全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 20 食品科学 ※工艺技术26
杨梅叶中总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究
林建原，陶志华，朱钐汕
(浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100)
摘 要：采用用正交试验优化杨梅叶中总黄酮的最佳提取工艺条件。以杨梅叶为原料，在乙醇体积分数 65%、料液比
1:30(g/mL)、提取时间1.5h、提取次数3次条件下，总黄酮提取率为3.34%。测定杨梅叶中总黄酮的体外抗氧化活性活
性，结果表明：杨梅叶总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基均有较强的清除作用，是一种天然有效的抗氧化剂。
关键词：杨梅叶；总黄酮；提取工艺；抗氧化活性
　　　　　　　
Extraction and Antioxidant Activity Evaluation of Total Flavonoids from Bayberry
(Myrica rubra Sieb. et Zucc.) Leaves
LIN Jian-yuan，TAO Zhi-hua，ZHU Shan-shan
(College of Biomedical and Environmental Science, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)
Abstract ：An L9 (34) orthogonal array design was employed to optimize the extraction of total flavonoids from bayberry (Myrica
rubra Sieb. et Zucc.) leaves. The in vitro antioxidant activity of total flavonoids extracted was evaluated by determining their
scavenging capacity against hydroxyl radicals and superoxide anions. The optimum extraction conditions were determined as
follows: 65% aqueous ethanol solution as extraction solvent at a material/liquid ratio of 1:30 (g/mL) for triple repeated extrac-
tions for 1.5 h each time and the extraction rate is 3.34%. Total flavonoids from bayberry leaves could strongly scavenge
hydroxyl and superoxide anion free radicals, thus being a powerful natural antioxidant.
Key words：bayberry leaves；total flavonoids；extraction conditions；antioxidant activity
中图分类号：O657.39 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)20-0026-04
收稿日期：2011-03-14
基金项目：浙江省自然科学基金项目(Y2110865)
作者简介：林建原(1965—)，女，副教授，硕士，研究方向为天然产物的提取及分析。E-mail：linjianyuan@yahoo.com.cn
杨梅叶属杨梅科常绿乔木杨梅(Myrica rubra Sieb. et
Zucc.)的干燥叶片[1]，其中含有的酚类化合物、萜类内
酯和生物碱等具有较强的抑菌杀菌作用，有很高的药用
价值。主要活性成分之一酚类化合物含有的黄酮类化合
物具有清除体内活性氧自由基，防止生物膜脂质被超氧
自由基和羟自由基氧化的功能，具有降血压、抗炎、
抑菌、抗氧化活性等多种功效[ 2-4]。为有效利用杨梅叶
中的黄酮类物质，本实验采用回流提取方法，通过正
交试验确定杨梅叶总黄酮的最佳提取工艺条件[5]，并对
其抗氧化能力进行研究，为杨梅叶的开发利用提供科学
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
杨梅叶：采集于浙江宁波慈溪，60℃烘干，粉碎
后过 80 目筛备用。
芦丁标准样品 中国药集团化学试剂有限公司；石
油醚、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、邻苯
三酚、铁氰化钾、硫酸亚铁、三氯乙酸、碳酸氢钠、
盐酸、三氨基甲烷、磷酸氢二钠、水杨酸、双氧水、
