全 文 ：253※分析检测 食品科学 2012, Vol. 33, No. 02
原壳小球藻生物量快速测定方法的对比研究
崔 妍，李美芽，施春雷 *，史贤明
(上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系，中美食品安全联合研究中心，陆伯勋食品安全研究中心，
上海 200240)
摘 要：通过分光光度计和酶标仪分别测定不同浓度小球藻藻液的吸光度(A)和光密度(OD)，用显微镜对细胞精确
计数和用烘干法测量细胞干质量，分别在吸光度/光密度和细胞密度、吸光度/光密度和细胞干质量之间建立了良好
的线性关系，相关系数较显著。经过一系列波长的筛选，确定在波长 440nm处测定吸光度/光密度最佳，进而确
定生物量。两种仪器对比显示：酶标仪测得的结果线性关系更加显著。与细胞计数法等传统方法相比，光密度法
更加便捷，能极大地提高检测效率和准确度，可作为小球藻实验室研究和工业化生产的有效检测手段。
关键词：原壳小球藻；生物量；吸光度；光密度；显微镜计数；干质量
A Comparative Study of Rapid Determination Methods for Biomass of Chlorella protothecoides CS-41
CUI Yan，LI Mei-ya，SHI Chun-lei*，SHI Xian-ming
(MOST-USDA Joint Research Center for Food Safety, Bor Luh Food Safety Center, Department of Food Science and Technology,
School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
Abstract：Absorbance and optical density of Chlorella protothecoides CS-41 were measured by a spectrophotometer and a
microplate spectrophotometer, respectively. Total cell number and dry biomass of C. protothecoides were evaluated by microscope
and drying method. A good linear relationship between the absorbance/optical density and microscopic counting/biomass was
established. The wavelength of 440 nm was chosen as the optimal wavelength for measuring absorbance/optical density of
biomass. Through the comparison of both kinds of instruments, microplate spectrophotometer revealed more obvious linear
relationship and optical density method could provide more convenience, efficiency and accuracy for the determination of
biomass.
Key words：Chlorella protothecoides CS-4；biomass；absorbance；optical density；microscopic counting；dry weight
中图分类号：Q949.21 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)02-0253-05
收稿日期：2011-07-08
基金项目：上海交通大学农业与生物学院新进博士教师基金项目(NQN200901)；上海交通大学研究生创新能力培养专项基金项目
作者简介：崔妍(1986—)，女，硕士研究生，主要从事小球藻生物技术研究。E-mail：cyan9028@gmail.com
*通信作者：施春雷(1977—)，女，副教授，博士，主要从事食品安全与食品生物技术研究。E-mail：clshi@sjtu.edu.cn
小球藻是普生性单细胞绿藻，主要的种类有蛋白核小球
藻、普通小球藻、原壳小球藻、卵形小球藻、盐生小球
藻、眼点小球藻等。小球藻作为一种营养丰富、功能多样、
无毒无污染的天然生物资源，已被广泛应用于食品工业领
域、生物医药、动物饲料等领域[1-2]，具有很大的经济价值
和研究价值。
小球藻生物量的分析测定往往是实验室研究以及工
