全 文 ：HPLC 法对 5种红豆杉属植物中
紫杉烷类化合物成分的分析
陈立国 1 , 刘程惠2 , 何克江1 , 朱靖博1
(1.大连轻工业学院生物与食品工程学院 , 大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院 , 大连 116600)
摘　要:采用快速真空液相层析法(VLC)富集红豆杉属植物中 5种主要紫杉烷
类化合物 , 回收率在 95%以上 。5种红豆杉植物中紫杉烷类化合物含量测定结
果显示:加拿大红豆杉(树皮)中 10-DABⅢ和 9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ含量较
高;东北红豆杉(树皮)中 7-木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量较高;而紫杉醇含量
在东北红豆杉(树皮)中最高 , 曼地亚(枝叶 , 搁置一年)次之;本文首次发现矮
紫杉中含有 4种紫杉烷类化合物 。
关键词:高效液相色谱;快速真空液相层析;红豆杉属植物;紫杉烷类化合物
　　在天然抗癌药物中最令人瞩目的则是 20世纪
90年代开发的紫杉醇(Taxaceae , 商品名 Paclitax-
el)[ 1] , 它是 20世纪 70年代初是由Wani从太平洋
紫杉(Taxus brevifolia)树皮中分离得到的结构新颖
的二萜类化合物[ 2] 。紫杉醇作为唯一促进癌细胞
中微管聚合的抗肿瘤药物 , 是临床中最有效的抗
癌剂之一[ 3] 。目前世界上大部分药用紫杉醇都提
取于红豆杉科植物 , 红豆杉科(Taxaceae)共有 5属
23种植物 , 除澳洲红豆杉属的 Austro taxus spicata
Campton产于南球外 , 其余均产于北半球[ 4] 。
红豆杉属植物中的紫杉烷类化合物含量非常
低 , 同时红豆杉原料浸提液中含有大量的强极性
化合物 、色素和油脂类[ 5] 等 , 如果直接使用 HPLC
分析 , 不仅在定量上有很大误差 , 还会使柱后压
力增高 , 严重影响色谱柱的使用寿命 。因此 , 在测
定前必须进行样品的预处理 , 常规的预处理方法
是液-液和固相萃取法。液-液萃取法较复杂 、回收
率低;固相萃取主要有 C18柱[ 6 , 7] 、氧化铝柱[ 8] 和
硅胶柱[ 9] , C18柱虽然可多次利用但价格昂贵 , 氧
化铝柱的回收率较难确定不适合植物成分分析 ,
硅胶柱价格低廉 、易于操作 。
我国紫杉醇的工业生产多数是以东北红豆杉
和云南红豆杉作为原料 , 提取完目标产物后很少
再次利用 , 红豆杉中其它紫杉烷类化合物同样具
有很高的药用价值和作为半合成紫杉醇的主要原
料 , 如 9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ、 10-DAB Ⅲ 、三
尖杉宁碱 、7-木糖紫杉醇等 , 有效综合利用红豆杉
属植物是解决植物资源匮乏的最好途径。
1　材料与方法
1.1　试剂和仪器
试剂:乙腈 、甲醇;浓 H2SO4;CHCl3 ;200 ～
300目硅胶。
原材料:东北红豆杉(树皮 , 朝鲜);加拿大红
豆杉(树皮 , 加拿大);曼地亚(枝叶 , 中国浙江);
矮紫杉(枝叶 , 中国大连);中国红豆杉(枝叶 , 中
国云南)。
标准品:10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-dacetylbac-
catinⅢ 10-DAB Ⅲ);9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ
(9-hydroxyl-13-acctylbacctinⅢ);7-木糖紫杉醇(7-xy-
losyltaxol);三尖杉宁碱(Cephalomannine);紫杉醇
(Paclitaxel , Taxol)。均为 Sigma 公司产品 , 纯度在
98%以上。
仪器:高效液相色谱分析仪(DAD230 二极管
阵列检测器 , P230高压恒流泵), 大连依利特分析
仪器有限公司制造;R502B 型旋转薄膜蒸发仪;
SHB-Ⅱ型循环水式多用真空泵;BS223S型电子天平。
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作者简介:陈立国(1980-), 男 , 硕士研究生
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2007.0393
1.2　实验方法
1.2.1　HPLC分析试样的制备　将 5 种红豆杉样
品粉碎成 40 目 , 各取 5 g 在室温用 V(甲醇)∶
V(CHCl3)=1∶1混合液超声浸提 3次 , 每次浸提
30 min;合并浸提液 , 过滤后真空浓缩 , 用少量甲
醇全部溶出 , 与少量硅胶拌匀 、晾干;然后进行
VLC
[ 10] 法富集紫杉烷类化合物 , 操作如下:
在把拌入样品的干硅胶装入玻璃垂熔漏斗中 ,
首先 CHCl3洗脱 3BV , 然后 V(CHCl3)∶V(乙醇)=
8∶2混合液洗脱 3BV;收集第二次洗脱的馏分 , 将
