全 文 ：[ 文章编号] 　1007-3949(2005)13-02-0129-04 ·实验研究·
旋覆花内酯对人血管内皮细胞环加氧酶 2和
细胞间粘附分子 1表达的影响
陈英珠 , 温进坤 , 韩 梅 , 张嫡群
(河北医科大学基础医学研究所 , 河北省石家庄市 050017)
[ 关键词] 　药理学;　旋覆花内酯对血管内皮细胞的作用;　Western 印迹;　环加氧酶 2;　细胞间粘附分子 1;　
核因子κB;　脂多糖
[ 摘　要] 　目的观察旋覆花内酯对脂多糖诱导的人血管内皮细胞核因子κB 激活及促炎基因环加氧酶 2 和细胞间
粘附分子 1表达的影响。方法　应用Western 印迹检测血管内皮细胞间粘附分子 1 和细胞核中 P65水平 , 以逆转录
—聚合酶链反应技术检测环加氧酶 2基因表达的活性。结果　12.5 、 25 和 50 μmol/L 的旋覆花内酯分别使脂多糖
诱导的环加氧酶 2 mRNA 表达水平降低 35.85%、42.46%和 53.46%;使细胞间粘附分子 1的表达分别降低 9.77%、
40.87%和 46.83%。旋覆花内酯能够拮抗脂多糖诱导的核因子κB亚单位 P65 核移位 ,用该化合物预处理细胞后再
用脂多糖诱导时 ,细胞核内的P65水平不再升高 。结论　旋覆花内酯通过抑制核因子κB 的活化而抑制促炎基因环
加氧酶 2和细胞间粘附分子 1 在血管内皮细胞中的表达。
[ 中图分类号] 　R96 [ 文献标识码] 　A
Effects of 1-o-Acetylbritannilactone on Cyclo-Oxygenase-2 and Intercellular Adhesion
Molecule-1 Expression in Human Vascular Endothelial Cells
CHEN Ying-Zhu , WEN Jin-Kun , HAN Mei , and ZHANG Di-Qun
(Laboratory of Medical Biotechnology , Institute of Basic Medical Science , Hebei Medical University , Shijiazhuang 050017 , China)
[ KEY WORDS] 　1-o-Acety lbritannilactone;　Vascular Endothelial Cells;　Cyclo-Oxygenase-2;　Intercellular Adhesion
Molecule-1;　Nuclear Factor-κB;　Lipopolysaccharide;　Western Blotting
[ ABSTRACT] 　　 Aim　To investigate the effects of 1-o-acetylbritannilactone(ABL)isolated from Inula Britannica-F on acti-
vation of nuclear factor-κB(NF-κB)and cyclo-oxygenase-2(COX-2)and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)expression
in human vascular endothelial cells(ECV304)treated with lipopolysaccharide(LPS).　　Methods　ICAM-1 and nuclear P65
in protein extracts from ECV304 cells were detected by Western blotting.　COX-2 mRNA was assayed by reverse transcription-
polymerase chain reaction(RT-PCR).　　Results　After ECV304 cells were incubated with 12.5 , 25 , 50μmol/ L ABL for 1 h ,
COX-2 mRNA level in ECV304 cells treated with LPS was reduced by 35.85%, 42.46% and 53.46%, respectively.　Expres-
sion of ICAM-1 was decreased by 9.77%, 40.87% and 46.83%, respectively , compared with control group.　ABL could an-
tagonize the nuclear translocation of P65 , and the increase in nuclear P65 induced by LPS no longer occurred following treatment
with ABL.　　 Conclusions　ABL inhibits COX-2 and ICAM-1 expression in vascular endothelial cells by inhibiting NF-κB acti-
vation.
