体积比 24∶ 1)750 μL，温和颠倒混匀 15 min，4 ℃下以 12 000 r /min离心 10 min，
转移上清液至离心管中，重复抽提 2 次，如果加 3 × CTAB缓冲液后比较黏稠，可先用等体积的酚 －氯仿 －异
戊醇(体积比 25∶ 24∶ 1)抽提一次，再用氯仿 －异戊醇(体积比 24∶ 1)抽提两次．吸取上清液，加入 1 /2 体积的
5 mol /L NaCl溶液，混合均匀，再加入 2 /3 体积 － 20 ℃预冷的异丙醇，缓慢混匀后静置 1 ～ 4 h，4 ℃下以
12 000 r /min离心10 min，弃上清液．用 70%乙醇洗涤沉淀 2 次，4 ℃下以 12 000 r /min离心 5 min，弃上清液．
室温下 DNA沉淀干燥后加入 1 × TE 50 μL，待 DNA完全溶解后在 － 20 ℃下保存备用．
1． 3 DNA的检测方法
采用琼脂糖凝胶电泳法检测所得 DNA的质量，同时进行 ISSR-PCR 扩增反应进一步检测所得 DNA的质
量．
电泳检测:取 3 μL总 DNA与 5 μL 6 × loading buffer混匀，用 0． 8%的琼脂糖凝胶(含 0． 5 μg /mL EB)电
泳检测，而后用美国 BIO-RAD 公司生产的 Gel Doc 2000 凝胶成像系统检测和照相．电泳缓冲液使用 0． 5 ×
TBE溶液，电压 5 V /cm．
DNA的 ISSR-PCR扩增:建立了 ISSR分子标记的最佳反应体系，即在 25 μL反应体系中，含稀释浓度为
20 ～ 35 倍的 DNA模板、0． 15 mmol /L dNTPs、0． 3 μmol /L 引物、25 mmol /L Mg2 +和 1． 0 U Taq 酶． PCR 反应
条件为 95 ℃，预变性 90 s，94 ℃变性 40 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 90 s，循环 37 次，然后 72 ℃延伸30 min，
4 ℃保存．
2 结果与分析
2． 1 DNA 提取方法的选择
采用普通改良 CTAB法提取白刺属植物的基因组 DNA非常困难，杂质很多甚至不能获得 DNA．采用无
CTAB缓冲液清洗材料可以去除大量的杂质，明显优于普通 STE 或丙酮．采用 STE 或丙酮清洗材料 3 遍，上
清液仍然黏稠而浑浊，但是用无 CTAB 缓冲液清洗材料，3 遍之后基本不黏稠而且清澈． 3 × CTAB 和 4 ×
001
第 2 期 张 玲，等:不同保存条件下白刺属植物基因组 DNA的提取
CTAB法均可以充分地裂解细胞以提高 DNA的获得率，但 4 × CTAB法并没有明显优于 3 × CTAB法，从经济
角度考虑，本实验采用 3 × CTAB细胞裂解液．
2． 2 不同保存条件对基因组 DNA提取的影响
采用 3 × CTAB法制备的 DNA样液的电泳检测结果见图 1．由图可见，2008 年和 2009 年采集的材料，硅
胶干燥后 － 84 ℃保存的叶片提取的 DNA 条带明亮整齐，电泳条带宽而密度高，量多说明提取的 DNA 片段
完整无断裂;并且都无拖尾及瀑布现象出现，说明提取的 DNA中酚类等次生物质去除得较为干净．但是部分
点样孔较亮，证明蛋白并没有去除干净． 2009 年采集并在 － 20 ℃条件下保存的叶片提取的量相对较小，但条
带整齐明亮，点样孔干净而无杂质． 2009 年采集并在常温保存的叶片没有获得 DNA，证明常温保存的材料不
适合进行 DNA提取．
图 2 是 2008 年和 2009 年采集的白刺叶片保存于 － 84℃条件下，采用 3 × CTAB 法提取的 DNA 电泳图
谱．可以看出，DNA均无拖尾或降解的现象，证明此法适合白刺属植物基因组 DNA 的提取，但是点样孔内有
杂质．
2． 3 ISSR-PCR反应
不同保存条件下的白刺材料提取的基因组 DNA 进行 ISSR 的 PCR 扩增，虽然都可以获得扩增条带，但
是在 － 84 ℃保存条件下提取的 DNA扩增后条带清晰且数量多，而 － 20 ℃保存的条带少且特别模糊(图 3)．
材料保存在 － 84 ℃用 3 × CTAB法提取的 DNA质量能满足 PCR 扩增，扩增产物有较清晰条带，且条带
数目较多，可用于其他分子生物学研究．从图 4 可以看出，提取的白刺基因组 DNA质量完全可以满足分子标
记的要求．
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郑 州 大 学 学 报 ( 理 学 版 ) 第 45 卷
3 讨论
3． 1 提取 DNA方法的影响
CTAB是一种强去污剂，已被广泛应用于植物基因组 DNA的提取．实验中为了抑制多酚类物质的氧化，
加入了 β-巯基乙醇、PVP、抗坏血酸，有效地避免了多酚的氧化．白刺材料主要采自天山以南的干旱区，具有
较强的抗性，这与白刺具有较厚的角质层和植物组织中含有丰富的多糖、酚类物质有密切关系．研磨时要加
入 PVP、石英砂以及抗坏血酸，保证材料在液氮条件下得到充分研磨而避免氧化．在提取方法上，最初用普通
CTAB法，上清液十分黏稠，使裂解液无法起到裂解细胞的作用，无论氯仿 －异戊醇(体积比 24∶ 1)抽提液还