三氯化铁等均为分析纯；实验用水均为双蒸水。
1.2 仪器与设备
BS224型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公
司；HH-2型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；
S53型紫外 -可见分光光度计 上海凌光技术有限公司；
RE252型旋转蒸发仪 上海青浦沪西仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 标准工作曲线的绘制
准确称取干燥至质量恒定的芦丁标准品 20.00mg，
置于 100mL容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，制得质
量浓度 0.2mg/mL的标准品储备液，分别准确吸取 0.00、
0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于 10.00mL具塞试管
中，加入 5% 氯化铝 3mL加甲醇定容，混匀，即得供
试品溶液，同时做试剂为空白，在 270nm波长处测定
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吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘
制标准曲线。用最小二乘法进行线性回归，得回归方
程式：y＝ 36.4x－ 0.0298，相关系数为 0.9997，线性
范围为 0.004～0.02mg/mL。
1.3.2 黄酮化合物的提取工艺
原料→烘干→粉碎→石油醚除杂→去除滤液→乙
醇回流→浓缩→蒸馏水溶解(pH4以下)→离心沉淀→总
黄酮。
C×L×V
提取率 /%＝——————× 100
m
式中：C 为由标准曲线计算得出的样品质量浓度 /
(mg/mL)；V为样品溶液的体积 /mL；L为样品的总稀释
倍数；m 为样品的质量 / m g。
1.3.3 正交试验
固定水浴温度 86℃条件下[ 5]，对提取次数、处理
时间、乙醇体积分数和料液比 4个影响提取黄酮总含量
的因素进行考察[6]，对该因素进行单因素试验，比较各
因素水平间提取率的差异。根据单因素试验结果，选
择主要影响杨梅叶总黄酮提取效果的水平做正交试验，
对结果进行极差分析，确定最佳提取工艺条件。
1.3.4 黄酮的还原力试验
取 5支 10mL容量瓶，分别加入不同质量浓度杨梅
叶提取液，再加入 2.50mL(pH6.6) 0.2mol/L磷酸缓冲液及
2.50mL含 1%铁氰化钾溶液，50℃水浴 20min后急速冷
却，加入含 2.5mL 10%三氯乙酸水溶液，于 3000r/min
离心 10min，取上清液5.00mL，加蒸馏水4.0mL及1.0mL
含 0.1%三氯化铁溶液，混匀，10min后在 700nm处测
定吸光度 [ 7 ]。吸光度越大，则说明还原能力越强。
1.3.5 清除超氧阴离子自由基(O2－·)作用试验
参考文献[8]进行。取 5支 10mL具塞试管，各加入
2.00mL pH8.20的 Tris-HCl溶液，分别加入 2.50mL不同
质量浓度杨梅叶提取的黄酮溶液，混匀，加入 1.00mL
0.2mmo1/L邻苯三酚溶液，加水定容至刻度，以时间模
式记录 45min内每隔 30s吸光度的变化，并计算提取物
对超氧阴离子自由基的抑制率。
ΔA1/Δt－ΔA2/Δt
抑制率 /%＝—————————× 100
ΔA1/Δt
式中：ΔA 1 /Δt 为邻苯三酚自氧化速率；ΔA 2 /Δt
为加入提取物以后邻苯三酚自氧化速率。
1.3.6 清除羟自由基(·OH)作用试验
参考文献[9-11]进行。取 5支 10mL具塞试管，加
入 2.00mL不同质量浓度杨梅叶提取液，分别依次加入
2.00mL 6mmol/L的 FeSO4、2.00mL 6mmol/L的H2O2，混
匀后静置 10min，再加入 2.00mL 6mmol/L水杨酸，混匀，
静置 30min，在波长 510nm处测其吸光度记为 Ai，用双
蒸水代替水杨酸时的吸光度记为 A j，空白对照组以双蒸
水代替杨梅提取液吸光度记为 A 0。
Ai－Aj
E(·OH)/%= (1－————)× 100
A0
式中：E (·O H)为羟自由基的清除率 /%；A i为杨
梅黄酮反应的吸光度；A0为空白吸光度；A j为无水杨酸
参加反应时杨梅黄酮的吸光度。
2 结果与分析
2.1 杨梅叶中黄酮的定性试验
取一定量样品溶液，滴加 1%氢氧化钠溶液，溶液
出现橘黄色。取样品溶液，滴加 1%硼氢化钠溶液，溶
液变为蓝紫色。取样品溶液，点于滤纸上，滴加 1 %
三氯化铝乙醇溶液，吹干，在可见光下呈灰黄色。取
样品溶液，滴加 1%三氯化铁溶液，溶液产生墨绿色沉
淀。取乙醇提取液 1mL于试管中，加镁粉，再加入浓
盐酸数滴(1次加入)，在泡沫处呈紫红色。综合颜色反
应结果，杨梅叶提取物中含有黄酮类化合物，其中可
能含黄酮醇、双氢黄酮[ 1 2- 13 ]。
