全 文 ：北方园艺 2007(5):227 ～ 229 ·食 用菌 ·
第一作者简介:杨玉红(1973-),女,博士, 讲师 ,主要从事微生物工
程和食品生物技术方面的研究 , E-mail:kzly angyuhong。
基金项目:沈阳农业大学青年基金资助项目(2005053)。
收稿日期:2007-01-12
牛肝菌胞外多糖发酵培养基的优化
杨玉 红1 , 康 宗利1 , 王宏梅2 , 刘长 江3
(1.沈阳农业大学生物科学与技术学院, 110161;2.辽东学院医学院基础部,丹东 118002;3.沈阳农业大学食品科学与工程学院 , 110161)
　　摘　要:以美味牛肝菌为研究对象 ,对其多糖发酵主要影响因子和发酵培养基优化进行研
究。通过对单因子培养基优化处理试验结果的分析比较 ,选择出 3个对牛肝菌多糖发酵影响较
大的因子进行了正交试验 ,结果表明:美味牛肝菌最适培养基为 20.0g 葡萄糖+7.0g 酵母粉+
3.0g黄豆粉+1.0gKH2PO4 +0.5g MgSO4 ·7H2O+0.5 g MnSO4 ·H2O 。
关键词:牛肝菌;多糖;培养基优化
中图分类号:S 646.3　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2007)05-0227-03
　　真菌多糖是一种能够增强人体免疫功能的生活活
性物质 ,在国际上被称为生物反应调节剂。食药用真菌
多糖及其复合物的多种多样生物活性功能以及在功能
食品和临床上的广泛使用 ,使其成为近年生命科学 、生
物学 、医药和食品科学等研究领域的热点之一[ 1 , 2] 。牛
肝菌是野生食用菌的重要组成类群 ,我国已发现牛肝菌
目的种类达 390种以上 ,可食的 199种[ 3] 。许多种是与
松科植物共生的菌根食用菌 ,具有很高的研究开发价
值。其中的多糖和碱性蛋白可抗肿瘤 、病毒 ,调节人体
的免疫功能[ 4～ 6] 。然而 ,由于菌根共生等复杂原因 ,牛肝
菌至今未能实现人工栽培。深层培养是近代大规模生
产微生物产品的基本方法[ 7] 。它能在短期内获得大量
的产品 ,且又可从发酵罐中得到多糖、氨基酸等有用的
代谢产物。食药用真菌液态发酵胞外多糖时 ,各种理化
因素 ,包括发酵液的组成和外界环境因素 ,都会影响到
生产菌的生长速度 ,生物量的多少以及代谢特征等[ 8] 。
因此 , 对牛肝菌胞外多糖发酵进行培养基的优化具有很
大的现实意义。
1　试验材料和方法
1.1　试验材料
供试菌株:美味牛肝菌 5.504 ,购自北京中关村微生
物所菌种保藏中心。
1.2　试验方法
1.2.1　菌种活化　配制综合马铃薯培养基 ,分装试管 ,
高压灭菌锅中灭菌30min ,放置斜面 ,将美味牛肝菌接入
斜面培养基 ,28℃恒温培养箱中培养 ,待菌丝长满试管
备用。培养基:葡萄糖20g ,20%土豆汁1 000mL ,磷酸二
氢钾 3g ,硫酸镁1.5g ,琼脂15g ,pH=6。土豆汁制备:土
豆去皮 ,切碎 ,取 20g 放入加水的烧杯中在电炉上加热
1h ,然后纱布过滤 ,最后定容至 1 000mL。
1.2.2　平面培养　超净工作台上将活化后的菌种接入
灭过菌的装有培养基的培养皿内 ,然后在在恒温培养箱
中 28℃培养至长满菌丝 ,备用(菌种扩大)。
1.2.3　摇瓶发酵培养基　葡萄糖 20g+酵母粉 7.0g+
黄豆粉 3.0g+磷酸二氢钾1.0g+硫酸锰 0.5g+硫酸镁
0.5g 。
1.2.4　菌种培养及接种　取斜面试管菌种点种于10个
含基础培养基的培养皿中 ,28℃恒温培养箱中培养 ,观
察 ,待长出菌落后 ,选出生长均匀的好的菌落 ,用打孔器
从平板上打孔 ,将打下的菌丝分别接种于各个处理中 ,
即盛有 50mL发酵液的三角瓶中。
1.3　试验设计
以 1.2.3所述培养基做对照 ,再对各个成分优化培
养先做单因子试验 ,再进行正交试验。在试验过程中发
现 ,静置培养中的美味牛肝菌菌丝基本不生长 ,因此只
对摇床培养进行研究。
1.3.1　单因子试验　单因子的摇瓶培养:以一个因子做
参数 ,其余因子量不变。将其余因子按基本摇床培养基
量做培养基 500mL ,然后分别装入 150mL 的三角瓶中 ,
再按单因子分析加入不同量 ,标记。然后在高压灭菌锅
中灭菌 20min ,在超净工作台上接入菌株 ,放入恒温摇床
中在 28℃下培养6d。多糖的提取(发酵液多糖提取):经
摇床培养 6d后 ,取出摇瓶 ,用纱布过滤 ,分离菌丝和发
酵液。将菌丝拧干 ,然后烘干称重 ,记录数据;发酵液
(滤液)在恒温水浴锅中 60℃浓缩至 1/3体积 ,再加入4
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·食 用菌· 北方园艺 2007(5):227～ 229
倍体积的 95%乙醇 ,过夜醇析 ,然后在离心机上 4 000