业化生产的一项基础性工作。常用的方法有显微镜计数
法、光密度法、叶绿素测定间接分析法以及干质量法
等。国外应用较多的是显微镜计数法和干质量测定法，
但前者操作复杂，工作量大；后者耗时长，精确性欠
佳。Afkar等[3]利用血球板计数和干质量称量来测定普通
小球藻生物量，从而研究重金属对其生理活性的影响。
Gonzalez等[4]在微藻与促植物生长细菌共固化作用研究中
通过 105℃烘干 1h称得的干质量来分析小球藻生物量，
提出了微藻与促植物生长细菌共固化作用可增加小球藻
生长量的结论。国内分析生物量的主要方法是显微镜计
数法和光密度法，后者一直被认为精确度欠佳，只能
用于相对定量，而且在测定波长的选择上存在很大分
歧。左明等[5]采用 640nm波长测定小球藻液吸光度，通
过线性回归曲线 y=0.4291x＋0.0398测得细胞干质量，从
而获取生物量。袁天昆等[6]通过显微镜计数来研究两种
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培养液对小球藻生长的影响。师文静等[7]在 400～800nm范
围内扫描，确定 689.32nm处有最大吸收峰，利用最大波
长处的光密度(OD)值来测定生物量。在采用 96孔板法用
于除草剂高通量筛选的研究中，严航贞等[ 8 ]采用的是在
630nm和690nm测定藻类光密度。吕富等[9]在植物激素NAA
对小球藻生长及叶绿素和蛋白质含量的影响研究中选择了
在 298nm处测定藻的光密度，以评估藻的生长情况。
光密度法是利用藻细胞在某一波长处的光吸收值来
测定细胞密度的方法，目前国内外未见有采用光密度法
测定原壳小球藻生物量的方法学报道。原壳小球藻含有
较高含量的叶黄素，其作为极具潜力的叶黄素源而备受
关注，而通过对原壳小球藻的改造提高叶黄素合成量具
有一定的工业化应用前景。为了便于后续对原壳小球藻
生理和遗传进行更为深入的研究，本研究依据仪器特
性，利用分光光度计和酶标仪在不同波长处进行小球藻
细胞光密度测定，以期寻找到利用光密度法测定原壳小
球藻的最佳波长以及快速测定吸光度的最佳仪器。同时
为了满足后期工业化生产中藻细胞干质量测量的精准要
求，本研究对干质量与吸光度之间的线性关系进行分
析，以期得到一条可根据吸收值推测原壳小球藻干质量
的便捷途径。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
原壳小球藻(Chlorella protothecoides CS-41)购自澳
大利亚 CSIRO 微藻研究中心，由本实验室保存。
DU800分光光度计 美国Beckman公司；Sunrise
酶标仪 瑞士 Tecan公司；CX31显微镜 日本Olympas
公司；XB-K-25血球计数板 上海安信光学仪器制造有
限公司；FD115烘箱 德国 Binder公司。
1.2 方法
1.2.1 小球藻的培养
培养基为改良式 Basal培养基[10](g/L)：葡萄糖 9.0，
KNO3 1.25，KH2PO4 1.25，MgSO4·7H2O 1.0，EDTA
0.5，H3BO3 0.1442，CaCl2·2H2O 0.111，FeSO4·7H2O
0.0498，ZnSO4·7H2O 0.0882，MnCl2·4H2O 0.0142，
MoO3 0.0071，CuSO4·5H2O 0.0157，Co(NO3)2·6H2O
0.0049，pH6.1。
培养条件：温度 28℃，光照 4000 lux，摇床转速
为 150r/min，培养 7d至稳定期。
1.2.2 小球藻藻液吸光度及光密度的测定
利用分光光度计对原壳小球藻藻液进行全波长扫
描，结果如图 1所示，藻液在 400～500nm之间有较大
吸收峰，另外在 650～700nm之间也有较大吸收，而采
用小球藻甲醇提取物进行全波长扫描，发现在三大波长
范围内有较大吸收峰，如图 2所示，分别为 285～320、
400～460、640～680nm，这与藻原液全波长扫描有较
好的一致性。为了找到最适合测定原壳小球藻生物量的
吸收波长，参考文献[5-9,11-15]中报道的测定小球藻生
物量常用波长，在 285～700nm范围内选取 286、300、
305、415、430、435、440、445、448、540、645、
663nm和 680nm共 13个波长进行测定分析。
将培养至稳定期的小球藻稀释成 8个不同的浓度梯
度，以Basal液体培养基为参照分别用分光光度计和酶
标仪测定吸光度和光密度。
图 1 小球藻藻液全波长扫描图
Fig.1 Full-wavelength scanning spectrum of culture suspension of
C. protothecoides CS-41
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