其蒸干加甲醇溶解定溶到 10 mL。
将富集紫杉烷类化合物馏分编号:Ⅰ东北红
豆杉(树皮);Ⅱ加拿大红豆杉(树皮);Ⅲ曼地亚
(枝叶);Ⅳ矮紫杉(枝叶);Ⅴ中国红豆杉(树皮);
Ⅵ中国红豆杉(枝叶)。
1.2.2　色谱分析条件　色谱柱:SinoChrom ODS-
BP 5 μm;紫外检测波长:227 nm;进样量:10 μL;
流速:1.5 mL min;流动相洗脱梯度变化见表 1。
表 1　洗脱梯度变化
梯度变化时间
min
泵 A
(乙腈 %)
泵 B
(超纯水 %)
1 0 30 70
2 15 40 60
3 30 45 55
4 50 70 30
5 60 100 0
6 70 30 70
7 85 30 70
1.2.3　紫杉烷系列化合物定性 、定量分析方法　
根据标准品色谱保留时间对比和添加标准品进行
峰高比较来定性分析;确定紫杉烷系列化合物各
自所对应的峰 , 用外标法来进行定量分析。
1.2.4　VLC 法回收率的测定
(1)任取一种红豆杉超声醇提液经HPLC分析
后测其紫杉醇与 7-木糖紫杉醇含量;在该醇提液
中添加定量的紫杉醇与7-木糖紫杉醇混合标准样 ,
取三等份分别进行VLC , HPLC法测定每份洗脱液
中紫杉醇与 7-木糖紫杉醇含量 。经 VLC 富集前后
的化合物含量比即为回收率。
(2)取同种红豆杉超声醇提液和等体积 0.3
mol L NaOH水溶液混合 , 使所有紫杉烷类化合物
全部水解掉 , 在45 ℃条件下水解3 h , 经酸中和后
用HPLC定量分析 。在中和后的水解液中添加与水
解前相同量的紫杉醇与 7-木糖紫杉醇混合标准样 ,
进行VLC , 此后操作步骤与回收率计算方法与法
一相同。
1.3　各种分析样品溶液的配制
标准品储备液的配制:称取五种标准品 , 用
甲醇定溶至4 mL。各标准品溶液配制的浓度分别
为:0.475 mg mL 的 10-去乙酰基巴卡亭 Ⅲ、 0.9
mg mL的9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ、0.475mg mL
的 7-木糖紫杉醇 、0.45 mg mL的三尖杉宁碱 、 0.8
mg mL的紫杉醇 。
混合标准品溶液的配制:量取 2 mL标准品储
备液 , 稀释 5倍 , 作为混合标准品溶液。
绘制标准曲线溶液的配制:准确量取 5 份体
积为 100μL 的标准品储备液 , 分别稀释 1 倍 、 5
倍 、 10倍 、20倍 、 50倍 。
测定精密度溶液的配制:将配制的混合标准
品溶液在来作为测定精密度溶液 。
测定加样回收率溶液的配制:从 Ⅰ ～ Ⅵ 号富
集液中各量取 0.3 mL , 分别加入 0.1 mL标准品储
备液 。
测定 VLC法回收率溶液的配制:取 0.9 mg 7-
木糖紫杉醇和 0.5 mg 紫杉醇甲醇定溶至 1 mL。
2　结果与分析
2.1　混合标准品溶液 HPLC 分析结果
经HPLC定性分析 , 混合标准品出峰时间先后
顺序为:(1)10-去乙酰基巴卡亭 Ⅲ;(2)9-羟基-
13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ;(3)7-木糖紫杉醇;(4)三尖
杉宁碱;(5)紫杉醇 , 分析谱图如图 1所示 。
图 1　混合标准品溶液色谱图
1-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ;2-9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ;
3-7-木糖紫杉醇;4-三尖杉宁碱;5-紫杉醇
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2.2　VLC 法快速制备分析试样回收率实验结果
方法一测得的各紫杉烷类化合物回收率平均
值为 95.5%, 方法二测得各回收率平均值为
97.1%。5种标准品正相色谱规律表明 , 紫杉醇极
性小先被洗出 , 而 7-木糖紫杉醇极性大最后被洗
出 , 所以计算两者回收率即可代表其它 3种标准
品的回收率。
VLC法快速富集红豆杉分析试样前后谱图变
化如图 2和图 3所示 。两谱图相比较可看出 , 经
VLC法富集的红豆杉试样中紫杉烷类化合物含量
可提高93.6 倍以上 , 高极性物质大部分被除去 ,
提高了HPLC定量分析的准确性 。
图 2　东北红豆杉超生醇提液谱图
1-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ;2-9-羟基-13-乙酰基巴卡亭Ⅲ;
3-7-木糖紫杉醇;4-三尖杉宁碱;5-紫杉醇
图 3　经VLC富集后的东北红豆杉谱图
1-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ;2-9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ;
3-7-木糖紫杉醇;4-三尖杉宁碱;5-紫杉醇
Ⅰ ～ Ⅵ 号样品试样中 5种紫杉烷化合物的定
量分析结果 , 见表 2。加样回收率实验结果 , 见
表 3。
2.3　精密度实验结果