是再加上酚 －氯仿 －异戊醇(体积比 25∶ 24∶ 1)抽提液交替抽提都无法去除杂质．用丙酮或 STE来清洗材料，
也无法解决上清液黏稠的问题．因此，参照文献［12］，在实验中首先使用无 CTAB缓冲液清洗材料并在 65 ℃
水浴，使叶中蛋白质变性沉淀，还可除去植物组织中的大多数多糖． DNA及多糖在不同的盐浓度下选择性地
生成沉淀，多糖溶于 1． 4 mmol /L 以下的 NaCl 溶液，而 DNA 不溶于此浓度的 NaCl 溶液中，而溶于高浓度
(17 mmol /L以上)的 NaCl溶液． PVP是一种与多酚结合形成不溶复合物的聚合物，同时通过离心有助于多
酚的去除．另外，实验中没有加入 RNase去除 RNA，也没有进行 DNA浓缩和纯化等步骤，但已经提取到了完
整性较好、浓度较高的 DNA．提取植物基因组 DNA，其纯度是影响 PCR 反应的限制因素之一［16 － 17］．本方法
提取的白刺基因组 DNA完全可用于做 ISSR-PCR，证明质量是有保证的．
3． 2 不同保存条件对提取 DNA质量与得率的影响
在不同保存条件下，白刺植物叶片抽提得到的 DNA 质量和得率不同，保存在 － 84 ℃条件下的材料，提
取 DNA的质量和得率都比较高．植物叶片保存的年限(用硅胶干燥的材料)直接影响植物总 DNA的得率，
保存一年内的材料均能获得较高得率的 DNA． 保存的材料一般不要超过二年为佳，最好的方法是保存总
DNA．采集材料后应尽快干燥，若短期内就进行提取工作，可以存放在 － 20 ℃冰箱中，但要长期存放一定要
放在 － 70 ℃以下的冰箱中，避免高温和挤压等因素的影响而导致材料褐化．同时也发现即使硅胶干燥过的
材料也不要在空气中暴露较长时间，否则提取到的 DNA会明显降解．作者的实验结果是在尽量使得各因素
影响最小的情况下取得的，因此，要获得高产率、高质量的 DNA，除了方法上的选择外，还需要技术上的严格
以及操作上的熟练和严谨．
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Effects of Different Storage Conditions on Total DNA
Extraction from Nitraria L．
ZHANG Ling1，2， WANG Xu-zhe3， LI Xian-yong1， LI Zhi-jun1，2， SHU Zun-zhe1，4，5
(1． Key Laboratory of Biological Resource Protection and Utilization，Tarim Basin，Xinjiang Production ＆
Construction Group，Alar 843300，China;2． College of Plant Science，Tarim University，Alar 843300，China;
3． College of Animal Science，Tarim University，Alar 843300，China;4． College of Life Science，Tarim University，
Alar 843300，China;5． College of Chemistry and Molecular Engineering，Zhengzhou University，
Zhengzhou 450001，China)
Abstract:The effects of total DNA extraction from Nitraria leaves dried with silica gel were studied under
three different conditions for storing samples (normal temperature and frozen at － 20 ℃ and － 84 ℃)
with improved 3 × CTAB method． It was suggested that the genomic DNA with high purity could be ob-
tained after being frozen at － 20 ℃ or － 84 ℃ for one or two years． The polysaccharide，phenol and pro-
tein could be removed effectively． However the leaves at usual temperature could not provide the genomic
DNA． Further results also showed that the leaf stored at － 84 ℃ was more suitable than the leaf stored at
－ 20 ℃ for generating good ISSR-PCR banding patterns．
Key words:Nitraria L．;preserved method;DNA extraction
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