吸
光
度
波长 /nm
285 335 385 435 485 535 585 635 685
图 2 小球藻甲醇提取物全波长扫描图
Fig.2 Full-wavelength scanning spectrum of methanol extract of
C. protothecoides CS-41
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
吸
光
度
波长 /nm
285 335 385 435 485 535 585 635 685
1.2.3 显微镜计数法测定小球藻细胞密度
采用血球计数板对 8个不同浓度梯度的小球藻液进
行细胞计数，每样重复 3 次，取平均值。
1.2.4 干质量法测定小球藻生物量
各取 15mL藻液置于恒定质量的离心管中，5000r/
min离心 10min，弃上清液，敞口置于 60℃烘箱干燥至
质量恒定。每个浓度重复 3 次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 两种仪器测定比较
分别用分光光度计和酶标仪在不同波长下测定小球
藻液的吸光度，同一浓度同一波长处二者测得值有一定
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的差异，由于本研究所用酶标仪测定波长范围所限，在
波长 400nm以下检测不到。如表 1所示，分光光度计
在各个波长处测定的吸光度要明显高于酶标仪，但两者
均在 440nm处出现了最大吸收，且吸光度大小的变化趋
势是一致的。
波长 /n m 415 430 435 440 445 448 540 645 663 680
分光光度计 0.9398 1.0478 1.0655 1.0730 1.0537 1.0279 0.6803 0.6514 0.6589 0.8576
酶标仪 0.6463 0.6690 0.6730 0.6737 0.6687 0.6647 0.4650 0.4627 0.4467 0.5620
表 1 分光光度计和酶标仪测定同一浓度小球藻液所得结果的比较
Table 1 Comparison of the absorbance of C. protothecoides CS-41 culture
determined by spectrophotometer and microplate spectrophotometer
2.2 小球藻不同波长条件下的吸光度/光密度与细胞密度
之间的线性关系
以细胞密度(104个 /mL)为纵坐标，以分光光度计测
得的吸光度或酶标仪测得的光密度为横坐标建立线性曲
线，吸光度 /光密度在 0～1.5之间为线性范围。不同浓
度小球藻液的吸光度均与细胞密度呈现良好的线性关
系，在各个波长处酶标仪得到的线性相关系数几乎都大
于 0.999，优于分光光度计得到的结果。就采用细胞计
数的方法得到的细胞密度与吸光度/光密度之间的线性关
系而言，在 440nm处分光光度计测得的线性回归方程为
y＝721.53x－22.991，酶标仪测得的线性回归方程为 y＝
1110.9x－ 37.318，分光光度计的线性关系(R2＝ 0.9990)
与酶标仪的(R2＝ 0.9992)相差不大。
2.3 小球藻不同浓度梯度下的吸光度/光密度与细胞干
质量之间的线性关系
波长 /nm 直线回归方程 相关系数(R2)
286 y=0.2218x－ 0.0163 0.9967
300 y=0.246x－ 0.0178 0.9968
305 y=0.2527x－ 0.0183 0.9968
415 y=0.2993x－ 0.0193 0.9989
430 y=0.273x－ 0.0184 0.9980
435 y=0.2546x－ 0.014 0.9984
440 y=0.2534x－ 0.0143 0.9984
445 y=0.2518x－ 0.0151 0.9979
448 y=0.2611x－ 0.0154 0.9981
540 y=0.3769x－ 0.0182 0.9970
645 y=0.4092x－ 0.0119 0.9947
663 y=0.375x－ 0.0126 0.9977
680 y=0.3223x－ 0.0128 0.9971
表 2 分光光度计测得小球藻吸光度与细胞干质量之间的线性关系
Table 2 Linear relationship between dry biomass and absorbance
determined by spectrophotometer
波长/nm 直线回归方程 相关系数(R2)
415 y=0.4738x－ 0.0219 0.9989
430 y=0.4518x－ 0.021 0.9988
435 y=0.4662x－ 0.0400 0.9992