[收稿日期] 　2004-10-27　　　　[ 修回日期] 　2005-02-15
[基金项目] 　国家自然科学基金(30472167)资助课题
[作者简介] 　陈英珠 ,博士研究生 ,副研究员 ,研究方向为心血管病
分子生物学。通讯作者温进坤 ,医学博士 ,教授 ,博士研究生导师 ,长
期从事心血管病生物化学与分子生物学研究 , 电话为 0311-6265563 ,
E-mail为 WJK@hebmu.edu.cn。韩梅 ,医学博士 ,教授 ,博士研究生导
师 ,长期从事心血管病生物化学与分子生物学研究。
　　旋覆花(Inula Britannica-F)为菊科旋覆花属植
物 ,是具有降气 、消痰 、止呕和抗炎功效的常用中药。
我们在对旋覆花药效物质基础进行研究过程中 ,从
其氯仿抽提物中分离得到一种结构属于苯并呋喃酮
衍生物的单体成分旋覆花内酯(1-o-acetylbritanni-
lactone , ABL),经小鼠扭体 、热板 、甩尾和福尔马林舔
足等实验 ,证实其具有抑制炎性疼痛的作用。我们
以往用体外培养的单核/巨噬细胞研究其作用机制
时发现 , ABL 通过抑制核因子κB(nuclear factor-κB ,
NF-κB)与相应作用位点结合 ,降低环加氧酶 2(cyclo-
oxygenase-2 , COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(induced
nitricoxide synthase , iNOS)基因表达的活性以及前列
腺素 2(prostaglandin 2 , PGE2)和一氧化氮(Nitrogen
monoxide , NO)的合成 ,发挥其抗炎作用[ 1] 。基于慢
性炎症反应以及血管内皮细胞与单核细胞粘附是动
脉粥样硬化发生发展的核心和关键[ 2] ,本研究在证
明 ABL能够抑制单核/巨噬细胞合成和释放炎性因
子的基础上[ 1] ,进一步观察 ABL 对血管内皮细胞促
炎基因 COX-2和细胞间粘附分子 1(intercellular ad-
hesion molecule-1 , ICAM-1)表达及核因子κB 活化的
129CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志 2005年第 13卷第 2期
影响 ,探讨其抗血管内皮细胞炎性反应的效应及作
用靶点。
1　材料与方法
1.1　材料
旋覆花内酯由本课题组分离及鉴定 ,其化学结
构见图 1(Figure 1)。人脐静脉内皮细胞株 ECV304
购自武汉细胞中心。M199培养基购自GIBCO公司;
P65多克隆抗体 、ICAM-1单克隆抗体及发光试剂为
Santa Cruz产品;脂多糖系 Sigma产品;聚合酶链反应
(polymerase chain reaction , PCR)引物由上海生工生
物工程有限公司合成;其余化学及生物化学试剂为
进口或国产分析纯。
图 1.旋覆花内酯的化学结构
Figure 1.Chemical structure of 1-o-acetylbritannilactone
1.2　细胞培养
ECV304细胞置于含 10%新生小牛血清的M199
培养基中于 37℃、5%CO2孵育箱中进行培养 ,细胞
生长至 70%汇合时 ,换成含 2%新生小牛血清的培
养基 ,饥饿培养 24 h使细胞同步于静止期 。分别加
入 0 、12.5 、25和50μmol/L的ABL孵育1 h ,然后各
加入100μg/L 脂多糖继续培养6 、18和24 h后 ,从各
组细胞中分别提取细胞总蛋白 、核蛋白或 RNA。
1.3　MTT法测细胞活力
于96孔板中生长的 ECV304细胞与不同浓度的
ABL孵育 1 h 后 ,加入 100μg/L脂多糖继续培养 24
h 。每孔加入20 μL 5 g/L的 MTT , 37℃孵育 4 h ,弃
去培养基 ,每孔加入 100μL 二甲基亚砜静置10 min ,
用酶标仪于 490 nm波长处测定各组细胞(8个孔)的
光密度。
1.4　Western印迹分析
ECV304细胞总蛋白提取按文献[ 1]方法 ,用 RI-
PA细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl , pH 7.5 , 150
mmol/L NaCl , 1%NP40 , 0.1%SDS , 1 mmol/L ED-
TA ,1 mmol/L NaVO4 ,1 mmol/L PMSF)裂解细胞后 ,离
心分离上清 ,用改良的 Lowry 法测定蛋白含量 。取
60μg 蛋白样品 ,进行 SDS-PAGE分离 ,通过电转移将
蛋白印迹到 PVDF 膜上 ,5%脱脂奶粉封闭膜上的非
特异性位点后 ,依次与 ICAM-1单克隆抗体(1∶200)
和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(1∶10 000)
进行反应 ,化学发光法显色。ECV304细胞核蛋白提
取按照文献[ 1]方法进行。取 40 μg 蛋白样品进行
SDS-PAGE分离 ,经转膜 、封闭后依次与 P65多克隆
抗体(1∶200)和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗
(1∶10 000)进行反应 ,化学发光法显色。
1.5　RNA提取与逆转录 —聚合酶链反应
按异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法[ 3]提取被不同
浓度ABL和脂多糖处理的细胞中的总 RNA ,以 Oligo
(dT)16为引物 ,按照 PE公司Taqman逆转录说明书进
行逆转录后 ,用COX-2上 、下游引物进行PCR。COX-
2上 、下游引物序列分别为 5 -ATT CTT TGC CCA
GCA CTT CA-3 ,5 -TCT TTG ACT GTG GGA GGA TA-
3 ,扩增片段长度为 207 bp ,以GAPDH为内参照。
1.6　统计学方法
实验结果采用 x±s 表示 ,组间资料应用单因素
方差(One way ANOVA)分析 ,各项统计均用 SPSS 10.