r/min离心 10min ,去上清 ,得沉淀为粗多糖。
1.3.2　正交试验　在对美味牛肝菌进行了单因子培养
基筛选试验之后 ,通过对试验结果的比较 ,选择对美味
牛肝菌多糖发酵影响较大的 3个因子做正交试验。正
交试验因素和水平 ,见表 1。从正交设计表中选用
L9(33)进行正交设计试验 ,见表 2。
　　表 1　　　　　试验因素和水平
因素 水平
1 2 3
葡萄糖(A)
硫酸锰(B)
磷酸二氢钾(C)
10
0.4
0.8
15
0.5
1.0
20
0.6
1.2
　　表 2　　　培养基优化正交试验方案
试验序号 因素
A B C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
1
3
1
2
2　结果与分析
2.1　牛肝菌胞外多糖主要影响因子的筛选
　　表 3　　葡萄糖优化处理后发酵液中菌丝
干重和多糖含量 (g/50mL)
处理 CK 1 2 3 4
葡萄糖
菌丝干重
多糖含量
5
0.1084
0.0834
3
0.0984
0.0756
10
0.1752
0.1529
15
0.2321
0.1540
20
0.2349
0.1512
2.1.1　葡萄糖量的优化(g/L)　从表3可以看出:当葡
萄糖量为 10g 、15g 、20g时发酵液中提取的菌丝干重明显
多于 CK ,且当葡萄糖量为 20g 时菌丝产量最高。当葡
萄糖量为 20g ,15g ,10g时糖的发酵量明显多于 CK ,其中
以15g为最好。
　　表 4　　酵母膏优化处理后发酵液菌丝干重
和多糖含量 (g/50mL)
处理 CK 1 2 3 4 5
酵母膏
菌丝干重
多糖含量
12
0.1068
0.0875
4
0.0414
0.0345
7
0.1404
0.1288
8
0.1499
0.1388
16
0.1422
0.1358
20
0.0423
0.0365
2.1.2　酵母膏的优化(g/L)　从表 4可以看出:当酵母
膏量为 7g、8g 、16g发酵液中提取的菌丝干重和多糖含量
较多 ,但差异不明显。
　　表 5　　磷酸氢二钾优化处理后发酵液菌丝
干重和多糖含量 (g/50mL)
处理 CK 1 2 3 4 5
磷酸二氢钾
菌丝干重
多糖含量
1.5
0.1269
0.1057
0.5
0.1863
0.1602
0.8
0.3318
0.2121
1.0
0.3069
0.2282
1.2
0.1962
0.0669
2.0
0.0609
0.0531
2.1.3　磷酸二氢钾的优化(g/L)　从上表可以看出:当
磷酸二氢钾量为 0.8g 、1.0g、1.2g 时发酵液中提取的菌
丝干重和多糖含量明显多于 CK ,且当磷酸二氢钾量为
1.0g 时菌丝产量和多糖含量最高。
2.1.4　黄豆粉的优化(g/ L)　恒温摇床培养 6d后 ,发
酵液中提取出的菌丝干重如表 6。从表 6可以看出:当
黄豆粉量不同时菌丝干重和多糖含量差异不明显。
　　表 6　黄豆粉优化处理发酵液菌丝干重和多糖含量
(g/50mL)
处理 CK 1 2 3 4
黄豆粉
菌丝干重
多糖含量
1.0
0.0748
0.0657
2.0
0.0870
0.0758
3.0
0.0922
0.0960
4.0
0.0876
0.0778
5.0
0.0808
0.0713
　　表 7　　硫酸锰优化处理后发酵液菌丝干重
和多糖含量 (g/50mL)
处理 CK 1 2 3 4 5
硫酸锰
菌丝干重
多糖含量
0.8
0.0693
0.0791
0.2
0.0588
0.0496
0.4
0.0748
0.0913
0.5
0.1152
0.1099
0.6
0.1029
0.1134
1.0
0.0657
0.0743
2.1.5　硫酸锰的优化(g/L)　从表 7可以看出:当硫酸
锰量为 0.4g、0.5g、0.6g 时发酵液中提取的菌丝干重和
多糖含量明显多于CK ,且当硫酸锰量为 0.5g 时菌丝产
量最高 ,硫酸锰量为 0.6g时多糖发酵量最多。
2.1.6　硫酸镁的优化(g/ L)　恒温摇床培养 6d后 ,发
酵液中提取出的菌丝干重如表 8。从表 8可以看出:当
硫酸镁用量不同时 ,发酵液中的菌丝干重和多糖含量差
异不明显。
　　表 8　　硫酸镁优化处理后发酵液菌丝干重
和多糖含量 (g/50mL)
处理 CK 1 2 3 4 5
硫酸镁
菌丝干重
多糖含量
0.8
0.0408
0.0359
0.2
0.0432
0.0395
0.4
0.0483
0.0416
0.5
0.0581
0.0471
0.6
0.0558
0.0461
1.0
0.0423
0.0382
　　由上述6个单因子试验结果可知 ,对发酵液中的菌
丝干重和多糖含量影响相对大的因素葡萄糖 、硫酸锰和
磷酸二氢钾3个因子 ,因此选此3个因素来做正交实验 ,
以筛选出胞外多糖发酵最佳培养基组合。