440 y=0.4668x－ 0.0407 0.9993
445 y=0.4732x－ 0.0412 0.9993
448 y=0.4795x－ 0.0409 0.9993
540 y=0.6615x－ 0.0437 0.9995
645 y=0.6709x－ 0.0444 0.9992
663 y=0.6043x－ 0.0423 0.9988
680 y=0.5528x－ 0.0429 0.9993
表 3 酶标仪测得小球藻光密度与细胞干质量的线性关系
Table 3 Linear relationship between dry biomass and absorbance
determined by microplate spectrophotometer
OD440
计数所得细胞浓 曲线拟合所得细胞 平均值 / 相对偏
度 /(104个 /mL) 浓度 /(104个 /mL) (104个 /mL) 差 /%
0.1170 8.44× 101 9.27× 101 8.85× 101 4.69
0.5272 4.10× 102 5.48× 102 4.79× 102 14.44
1.1330 8.75× 102 1.22× 103 1.05× 103 16.52
1.9287 1.48× 103 2.11× 103 1.79× 103 17.33
2.0867 1.56× 103 2.28× 103 1.92× 103 18.77
表 4 光密度与细胞浓度线性关系验证
Table 4 Verification of the linear relationship between absorbance and
cell density
由表 2、3 所示，不同浓度小球藻液的吸光度和光
密度均与细胞干质量有良好的线性关系，总体看来，分
光光度计的线性关系不如酶标仪的显著。在分光光度计
的检测结果中，435nm与 440nm波长处检测结果的相
关系数最显著，而酶标仪检测结果的相关系数几乎均大
于 0.999，且各个波长之间相差不大。以细胞干质量(g/L)
为纵坐标，以吸光度/光密度为横坐标建立线性曲线，吸
光度/光密度在 0～1.5之间为线性范围。在 440nm处，分
光光度计测得的线性回归方程为 y＝ 0.2534x－ 0.0143，
线性关系R2＝0.9984；酶标仪测得的线性回归方程为 y＝
0.4668x－ 0.0407，线性关系R2＝ 0.9993。酶标仪测得的
光密度与细胞干质量之间的线性关系良好，这说明采用
光密度的测定可以替代干质量测量来计量藻的生物量。
2.4 酶标仪 440nm检测光密度与细胞密度、细胞干质
量之间线性关系验证
为了验证所得到的线性关系的重复性和可靠性，任
意取不同培养批次不同生长阶段的藻液利用酶标仪测定
OD 440，并进行计数和干质量测量，与研究所得的曲线
(y=1110.9x－ 37.318；y=0.4668x－ 0.0407)进行了拟合，
计算相对偏差。每个实验重复 3 次以上，结果如表 4、
5所示，在酶标仪检测线性范围内(0～2.5)，通过曲线
拟合得到的细胞密度以及细胞干质量均与实际测量值基
本吻合，相对偏差可控制在一定范围内(相对偏差小于
20%)，说明前面所建立的测定方法具有一定的可靠性和
良好的重复性。
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3 讨 论
光密度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定
波长范围内光的吸收值，对该物质进行定性和定量分析
的方法。小球藻的生物量可以通过光密度法测定小球藻
的光吸收值来进行定量。本研究中采用两种仪器测定小
球藻液吸光度，分光光度计可以检测波长范围在 200～
800nm区间包括紫外和可见吸收光，而本实验室使用的
酶标仪的检测范围为 400～800nm的可见吸收光；实验表
明，分光光度计只有在吸光度较小时才能呈现良好的线
性关系，酶标仪却可在更广的范围内呈现良好的线性关
系，并且在同一浓度下，酶标仪测得的线性结果要优
于分光光度计。此外，二者在测定高浓度小球藻藻液
时，吸光度和光密度相差较大，对于稳定期的小球藻
藻液，分光光度计测得的值为 2.6924，而酶标仪测得的
值为 4.0317，由此推测分光光度计只在某一范围内的测
定值是准确的，如果小球藻液浓度过高，需先进行稀
释处理再进行测定。此外，由于分光光度计和酶标仪
的仪器构造不同，测量效率也有很大差别，分光光度
计每次只能测定一个样品，而酶标仪一次可以测定小于
等于 96个样品，采用酶标仪测定大量的样品更为快捷。
细胞计数法是利用血球计数板在高倍镜下对小球藻
进行直接计数，受人为因素影响较大，在样品量多的
情况下，直接计数工作量大，耗时长，而且在细胞密
度过低或过高时误差很大。干质量法需对小球藻进行收