2.2 单因素及正交试验
2.2.1 乙醇体积分数对杨梅叶总黄酮提取率的影响
图 1 乙醇体积分数对杨梅叶总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total
flavonoids from bayberry leaves
4
3
2
1
0
总
黄
酮
提
取
率
/%
乙醇体积分数 /%
50 70 90 110
在 5.000g样品中，按料液比 1:30分别加入体积分数
55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，在水浴锅中
86℃条件下回流提取 1.5h(2次)，真空抽滤，减压浓缩，
用蒸馏水溶解(pH＜ 4)，离心，测其吸光度，分别计
算出黄酮的得率为 2 .21%、2 .67%、3 .17%、2 .7%、
1.74%。由图 1可知，黄酮得率开始随乙醇体积分数的增
大而增加，当体积分数达到 75%时，总黄酮得率最大；
当乙醇体积分数再增加时，得率又开始下降，并且脂
溶性的物质溶出增多，尤其是叶绿素几乎完全溶出，给
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提纯去杂带来较大的麻烦。从成本和提取率来考虑，乙
醇体积分数最好控制在 65%～85%为好。
2.2.2 料液比对杨梅叶总黄酮提取率的影响
图 2 料液比对杨梅叶总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of total
flavonoids from bayberry leaves
4
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
料液比(g/mL)
1:20 1:25 1:30 1:35
分别按 1:20、1:25、1:30、1:35的料液比加入 75%
的乙醇，其他条件同 2.2.1节，结果见图 2。由图 2可
知，随料液比减小，黄酮得率增加较快，当料液比小
于 1:35后，黄酮得率趋于恒定。从提取效果和减少溶
剂用量等方面综合考虑，用量应不宜过大，故将料液
比定在 1:25～1:35。
2.2.3 提取时间对杨梅叶总黄酮提取率的影响
在料液比为 1:30条件下，回流提取 0.5、1、1.5、
2.0、2.5h，其他条件同 2.2.2节，结果见图 3。由图 3
可知，黄酮收率随着回流作用时间的延长先增加后减
少。当作用时间为 0.5～2h时，黄酮的收率增加较快，
当作用时间为 2h时，黄酮收率最大，但此时与 1.5h相
比，仅略微增加；2 h 后，随着作用时间的延长，黄
酮的收率不但没增加反而下降，这可能是由于回流热效
应，长时间的作用会破坏黄酮，在后处理过程中损失
增大而影响黄酮的提取率，造成负面影响。从成本等
各方面考虑，提取时间控制在 1～2h 为宜。
2.2.4 提取次数对杨梅叶总黄酮提取率的影响
在料液比为 1:25条件下，在水浴锅中 86℃回流 1
次、2 次、3 次、4 次、5 次，每次为 1 . 5 h，其他条
件同 2.2.3节，结果见图 4。由图 4可知，黄酮收率随
着提取次数增加而增加。当提取次数 1～3次，黄酮的
收率增加较快，随着次数的增多，黄酮的收率增加幅
度很小。一方面其中的活性成分会受到破坏，杂质的
溶出量增加，给后续操作带来不便，成本费用增加；
另一方面也会造成溶剂的损失。从成本等各方面考虑，
提取次数为 2～3 次时最佳。
2.2.5 正交试验设计及结果
在单因素试验的基础上，选择对杨梅叶总黄酮提取
影响较大的乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取
次数 4个因素进行正交试验，选择 L9(34)正交表，绘制
因素水平表，结果见表 1。
试验 A乙醇体 B料液比 C提取 D提取 总黄酮
号 积分数/% (g/mL) 时间/h 次数 提取率 /%
1 1(65) 1(1:20) 1(1.0) 1(1) 1.78
2 1 2(1:25) 2(1.5) 2(2) 2.42
3 1 3(1:30) 3(2.0) 3(3) 3.34
4 2(75) 1 2 3 2.81
5 2 2 3 1 2.27
6 2 3 1 2 2.52
7 3(85) 1 3 2 1.85
8 3 2 1 3 1.71
9 3 3 2 1 1.96
K1 7.54 6.44 6.01 6.01
K2 7.60 6.40 8.04 6.79
K3 4.91 7.82 7.46 7.86
k1 2.573 2.146 2.003 2.003
k2 2.533 2.133 2.680 2.263
k3 1.636 2.606 2.486 2.620
R 0.937 0.473 0.677 0.617
表 1 杨梅叶总黄酮提取正交试验设计及结果
Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design
4
3
2
1
0
总
黄
酮
提
取
率
/%
提取时间 /h