将配制好的测定精密度溶液在上述相同色谱
条件下连续平行进样5次 , 标准偏差小于 3%, 表
明本方法具有很好的重现性 。如表 4所示。
表 2　Ⅰ ～ Ⅶ 号样品中 5种紫杉烷化合物的质量百分含量表(%)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
10-DABⅢ 0.0027 0.0196 0.0173 - 0.00289 -
9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 0.0272 0.0872 0.0034 0.0019 - -
7-木糖紫杉醇 0.0371 0.0014 0.0058 0.0016 0.0149 0.0045
三尖杉宁碱 0.0292 0.0092 0.0029 0.0086 0.0012 0.0070
紫杉醇 0.0275 0.0249 0.0265 0.0088 0.0037 0.0159
注:“-” 未检出;Ⅰ -东北红豆杉(树皮);Ⅱ-加拿大红豆杉(树皮);Ⅲ-曼地亚(枝叶);Ⅳ-矮紫杉(枝叶);Ⅴ-中国
红豆杉(树皮);Ⅵ -中国红豆杉(枝叶)
表 3　Ⅰ ～ Ⅶ 号样品中各组分回收率结果计算表(%)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
10-DABⅢ 97.8 100.9 95.4 - 97.6 -
9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 98.5 105.8 95.9 98.01 - -
7-木糖紫杉醇 103.2 104.2 104.5 108.98 106.5 102.3
三尖杉宁碱 101.5 106.2 105.8 101.4 109.2 100.6
紫杉醇 107.2 101.4 96.7 103.2 101.2 104.2
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表 4　RSD标准偏差计算结果表(%)
10-DABⅢ 9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 7-木糖紫杉醇 三尖杉宁碱 紫杉醇
保留时间 2.43 0.59 0.62 0.7 0.53
峰面积 0.64 4.92 0.09 2.48 1.27
2.4　样品中 5种紫杉烷化合物的标准曲线的绘制
和线性范围
将配制好的绘制标准曲线系列溶液按上述相
同色谱条件下分别进样分析 , 测得 5种紫杉烷化
合物各个色谱峰峰面积(Y)与其对应的浓度值(X)
的回归方程如表 5所示 , 各组分的最佳进样浓度
范围如表 6所示 。
表 5　峰面积(Y)与其对应的浓度值(X)回归方程表
样品 回归方程 R2
10-DABⅢ Y=13354x+15.158 R2=0.9997
9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Y=9114.3x-10.991 R2=0.9994
7-木糖紫杉醇 Y=12859x+2.1106 R2=0.9998
三尖杉宁碱 Y=12140x+3.8906 R2=0.9992
紫杉醇 Y=13481x+18.976 R2=0.9998
表 6　最佳进样浓度范围表
紫杉烷化合物 进样浓度范围 (mg mL)
10-DABⅢ 0.0095～ 0.475
9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 0.018～ 0.9
7-木糖紫杉醇 0.005 ～ 0.475
三尖杉宁碱 0.009～ 0.45
紫杉醇 0.016～ 0.8
2.7　分析与讨论
1.经 VLC法富集的五种红豆杉分析试样可使
紫杉烷类化合物含量提高 93.6倍以上 , 色素和大
量杂质被硅胶吸附 , 在整个试验过程中没有出现
柱压和保留时间不稳等问题 , 且具有回收率高 ,
制备速度快的优点 , 非常适合HPLC分析试样的前
期处理。
2.论文分析的这五种红豆杉植物所含有紫杉
烷类化合物含量各不相同。对紫杉醇来说 , 东北
红豆杉和加拿大红豆杉的含量较高 , 均达到了万
分之二以上 , 是目前主要的利用资源 。10-DAB Ⅲ
是生物转化紫杉醇的重要原料 , 加拿大红豆杉中
该化合物含量较高 , 接近于万分之二 。9-羟基-13-
乙酰基巴卡亭 Ⅲ在加拿大红豆杉中含量很高 , 几
乎是紫杉醇含量的 3倍 , 可见加拿大红豆杉是提
取9-羟基-13-乙酰基巴卡亭 Ⅲ的理想原料。
3.本文分析的矮紫杉(Little Japanese Yew)是
作为中国东北地区的一种观赏性植物 , 属于东北
红豆杉的一个变种 , 论文首次对其枝叶成分进行
分析 。发现具有紫杉烷类化合物的生产价值 , 其
中7-木糖紫杉醇 、紫杉醇和三尖杉宁碱的含量分
别为 0.0016%、 0.0086%、 0.0088%, 如果被广泛
种植对于解决目前紫杉烷类植物原料资源匮乏具
有积极意义。
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