集，烘干，其过程持续时间长，耗时耗能。叶绿素
含量间接测定小球藻生物量的方法由于要对藻进行叶绿
素提取，该过程非常繁琐且存在较大的误差，此外，
培养基成分对异养培养的小球藻细胞的叶绿素含量影响
很大，难以用单一的方程来拟合二者之间的关系。本
研究采用原壳小球藻混养培养，即添加碳源的同时提供
光照的方法培养小球藻，是自养和异养培养方式的结
合。分光光度计及酶标仪在不同波长处检测的结果表
明，在一定的检测范围内，光密度法可以很好地反映
小球藻藻液的细胞密度和细胞干质量，可以通过线性拟
合来获得生物量。因此，与传统的细胞计数，干质量
OD440
称量所得干 曲线拟合所得干 干质量平 相对偏
质量 /(g/L) 质量 /(g/L) 均值 /(g/L) 差 /%
0.2187 0.0911 0.0611 0.0761 19.71
0.6123 0.2844 0.2435 0.2640 7.76
1.2420 0.6133 0.5352 0.5743 6.80
1.9563 1.0711 0.8662 0.9686 10.58
2.4457 1.4333 1.0929 1.2631 13.48
表 5 光密度与细胞干质量线性关系验证
Table 5 Verification of the linear relationship between absorbance and
dry biomass
法和叶绿素间接测定法相比，光密度法最具有可操作
性，对细胞无损伤，而且结果精确，重复性强。采
用酶标仪进行测定，则更加快速、便捷，可以节约大
量的时间和精力，优势非常明显。
然而在以往采用光密度法对小球藻生物量测定的研
究中，使用的检测波长具有特异性，不同的研究对象
选用的波长不一样，大多是通过全波长扫描来确定最大
吸收波长的。有采用 540nm[11-12]和 665nm[13]，也有采用
680nm[14]和672nm[15]，其中黄美玲等[14]研究认为680nm波
长处最为灵敏，其次为 5 4 0 n m，而本研究中在波长
440nm处取得最大值，其次为 435nm，这是由于黄美玲
只在 540～700nm间取不同波长，而本研究的波长范围
较广，在 540～700nm区间，但吸光度变化趋势与黄美
玲得到的结论是一致的。吕旭阳等[16]在450～700nm波长
范围内，得到 680nm波长处测定的灵敏度最高。Hosono
等[17]通过OD650与细胞干质量建立的标准曲线来测定蛋白
核小球藻的细胞浓度。总的看来，选择最大吸收波长
的不同主要还是与研究的藻株有关，藻株不一样，所
含的物质可能就会有所差别，紫外分光光度计检测得到
的最大吸收波长必然有所不同。因此，确定原壳小球
藻最佳测定波长对于原壳小球藻的后续研究十分必要。
原壳小球藻作为一种水生单细胞低等植物，它含有
较高含量的叶黄素，类胡萝卜素等。类胡萝卜素是一
类广泛存在于植物，少量微生物和真菌中的色素类物
质。研究[ 1 8 ]表明，这些物质在紫外光下最大吸收波长
有所不同，因此可以根据这一特征进行分离，这类物
质的紫外吸收峰主要集中在 300～500nm。此外，原壳
小球藻为绿色单细胞生物，含有较高含量的叶绿素，可
以通过光合自养获得营养物质进行生长繁殖。叶绿素 a
和 b的最大吸收波长分别为 663nm和 645nm，目前测定
叶绿素含量常用的方法还是通过测定 663nm和 645nm处
最大吸收值来计算的，由此，本实验也选择 663nm和
645nm作为候选波长进行研究。通过测定 13个候选波长
处藻液的光密度值，称量干质量以及细胞计数，对三
者的关系分析拟合，结果发现，在 440nm波长处检测，
不同浓度梯度的藻液吸光度不仅和干质量有很好的线性
关系，还与细胞密度呈现出良好的线性关系。后期我
们将不同培养批次不同生长阶段的藻液进行了吸光度的
测定，并进行了计数和干质量测量，与研究所得的曲
线进行了拟合，重复性都很好(表 4、5 )。因此，结合
仪器的特征，采用酶标仪测定藻液吸收值不失为一种测
定原壳小球藻生物量准确而便捷的方法。
刘学铭等[19]在分批异养培养小球藻的过程中发现细
胞浊度和细胞干质量之间的关系变化较大，在整个培养
过程中藻生物量的干质量与光密度比值(DW/OD)呈现出
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先升后降的趋势，40h后保持恒定。而本实验针对培养
至稳定期的原壳小球藻采用的光密度法测定其生物量，
不论从细胞干质量还是从细胞个数来比较，DW/OD值
均较恒定，特别是在波长为 440nm，可以作为稳定期藻
液生物量的检测方法，若检测对数生长期藻液，还需
考虑到培养基中葡萄糖以及硝酸盐对细胞生长和分裂的
影响，从吸光度和干质量两个角度考察生物量。
参 考 文 献 ：
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