1.0 1.0 1.5 2.0 2.5
图 3 提取时间对杨梅叶总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency of total
flavonoids from bayberry leaves
4
3
2
1
0
黄
酮
提
取
率
/%
提取次数
1 2 3 4 5
图 4 提取次数对杨梅叶总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of number of repeated extractions on extraction efficiency
of total flavonoids from bayberry leaves
以总黄酮提取率作为考察指标，分析试验结果可
知，各因素影响程度大小依次为 A(乙醇体积分数)＞ C
(提取时间)＞ D(提取次数)＞ B(料液比)。回流提取总黄
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酮的最佳提取条件为 A1B3C2D3，即乙醇体积分数 65%、
料液比 1:30(g/mL)、提取时间 1.5h、提取次数 3次。
2.3 杨梅叶总黄酮样品稳定性考察试验
将同一杨梅叶总黄酮样品溶液平行配制 9份，在室
温条件下避免阳光直射，每隔 30min测定 1次吸光度。
结果表明样品在 4 h 内，吸光度基本保持不变。
2.4 黄酮还原力作用
以不加黄酮溶液的对照组为试剂空白，得到黄酮质
量浓度(x)与吸光度(y)的线性回归方程为：y＝ 0.111x＋
0.0347，相关系数为 0.9985。
图 5 黄酮的还原力
Fig.5 Reducing power of total flavonoids from bayberry leaves
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
吸
光
度
黄酮质量浓度 /(μg/mg)
0 20 40 60 80
由图 5 可知，随着黄酮质量浓度的增大，还原力
逐渐增强。当质量浓度为 13.58μg/mL时，黄酮吸光度
为 0.192，当质量浓度为 74.85μg/mL时，黄酮吸光度为
0.877。证明，杨梅叶中黄酮是良好的电子供应者，具
有较强的还原能力。
2.5 清除超氧阴离子自由基(O2－·)作用
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
率
/%
黄酮质量浓度 /(μg/mg)
0 50 100 150
图 6 黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.6 Superoxide anion radical scavenging effect of total flavonoids
from bayberry leaves
由图 6 可知，随着样品黄酮质量浓度的增加，对
邻苯三酚自氧化速率的抑制作用越明显。当质量浓度为
13.97μg/mL时，黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用为
27.71%。当质量浓度为 96.91μg/mL时，对超氧阴离子自
由基的清除作用为49.42%。证明杨梅叶有较强的清除超氧阴
离子自由基活性。黄酮质量浓度(x)与抑制率(y)关系的回归方
程为：y＝－0.001x2＋0.3786x＋22.48，相关系数为 0.9992。
2.6 清除羟自由基(·OH)的作用
40
30
20
10
0
抑
制
率
/%
黄酮质量浓度 /(μg/mg)
0 5 10 15 20
图 7 黄酮对羟自由基的清除作用
Fig.7 Hydroxyl radical scavenging effect of total flavonoids from
bayberry leaves
由图 7 可知，对羟自由基的清除作用，黄酮质量
浓度(x)与抑制率(y)关系的回归方程为：y =－ 0.0365x2＋
2.5927x＋ 0.2905，相关系数为 0.9950。
随着黄酮质量浓度增加，对羟自由基的清除作用逐
渐加强。当黄酮质量浓度 6.25μg/mL时，对羟自由基
的清除率为 15.6%。当质量浓度 19.25μg/mL时，对羟
自由基的清除率为 36.4%。
3 结 论
3.1 回流法是一种有效提取杨梅叶总黄酮的方法，本
实验所得最佳工艺条件为乙醇体积分数 65%、料液比
1:30(g/mL)、提取时间 1.5h、提取 3次，在该条件下，
总黄酮提取率为 3.34%。
3.2 抗氧化性试验表明，杨梅叶总黄酮具有较好的还
原性以及清除羟自由基、清除超氧阴离子自由基的能
力，而且在一定质量浓度范围内呈线性关系。
3.3 杨梅叶资源丰富，其有效成分和药理作用的研究
已经引起广泛关注。本研究结果对于促进杨梅叶资源利
用有一定的参考价值。
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