2.2　牛肝菌胞外多糖培养基优化的研究
228
北方园艺 2007(5):227 ～ 229 ·食 用菌 ·
按表 2所示正交试验方案 ,结果见表9。
　　由正交试验结果直观分析表可以看出 ,影响美味牛
肝菌发酵液多糖产量的各因素中 RA>RB>RC ,即在试
验确定的因素中 ,葡萄糖量的影响最大 ,硫酸锰次之 ,磷
酸二氢钾的影响最小。通过直观分析 ,A 、B、C三因素的
最优组合为 A3B2C2 ,综合牛肝菌胞外多糖主要影响因子
的筛选试验结果分析 ,得到美味牛肝菌多糖发酵的最优
培养基组合为:20.0g 葡萄糖+7.0g 酵母粉+3.0g 黄豆
粉+1.0g KH2PO4 +0.5g MgSO4 ·7H2O +0.5g Mn-
SO4 ·H2O。
　　表 9　　　正交试验结果直观分析表
试验序号 因素
A B C
多糖(g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T1
T2
T3
X1
X2
X3
R
1
1
1
2
2
2
3
3
3
0.3146
0.2881
0.3228
0.1049
0.0960
0.1076
0.0116
1
2
3
1
2
3
1
2
3
0.2922
0.3230
0.3210
0.0977
0.1077
0.1070
0.0100
1
2
3
2
3
1
3
1
2
0.3016
0.3221
0.3018
0.1005
0.1077
0.1006
0.0072
0.0986
0.1128
0.1032
0.0951
0.1001
0.0929
0.0985
0.1101
0.1142
3　结论
　　单因子培养基筛选试验结果表明:葡萄糖 、硫酸锰
和磷酸二氢钾这3个因子对牛肝菌多糖发酵影响较大 ,
因此以这3个因子作为牛肝菌多糖发酵主要影响因子
进行正交试验。
　　通过正交试验结果分析表发现 ,葡萄糖量在这 3个
主要影响因子中对美味牛肝菌多糖发酵影响最大 ,其次
是硫酸锰和磷酸二氢钾。
　　综合牛肝菌胞外多糖主要影响因子的筛选试验和
牛肝菌胞外多糖培养基优化的研究试验的结果得出结
论:美味牛肝菌最适培养基为 20.0g葡萄糖+7.0g 酵母
粉+3.0g 黄豆粉+1.0g KH2 PO4 +0.5g MgSO4 ·7
H2O+0.5g MnSO4 ·H2O。
参考文献:
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The Zymolytic MediumOptimization of the Boletus Polysaccharide Fermentation
YANG Yu-hong 1 , KANG Zong-li1 ,WANG Hong-mei2 , LIU Chang-jiang3
(1.Biological Science and Technology Institute, Shenyang Agricultural University;2.Basic Depar tment of Medical Institute , Liaodong Colleg e,
Dandong 118002;3.College of Food and Engineering , Shenyang Agricultural University ,110161)
Abstract:This paper has investigated the major factor and the zymoly tic medium optimization of the boletus polysaccha-
ride fermentation.By comparing the experimental results of single factor medium screening test , we has carried on the
orthogonal experiment of 3major factors which have the most important inf luence to the boletus polysaccharide fermenta-
tion.The results of the orthogonal experiment have showed that the optimum culture medium is 20.0 g glucose+7.0g
yeast powder+3.0g soy flour+1.0g KH2PO4 +0.5g MgSO47H2O+0.5g MnSO4H2O.
Keywords:Boletus;Polysaccharide;Culture medium optimization
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