0软件在计算机上完成。
2　结 果
2.1　旋覆花内酯对 ECV304细胞活力的影响
用 12.5 、25 和 50 μmol/L 旋覆花内酯处理
ECV304细胞 24 h后 ,以MTT法检测细胞活力 ,与对
照组细胞相比 , 在所检测的浓度范围内 , ABL 对
ECV304细胞活力没有影响(表 1 , Table 1),提示ABL
对细胞没有明显的毒性。
表 1.旋覆花内酯对 ECV304 细胞活力的影响(x±s)
Table 1.Effects of ABL on cells viability of ECV
分　组 旋覆花内酯(μmol/ L)
脂多糖
(100μg/ L) A490
对照组 0 0.179±0.021
实验组 0 100 0.174±0.023
12.5 100 0.175±0.029
25.0 100 0.180±0.033
50.0 100 0.183±0.018
130 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 13 , No 2
2.2　旋覆花内酯抑制环加氧酶 2 mRNA表达
脂多糖(100 μg/L)刺激 ECV304细胞 0 、 6 、 18
和24 h 后 ,用逆转录 —聚合酶链反应均能检测到
COX-2 mRNA表达 。从图 2 (Figure 2)可以看出 ,在
脂多糖刺激前 COX-2基因即有一定的表达活性 ,脂
多糖刺激 18 h其表达活性明显升高(达对照细胞的
140%),24 h表达活性开始下降。在此基础上 ,选择
脂多糖刺激18 h作为观察不同浓度ABL影响 COX-2
mRNA表达的时间点 ,如图 2(Figure 2)所示 ,在脂多
糖刺激细胞前加入 12.5 、 25和 50 μmol/L ABL 均能
抑制脂多糖诱导的 COX-2 mRNA表达 ,3种浓度ABL
处理的细胞其 COX-2 mRNA表达水平与对照细胞相
比 ,分别降低 35.85%、42.46%和 53.46%。50μmol/
L ABL对 COX-2 mRNA表达的抑制作用最强 。
图2.旋覆花内酯对脂多糖诱导的 ECV304细胞中环加氧酶 2
mRNA表达的影响
Figure 2.Effects of 1-o-acetylbritannilactone on COX-2 mRNA
expression in ECV304 treated by LPS
2.3　旋覆花内酯抑制细胞间粘附分子 1表达
Western印迹分析结果显示 ,脂多糖(100 μg/L)
刺激 ECV304细胞 6 h时 , ICAM-1表达明显升高 , 18
h达到高峰 ,达对照组的 6.33倍 , 24 h略有下降 ,但
仍高于基础水平(图 3 , Figure 3)。12.5 、 25和 50
μmol/L ABL均能抑制脂多糖诱导的 ICAM-1表达 ,细
胞被 3种浓度的ABL预处理后 ,其 ICAM-1的表达量
与对照细胞(只用脂多糖刺激的细胞)相比 ,分别降
低 9.77%、 40.87%和 46.83%。以 50 μmol/L 的
ABL抑制效果最为明显(图 4 , Figure 4)。
2.4　旋覆花内酯抑制核因子κB激活
如图 5 (Figure 5)所示 , 未经脂多糖处理的
ECV304细胞核中P65含量较低;脂多糖诱导1 h后 ,
核内 P65显著升高 ,达对照组的 4.24 倍 。加入 50
μmol/L ABL 预孵育 1 h ,脂多糖诱导的P65升高受到
抑制 ,核内 P65水平接近于对照组细胞 。提示 ABL
具有抑制核因子κB激活的作用 。
图 3.脂多糖对 ECV304 细胞间粘附分子 1表达的影响
Figure 3.Effects of LPS on intercellular adhesion molecule-1
protein expression in ECV304
图 4.旋覆花内酯对脂多糖诱导的 ECV304 细胞间粘附分子 1
表达的影响
Figure 4.Effects of 1-o-acetylbritannilactone on intercellular
adhesion molecule-1 expression in ECV304 treated with LPS
图 5.旋覆花内酯对脂多糖诱导的 ECV304 中核因子κB 激活
的影响
Figure 5.Effects of 1-o-acetylbritannilactone on the activation
of NF-КB in ECV304 stimulated with LPS
3　讨 论
旋覆花内酯是我们从中药旋覆花中提取分离的
具有抗炎活性的单体化合物 。前期研究证明 ,该化
合物能有效抑制 RAW 264.7 巨噬细胞合成炎性介
质 NO和 PGE2 ,并发现其作用机制与抑制核转录因
子核因子 κB 活化及 iNOS 和 COX-2 基因表达有
关[ 1] 。慢性炎症反应是动脉粥样硬化 、血管成形术
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后再狭窄等心血管疾病发生发展的重要原因 ,涉及
血管内皮细胞的损伤与激活 、粘附分子的表达以及
内皮细胞与循环白细胞之间的粘附等一系列复杂的
反应过程 ,其中单核/巨噬细胞 、血管内皮细胞合成
与释放炎性介质和粘附分子起着关键作用[ 4 ,5] 。在
动脉粥样硬化斑块中 ICAM-1 的表达明显升高[ 5] 。
在人冠状动脉粥样硬化组织中 ,复合斑块中 COX-2
表达明显高于纤维斑块 ,而在非斑块区和正常冠状
动脉中均不能检测到 COX-2的表达[ 6] 。ABL对单核
/巨噬细胞具有抗炎作用 ,对血管内皮细胞有无抗炎
作用尚不清楚。本文以体外培养的 ECV304细胞为
研究对象 ,用脂多糖作炎症反应刺激因素 ,在证实脂
多糖能激活核因子κB及上调 COX-2和 ICAM-1基因
表达的基础上 ,观察 ABL 对 COX-2 和 ICAM-1 基因
表达及核因子κB激活的影响 。结果表明 ,在所观察
的浓度范围内(12.5 ～ 50 μmol/L),ABL 能剂量依赖
性地抑制脂多糖诱导的 COX-2和 ICAM-1基因表达 ,
在ABL 浓度为 50 μmol/L 时 ,两种基因的表达活性
降低 50%左右。
核因子κB是介导COX-2和 ICAM-1等促炎基因
表达的重要转录因子 ,由 P50和 P65两个亚单位组
成。正常情况下 ,核因子κB 与抑制蛋白 I-κB 相结
合 ,以非活性形式存在于胞质中[ 7] 。在致炎因素作
用下 , I-κB 磷酸化而与核因子κB解离 ,使后者活化
并进入细胞核激活特定基因转录[ 8] 。动脉粥样硬化
斑块核因子кB被激活 ,而正常组织中它的表达量较
低[ 9] 。转染 I-КB-α后 ,兔子主动脉球囊损伤引起的
管腔狭窄可以明显改善[ 10] 。为揭示ABL 抑制 COX-
2和 ICAM-1基因表达是否与影响核因子κB活化有
关 ,我们从被 ABL 和脂多糖处理的 ECV304细胞中
提取核蛋白 ,检查细胞核内 P65 含量的变化。结果
显示 ,ABL 能使脂多糖诱导的细胞核内 P65 的升高
受到抑制 ,即显著抑制脂多糖诱导的核因子κB活化
及核转位。可见 ,ABL对单核/巨噬细胞和血管内皮
细胞均具有明显的抗炎作用 ,其作用机制与抑制核
因子κB活化及下调 COX-2 、ICAM-1和 iNOS 基因表
达有关 。核因子κB及其下游基因 ICAM-1和 COX-2
参与动脉粥样硬化的形成 , ABL 可以抑制其活性 ,
ABL 作为防治心血管病的抗炎药物具有良好的应用
前景。
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(此文编辑　朱雯霞)
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132 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 13 , No 2